Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários
18 de março de 2020
O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.
Este protocolo descreve um método focado em extrair em paralelo as duas populações de células gliais mais abundantes, astrócitos e microglia, de camundongos pós-natais. Nosso método difere de outros protocolos previamente descritos para o isolamento de astrócitos e microglias, pois focamos na obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares na mesma condição, otimizando assim o uso de animais experimentais e melhorando o estudo de papéis relativos para essas células em contextos imunológicos. Este protocolo pode ser útil para investigar melhor os papéis de microglia e astrócito em muitos contextos e doenças no sistema nervoso central, como Alzheimer, Parkinson e infecções, por exemplo, parasitas protozoários ou vírus.
A obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares a partir da mesma extração é desejável avaliar o papel comparativo de cada subconjunto celular contextos imunológicos como infecção ou inflamação. As pessoas devem ter cuidado especialmente durante a remoção cerebral e lavagem de tecido nervoso, mas acredito que com este protocolo e a filmagem, as pessoas não vão lutar. Este protocolo pode ser longo dependendo do número de animais para extrair os cortices, então esteja preparado para passar cerca de quatro horas ou mais.
No primeiro dia, prepare o HBSS puro e o HBSS mais FBS inativados a calor de 10%. Prepare o DMEM F12 suplementado e filtre-o com um filtro de 0,22 mícrons. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.
Coloque camundongos recém-nascidos em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por cinco minutos para anestesia profunda. Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura. Faça um corte sagital com uma tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro.
Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de seis centímetros de diâmetro seco. Usando uma micro espátula, remova a lâmpada olfativa e o cerebelo.
Mova o córtex para outra placa de Petri contendo dois mililitros de HBSS mais 10% FBS. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipette P1000, transfira cada tecido cerebral com HBSS mais 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mililitros. Se necessário, use o HBSS mais 10% FBS para preencher o volume final a dois mililitros.
Lave o tecido cerebral cortado com três mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Repita a lavagem com HBSS mais 10%FBS três vezes adicionais.
Em seguida, lave com três mililitros de HBSS puro três vezes. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Em seguida, adicione três mililitros de trippsina e coloque o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 minutos agitando suavemente os tubos a cada cinco minutos.
Isso digere o tecido coletado. Evite bolhas. Para inativar a trippsina, lave o tecido com três mililitros de HBSS mais 10% FBS e após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o supernatante.
Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, lave o tecido com três mililitros de HBSS puro e repita duas vezes adicionais. Após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenante.
Adicione sete mililitros de HBSS puro e homogeneize o tecido através de passagens sucessivas em pipetas, primeiro com uma pipeta sorológica de 10 mililitros, seguida de uma pipeta de cinco mililitros, e finalmente com uma micropipette P1000. Após a homogeneização, centrifugar os tubos a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com quatro mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo.
Transfira as células para um frasco T75 pré-tratado comercialmente para uma ótima adesão à cultura celular. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para adesão. Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM F12 suplementados ao frasco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas noites.
No terceiro dia, remova sete mililitros de cultura do frasco T75 e adicione sete mililitros de DMEM F12 complementados frescos. Devolva o frasco para a incubadora. No quinto dia, para remover detritos e células não aadeentes, troque todo o meio do frasco T75 com 14 mililitros de DMEM F12 complementados frescos.
Em seguida, a cada 48 horas, remova seis mililitros do supernatante e adicione sete mililitros de meio DMEM F12 fresco até o dia 14 da cultura. No dia 14, depois de remover seis mililitros de supernadante e adicionar sete mililitros de médio DMEM F12 complementado fresco, feche os frascos T75 firmemente com embalagem plástica. Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite para dissociar mecanicamente microglia de astrócitos.
No dia 15, pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, recolher o supernasal e transferi-lo para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina em cada frasco e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius, a fim de desprender os astrócitos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inativar a trippsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar todos os tubos contendo microglia dissociada ou astrócitos a 450 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernaspeso. Resuspend a pelota de microglia em um mililitro de DMEM F12 suplementado e os astrócitos em 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Prossiga para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou em um contador automático de células.
Aplaque as células com DMEM F12 suplementado na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana pré-tratada. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que elas se conectem. No 14º dia, a cultura celular glial sofreu dissociação mecânica.
Observou-se pureza de 89,5% para a população de astrócitos e 96,6% para a população de microglias. Astrócitos e microglia de camundongos C57BL6 foram infectados com T.cruzi Y.Após duas horas, 48 horas e 96 horas, as câmaras foram fixadas com metanol e manchadas com o marcador de nuclease celular DAPI e anti-GFAP. O uso de parasitas geneticamente modificados expressando repórteres fluorescentes ou parasitas rotulados com anticorpos fluorescentes específicos melhorou a microscopia de imunofluorescência, uma vez que são melhor distinguidos do núcleo celular.
Dois exemplos são apresentados aqui. T.gondii RH cepa constitutivamente expressando YFP e T.cruzi Y cepa manchada com anticorpo monoclonal não comercial 2C2 proteína anti-SSP4. É importante lavar cuidadosamente as células para não perder nenhum agregado celular.
Após a infecção por células gliais, outros parâmetros podem ser avaliados, como ELISA para produção de citocinas presentes no supernanato, mancha ocidental para expressão proteica e PCR quantitativo em tempo real para avaliação de transcrição de RNA. Muitas questões relacionadas à função das células gliais, por exemplo, seu metabolismo, resposta imune e biologia celular em si podem ser abordadas e beneficiadas por essa técnica. Todos os parasitas protozoários são capazes de infectar células humanas, bem como células de camundongos culturais, por isso é importante ter cuidado ao lidar com esse parasita.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a extração, cultura e infecção paralelas de astrócitos e micróglias murinos primários a partir de cortices de camundongos recém-nascidos. O método permite aos pesquisadores obter ambos os tipos de células gliais a partir da mesma extração, facilitando estudos comparativos de seus papéis em infecções do sistema nervoso central (SNC), particularmente com parasitas protozoários como Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii. O protocolo inclui etapas para isolamento celular, manutenção da cultura, fenotipagem, infecção e análise das taxas de infecção utilizando microscopia de fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neuroimunologia
- Biologia Celular
- Parasitologia
Contexto
- Os astrócitos e a micrógia são as células gliais mais abundantes no SNC, essenciais para o suporte fisiológico e a homeostase.
- Os dois tipos celulares desempenham papéis significativos na resposta imune a infecções do SNC.
- São necessários métodos aprimorados para o isolamento e estudo dessas células, a fim de compreender melhor suas respostas a patógenos.
- Infecções protozoárias, como as causadas por T. cruzi e T. gondii, podem impactar significativamente a função do SNC.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível e eficiente para a extração e cultura simultâneas de astrócitos e micróglias a partir de cortices de camundongos.
- Permitir estudos comparativos das respostas de células gliais a infecções por protozoários.
- Facilitar análises complementares da função das células gliais durante a infecção.
Métodos Utilizados
- Extração de córtices de camundongos recém-nascidos em condições estéreis.
- Dissociação enzimática e mecânica de tecido cerebral para obtenção de suspensões de células isoladas.
- Cultura in vitro de células gliais com substituição periódica do meio por 14 dias.
- Dissociação mecânica para separar micróglias de astrócitos.
- Fenotipagem de populações celulares por citometria de fluxo.
- Infecção de células cultivadas com T. cruzi e T. gondii parasitas.
- Avaliação das taxas de infecção utilizando microscopia de fluorescência com parasitas modificados geneticamente ou marcados com anticorpos.
Resultados Principais
- O protocolo produz populações de alta pureza: aproximadamente 89,5% de astrócitos e 96,6% de micróglias.
- Ambos os tipos celulares podem ser eficientemente infectados por parasitas protozoários in vitro.
- A microscopia de fluorescência permite a visualização clara e a quantificação das taxas de infecção em múltiplos pontos temporais.
- O método permite análises adicionais, como ELISA, Western blot e qPCR, para estudos funcionais.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem simples, econômica e eficiente para o isolamento e estudo de astrócitos e micróglias murinos primários.
- Permite a comparação direta das respostas das células gliais a infecções no SNC.
- A técnica abre novas perspectivas para pesquisas neuroimunológicas sobre a função das células gliais durante infecções e doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D biofarmacêutica isolem simultaneamente astrócitos primários e micróglias de cortices murinos, apoiando a análise comparativa de células gliais em modelos de infecção do SNC. Ao otimizar o uso de animais e fornecer um fluxo de trabalho padronizado para fenotipagem e infecção, o método aprimora a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de neuroimunologia e doenças infecciosas. A abordagem apoia esforços iniciais de descoberta focados no controle de patógenos mediado por glia e nas interações entre hospedeiro e patógeno.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as respostas das células gliais a parasitas protozoários como T. cruzi e T. gondii, elucidando os mecanismos patogênicos em infecções do sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a comparação paralela das taxas de infecção de astrócitos e micróglias e do controle dos parasitas.
- Confiabilidade Preditiva: Facilita a triagem fenotípica das respostas imunes mediadas por células gliais, reduzindo os riscos associados a alvos em programas de doenças neurodegenerativas e infecciosas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera populações purificadas de células gliais com pureza superior a 89% de astrócitos e superior a 96% de micróglias, permitindo ensaios de infecção reprodutíveis.
- Saídas quantitativas: Permite a quantificação da taxa de infecção por microscopia de fluorescência em múltiplos pontos temporais, para análise dependente de dose e tempo.
- Escalabilidade: Utiliza equipamentos e reagentes de cultura celular padrão, permitindo adaptação a formatos de múltiplas poças para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Fornece um modelo de células gliais murinas para estudar infecções protozoárias relevantes para o sistema nervoso central, com relevância translacional para condições neuroinflamatórias humanas.
- Desvio Mecanístico de Riscos: Permite a avaliação da contribuição das células gliais na eliminação do patógeno, apoiando a descoberta de biomarcadores e a análise de vias moleculares.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da infecção de 2 a 96 horas, alinhando-se às janelas de avaliação pré-clínica de candidatos terapêuticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer células gliais validadas para modelagem de infecção, desenvolvimento de ensaios e estudos mecanicistas antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os papéis específicos das células gliais na invasão e replicação de patógenos no sistema nervoso central.
- Triagem: Fornece células gliais padronizadas e fenotipadas, prontas para ensaios de infecção com parasitas marcados por fluorescência ou anticorpos.
- Análises: Permite a medição quantitativa da taxa de infecção por meio de microscopia de fluorescência e análise subsequente da expressão de citocinas, proteínas e RNA.
- Pesquisa Translacional: Relaciona as respostas à infecção em células gliais com mecanismos neuroimunológicos mais amplos, relevantes para modelos pré-clínicos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento de células gliais aplicável em programas de doenças virais, parasitárias e neurodegenerativas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na função das células gliais durante infecções, permitindo a comparação direta entre astrócitos e micróglias do mesmo animal.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de um protocolo unificado de extração que minimiza a variabilidade entre animais.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer dados preditivos precoces sobre o controle mediado por células gliais de patógenos em modelos de infecção no sistema nervoso central.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base na resposta das células gliais ao desafio com protozoários.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação tecidual asséptica, digestão enzimática e técnicas de dissociação mecânica.
- Depende do acesso a centrífugas, incubadoras, agitadores orbitais e microscopia de fluorescência para leitura de infecção.
- Necessita padronização das trocas de meio, etapas de lavagem e tempo de dissociação entre diferentes lotes para obter rendimentos consistentes de gliócitos.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o protocolo para outros subtipos de gliócitos ou modelos de doenças além da infecção por protozoários.
- É limitado pelo período de cultura de 14 dias e pelo passo de dissociação mecânica, o que pode afetar a escalabilidade para aplicações de alto rendimento.
