Name: Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a isolar astrócitos e microglia primários de camundongos recém-nascidos para estudar infecções por parasitas protozoários no SNC. Este protocolo permite obter ambos os tipos celulares em uma única extração.

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Agradecemos ao professor Dr. Renato A. Mortara, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo mAb 2C2 anti-Ssp-4. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, na justiça, na obra). subvenção 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código financeiro 001). M.P.A. recebe bolsa do CNPq, A.L.O.P. recebe bolsa da CAPES, e I.S.F e L.Z.M.F.B. recebem bolsa da FAPESP.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo camundongos foram realizados de acordo com a Lei Nacional (11.794/2008) e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso animal (IACUC) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
1. Extração, Manutenção e Dissociação de Células Gliais
NOTA: O número de camundongos utilizados para a extração de células gliais depende da quantidade de células necessárias para realizar os experimentos desejados. Neste protocolo, foram obtidos um total de 2,7 x 107 astrócitos e 4 x 106 microglias de seis camundongos c57BL/6 neonatais. Todos os procedimentos foram realizados em condições estéreis em um gabinete de biossegurança classe II.
<ol><li>Dia 1º
	<ol>
<li>Prepare a solução de sal balanceado de Hank puro (HBSS) e HBSS + 10% do soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Prepare o Suplemento Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicilina + 0,09 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7,2) e filtrar com um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). NOTA: Todas as mídias de cultura devem ser armazenadas a 4 °C, mas é necessário pré-aquecê-las a 37 °C por 20 min antes de iniciar o experimento.</li>
		<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos (tesoura, espátula e pinça) em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.</li>
		<li>Coloque os camundongos recém-nascidos (até 3 dias de idade) em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por 5 min para anestesia profunda.</li>
		<li>Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura.</li>
		<li>Faça corte sagital (posterior a anterior) com tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro. Separe o crânio do cérebro usando pinças. Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral.</li>
		<li>Coloque o cérebro em uma placa de Petri seca (6 cm de diâmetro). Remova a lâmpada olfativa e o cerebelo usando uma micro espátula. Mova o córtex para outra placa de Petri (6 cm de diâmetro) contendo HBSS + 10% FBS (placa de 2 mL/Petri).</li>
		<li>Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipete p1000 transfira cada tecido cerebral com HBSS + 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mL. Certifique-se de que o volume final é de 2 mL/tubo. Caso assim, completo com HBSS + 10% FBS. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Nesse caso, tubos cônicos com tecido CNS devem ser colocados no gelo até 1h.</li>
		<li>Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS + 10% FBS (por tubo) e após a decantação. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes. NOTA: Esta etapa visa remover os detritos e recuperar o tecido extraído.</li>
		<li>Lave o tecido cerebral cortado com 3 mL de HBSS puro (por tubo) e após a decantação, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes. NOTA: Esta etapa visa remover o soro restante das lavadoras anteriores, pois as células serão trippsinizadas na próxima etapa.</li>
		<li>Adicione 3 mL de tripsina por tubo e coloque em banho-maria a 37 °C por 30 min, agitando suavemente os tubos a cada 5 min. Evite bolhas invertendo ou misturando abruptamente os tubos. NOTA: Esta etapa visa digerir o tecido coletado.</li>
		<li>Para inativar a tripsina, lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS + 10% FBS e, após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 3 vezes.</li>
		<li>Lave o tecido com 3 mL por tubo de HBSS puro e remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo 2 vezes.</li>
		<li>Adicionar 7 mL por tubo de HBSS puro e homogeneizar o tecido através de sucessivas passagens em pipetas: primeiro com a pipeta sorológica de 10 mL, seguido pelo 5 mL e, finalmente, com a micropipette p1000.</li>
		<li>Após a homogeneização, os tubos de centrífuga a 450 x g para 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 4 mL de HBSS + 10% FBS por tubo.</li>
		<li>Transferir células para um frasco T-75 pré-tratado para adesão ideal da cultura celular (ver Tabela de Materiais). NOTA: Processe tecido de cada animal por frasco.</li>
		<li>Coloque o frasco na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min para adesão.</li>
		<li>Adicione 10 mL de DMEM/F12 suplementado por frasco e incubar a 37 °C e 5% CO2. NOTA: O volume final é de 14 mL por frasco.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3.
	<ol>
<li>Remova 7 mL de meio de cultura do frasco T-75 e adicione 7 mL de DMEM/F12 fresco. NOTA: Os frascos conterão muitos detritos celulares e uma aparência nebulosa.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 5
	<ol>
<li>Remova todo o meio do frasco T-75 e adicione 14 mL de DMEM/F12 recém-suplementado. NOTA: O meio é substituído dos frascos para remover detritos e células não aderentes.</li>
		<li>Após cada 48 h, remova 6 mL do sobrenadante e adicione 7 mL de meio DMEM/F12 fresco até o dia 14 de cultura.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 14.
	<ol>
<li>Depois de remover 6 mL do sobrenadante e adicionar 7 mL de meio DMEM/F12 fresco, feche bem os frascos T-75.</li>
		<li>Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 rpm e 37 °C durante a noite para dissociar mecanicamente a microglia dos astrócitos.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 15.
	<ol><li>Pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, colete o sobrenadante (contendo microglia) e transfira para um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Em seguida, adicione 4 mL de tripsina em cada frasco e incubar por 5 min a 37 °C, a fim de separar os astrócitos.</li>
		<li>Adicione 5 mL por frasco de DMEM/F12 suplementado para inativar a tripsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Centrifugação de todos os tubos contendo microglia dissociada e astrócitos a 450 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de microglia em 1 mL e os astrócitos em 10 mL de DMEM/F12 suplementado.</li>
		<li>Vá para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou um contador automático de células. Emplacaas as células com DMEM/F12 suplementada na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana apropriada (pré-tratada para a fixação celular ideal; ver Tabela de Materiais). Incubar células a 37 °C e 5% CO2 por 24 h para permitir que elas se conectem. NOTA: Reserve 1,5 x106 de cada população celular para confirmar sua pureza por citometria de fluxo.</li>
		<li>Realizar uma análise citométrica de fluxo para verificar a pureza das populações celulares. NOTA: Consideramos microglia CD11b+/CD45+/GFAP- e astrócitos CD11b-/CD45-/GFAP+. A coloração iba1 e tmem119 podem ser consideradas para caracterizar totalmente a microglia22.</li>
		<li>Adicione um FMO (Fluorescência Menos Um)23 e uma amostra não manchada para cada população celular (astrócitos e microglia) como controles do ensaio de citometria de fluxo.</li>
		<li>Para cada população celular, reserve 5 x 105 células para cada amostra manchada e não manchada. Para FMO, reserve outros dois tubos de microglia contendo 2,5 x 105 células cada e também reserve outro tubo de 5 x 105 astrócitos. NOTA: Uma vez que os números de microglia podem ser um fator limitante, é possível usar menos células para controles não-manchados e FMO.</li>
		<li>Centrifugar todos os microtubos a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 500 μL/microtubo de tampão FACS (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7.2).</li>
		<li>Centrifugação de todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) diluído no tampão FACS. Incubar por 10 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 500 μL/microtubo de tampão FACS em todos os microtubos e centrífugas a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspensão de tubos de coloração de microglia e também tubo fmo astrócito com 50 μL/microtubo de marcadores de superfície misturam: anti-CD45 (PE, clone 30-F11) e anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (ambos diluídos em 1: 100 no tampão FACS).</li>
		<li>Para células não manchadas, resuspenda com o mesmo volume de buffer FACS. Para microglia FMO, incubar cada tubo de microglia com anti-CD45 ou anti-CD11b. Incubar todas as amostras a 4 °C por 20 min no escuro.</li>
		<li>Adicione 500 μL de tampão FACS por microtubo. Centrifugação a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota com 100 μL/microtubo de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) por 20 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Adicione 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização 1x (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 5 min no escuro.</li>
		<li>Centrifugar todos os microtubos a 450 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante. Resuspender os tubos de coloração de astrocitos e microglia e também tubos de microglia FMO com 50 μL/microtubo de anticorpo intracelular anti-GFAP (APC, clone GA5) em uma diluição de 1:100 em tampão de permeabilização de 1x. Para células não manchadas e FMO astrócito, resuspenda as células com o mesmo volume de tampão FACS. Incubar todas as amostras a 4 °C por 30 min no escuro.</li>
		<li>Lave todos os tubos adicionando 500 μL/microtubo de tampão de permeabilização de 1x. Centrifugar todos os microtubos a 450 x g,por 5 min a 4 °C. Ressuspensão de cada microtubo em 200 μL de tampão FACS. Adquira 1 x 105 eventos/amostra no citómetro de fluxo.</li>
		<li>Para análise, as células devem ser fechadas primeiro em CD11b x CD45 e, em seguida, no histograma GFAP. NOTA: Os controles não manchados e FMO são úteis para determinar os portões.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Infecção e Avaliação das Taxas de Infecção
<ol><li>Infecção de células gliais com T. gondii
	<ol>
<li>Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Infectar cada população celular com taquizoitas de T. cepa de rh gondii expressando proteína fluorescente amarela (YFP) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1:1 (parasita:célula) diluída em 200 μL/poço de RPMI suplementado (3% FBS + 0,16 mM Penicilina + 0,18 mM Estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM bicarbonato de sódio, pH 7.2) (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C e 5% CO2 por 48 h.</li>
		<li>Em seguida, descarte o sobrenadante e fixe as células adicionando 100 μL/poço de 1% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS a 4 °C por 24 horas.</li>
		<li>Substitua o PFA por 100 μL/poço de PBS em pH 7.2.</li>
		<li>Remova cuidadosamente os núcleos das células de sobrenadante e de coloração, pipetando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min de temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2) e analise-a por microscopia de fluorescência.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção de células gliais com T. cruzi
	<ol>
<li>Placa 3 x 104 microglia ou astrócitos com DMEM/F12 suplementado a 37 °C e 5% CO2 para 24 h em uma placa plana pré-tratada de 96 poços (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para cada ponto de infecção, use uma placa diferente.</li>
		<li>Infectar as células gliais com trippomastigotes da cepa T. cruzi Y em um MOI de 5:1 (parasitas:células) diluídos em 200 μL/poço de RPMI suplementado e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 2 h. NOTA: Este passo é importante para a invasão celular pelo parasita.</li>
		<li>Remova todo o sobrenadante e lave os poços adicionando 200 μL/poço de RPMI suplementado para remover todos os parasitas extracelulares. Remova o sobrenadante e adicione 200 μL/poço de RPMI recém-suplementado. NOTA: Esta etapa pretende remover todos os parasitas que não invadiram as células aderentes.</li>
		<li>Incubar células infectadas por 2h, 48h e 96 h para avaliar a replicação de T. cruzi em células gliais11.</li>
		<li>Após cada ponto de tempo, remova o sobrenadante e fixar as células com 100 μL/poço de metanol por 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, substitua o metanol por 100 μL/poço de PBS (pH 7.2).</li>
		<li>Após a fixação, prepare as células para o ensaio de imunofluorescência da seguinte forma.<ol>
<li>Para evitar a autofluorescência, trate as células com 100 μL/poço de 50 mM NH4Cl diluído em PBS (pH 8.0) por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-a imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).</li>
			<li>Em seguida, permeabilize as células adicionando 100 μL/poço de 0,5% Triton diluído em PBS por 15 min. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).</li>
			<li>Em seguida, incubar a cultura celular com 100 μL/poço de solução de bloqueio (5% leite sem gordura + 2% BSA diluído em PBS [pH 7.2]) para 1 h à temperatura ambiente. Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes).</li>
			<li>Para colorir amastigotos, incubar com 30 μL/poço de anticorpo monoclonal não comercial (mAb) 2C2 proteína anti-Ssp-4 (1:200) diluída em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.</li>
			<li>Lave as células adicionando 100 μL/poço de PBS e remova-as imediatamente (repita esta etapa 3 vezes). Incubar a placa com 30 μL/poço de anticorpo anti-rato secundário (1:500) diluído em PBS por 1 h à temperatura ambiente. NOTA: A proteína anti-Ssp-4 mAb 2C2 não comercial foi um presente gentil do Prof. Dr. Renato A. Mortara do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo.</li>
			<li>Remova cuidadosamente os núcleos de sobrenadante e mancha adicionando 50 μL/poço de DAPI (5 mg/mL) diluído em PBS pH 7.2 (1:1.000) por 1 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
			<li>Substitua a solução de coloração DAPI por 100 μL/poço de PBS pH 7.2 e analise-a por microscopia de fluorescência.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

A importância de estudar funções isoladas de células gliais em contextos biológicos distintos vem se expandindo nas últimas duas décadas. Compreender o SNC além dos neurônios ainda é um campo crescente na biologia celular, especialmente infecções ou condições inflamatórias8,9,24. As células gliais são cruciais não apenas para o suporte físico dos neurônios (como era conhecido anteriormente), mas também em muitas outras situações...

O SNC é composto principalmente por neurônios e células gliais1,2,3. Microglia e astrócitos são as células glia mais abundantes no SNC. Microglia, o macrófago residente, é a célula de glia imunocompetente e fagocítica no CNS3,4, enquanto os astrócitos são responsáveis pela manutenção da homeostase e exercem funções de apoio5.
Apesar de as células gliais serem conhecidas por serem conhecidas por serem responsáveis pelo apoio e proteção dos neurônios6,7, funções emergentes dessas células foram descritas na literatura recente, incluindo suas respostas às infecções8,9,10,11. Assim, há um empurrão para desenvolver métodos para isolar essas células gliais para entender suas funções individualmente.
Existem alguns modelos alternativos para estudar células gliais em vez de culturas primárias, como linhagens celulares imortalizadas e modelos in vivo. No entanto, as células imortalizadas são mais propensas a sofrer deriva genética e alterações morfológicas, enquanto estudos in vivo impõem condições limitadas de manipulação. Por outro lado, as culturas primárias são fáceis de manusear, se assemelham melhor às células in vivo e também nos permitem controlar fatores experimentais12,13. Aqui, descrevemos orientações sobre como extrair, manter e dissociar os astrócitos murina e as células primárias de microglia no mesmo protocolo. Além disso, também fornecemos exemplos de como trabalhar com a infecção por protozoários nessas culturas.
As células CNS extraídas de camundongos neonatais (até 3 dias de idade) foram cultivadas durante 14 dias em meios diferenciais que permitem o crescimento preferencial de astrócitos e microglias. Uma vez que a microglia está acima dos astrócitos anexados, as populações celulares foram mecanicamente dissociadas em uma incubadora orbital. Em seguida, coletamos todo o sobrenadante contendo microglia e adicionamos tripsina para desapegar os astrócitos. As células gliais isoladas foram avaliadas fenotipicamente por citometria de fluxo e banhadas de acordo com o experimento desejado.
Também fornecemos exemplos de como infectar essas microglias isoladas e astrócitos com parasitas protozoários. T. gondii é um protozoário altamente neurotrópico responsável pela toxoplasmose14, enquanto T. cruzi é responsável pela doença de Chagas que pode levar ao desenvolvimento de distúrbios neurológicos na CNS15,16. Além disso, também foi relatado que a infecção por T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 foram a causa presumida de morte em pacientes imunocomprometidos. Portanto, a elucidação do papel imunológico das células gliais do SNC no controle das infecções por protozoários é de grande importância.

<table><tbody><tr><td>70% de etanol</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea</td><td>Cat: 2231</td><td>Esterilizar</td></tr><tr><td>75 cm2 Frasco</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>96 poços placa de cultura de células</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>Remova o anticorpo anti-GFAP de autofluorescência</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>Filtro superior de frasco antidoby de imunofluorescência</td></tr><tr><td>0,22 &mu; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>Filtro de meio de cultura</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS Preparação do tampão</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>Anticorpo de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>Anticorpo de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de</td> centrifugação <td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Gabinete de</td></tr><tr><td>biossegurança de classe II</td> de centrifugação <td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Armário de biossegurança para procedimentos estéreis</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific</td><td>Modelo: 3110</td><td>Manutenção de células primárias</td></tr><tr><td>Tubos cônicos 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Tubos cônicos 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>Imunofluorescência antidoby</td></tr><tr><td>Câmera de microscópio digital</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>Capturar imagens no microscópio</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: E9884</td><td>FACS Preparação de tampão</td></tr><tr><td>F12 Mistura de nutrientes</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Citômetro de fluxo</td><td>indisponível</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>LGC Biotecnologia</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>Suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Flow Jo (software)</td><td>Flow Jo</td><td>Versão: Flow Jo_9.9.4</td><td>Análise de dados</td></tr><tr><td>Luz intensa de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>Fonte de fluorescência</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Anticorpo de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Cabra - IgG anti-rato (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>Imunofluorescência antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Fixação de células para Citometria de Fluxo</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Modelo: ECLIPSE TS100</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>Anestésico inalado</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Synth</td><td>Cat: 01A1085.01.BJ</td><td>Fixação para Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td>ABC inoxidável</td> Material <td>cirúrgico</td><td>indisponível</td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>Não comercial</td><td>Não comercial</td><td>Imunofluorescência antidoby</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Reagentes de pipeta</td></tr><tr><td>Software NIS Elements Nikon</td><td></td><td>Versão 4.0</td><td>Adquirir e analisar imagens</td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>Solução de bloqueio para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Incubadora Orbital Shaker</td><td>ThermoScientific</td><td>Modelo: 481 Cat: 11</td><td>Dissociar micróglia de astrócitos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P6148</td><td>Fixação para Imunofluorescência</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Não comercial</td><td>Não comercial</td><td>Tampão neutro</td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P-7794</td><td>Suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Tampão de permeabilização (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>Permeabilização celular para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm x 15 mm (Descartável, estéril)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8 Medidor de</td> pH <td>de material plástico</td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Calibrar solução de pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>ABC inoxidável</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Pipeta monocanal (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>Reagentes de pipeta</td></tr><tr><td>simples Pipeta de canal (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>Reagentes de pipeta</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>Suplemento de meio de cultura de</td></tr><tr><td>células Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>Suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>Permeabilização para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>Pinça de enzima digestiva</td></tr><tr><td></td><td>ABC inoxidável</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Novatecnica</td><td>Modelo: 09020095</td><td>Digerir tecido a 37 &deg; C com tripsina</td></tr></tbody></table>

isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrócitos e microglia são as células gliais mais abundantes. São responsáveis pelo apoio fisiológico e manutenção da homeostase no sistema nervoso central (SNC). As evidências crescentes de seu envolvimento no controle de doenças infecciosas justificam o interesse emergente no aprimoramento de metodologias para isolar astrócitos primários e microglia, a fim de avaliar suas respostas às infecções que afetam o SNC. Considerando o impacto da infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi)e Toxoplasma gondii (T. gondii)no CNS, aqui fornecemos um método para extrair, manter, dissociar e infectar astrócitos de murina e células de microglia com parasitas protozoários. As células extraídas de cortices recém-nascidos são mantidas in vitro por 14 dias com substituição periódica diferencial da mídia. Astrócitos e microglias são obtidos a partir do mesmo protocolo de extração por dissociação mecânica. Após a fenotipagem por citometria de fluxo, as células são infectadas com protozoários parasitas. A taxa de infecção é determinada por microscopia de fluorescência em diferentes pontos de tempo, permitindo assim a avaliação da capacidade diferencial das células gliais para controlar a invasão e a replicação do protozoário. Essas técnicas representam métodos simples, baratos e eficientes para estudar as respostas dos astrócitos e microglia às infecções, abrindo o campo para análises neuroimunologia suplementares.

No14º dia, a cultura das células gliais (Figura 1A) sofreu dissociação mecânica. As populações de células isoladas foram analisadas por citometria de fluxo segundo marcadores CD11b, CD45 e GFAP. Observou-se uma pureza de 89,5% para a população astrócida e de 96,6% para a população de microglias (Figura 1B). Após o isolamento, as células foram banhadas em uma placa plana de 96 poços e após 24 h estavam prontas para ser...

O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Este protocolo descreve um método focado em extrair em paralelo as duas populações de células gliais mais abundantes, astrócitos e microglia, de camundongos pós-natais. Nosso método difere de outros protocolos previamente descritos para o isolamento de astrócitos e microglias, pois focamos na obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares na mesma condição, otimizando assim o uso de animais experimentais e melhorando o estudo de papéis relativos para essas células em contextos imunológicos. Este protocolo pode ser útil para investigar melhor os papéis de microglia e astrócito em muitos contextos e doenças no sistema nervoso central, como Alzheimer, Parkinson e infecções, por exemplo, parasitas protozoários ou vírus.A obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares a partir da mesma extração é desejável avaliar o papel comparativo de cada subconjunto celular contextos imunológicos como infecção ou inflamação. As pessoas devem ter cuidado especialmente durante a remoção cerebral e lavagem de tecido nervoso, mas acredito que com este protocolo e a filmagem, as pessoas não vão lutar. Este protocolo pode ser longo dependendo do número de animais para extrair os cortices, então esteja preparado para passar cerca de quatro horas ou mais.No primeiro dia, prepare o HBSS puro e o HBSS mais FBS inativados a calor de 10%. Prepare o DMEM F12 suplementado e filtre-o com um filtro de 0,22 mícrons. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.Coloque camundongos recém-nascidos em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por cinco minutos para anestesia profunda. Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura. Faça um corte sagital com uma tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro.Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de seis centímetros de diâmetro seco. Usando uma micro espátula, remova a lâmpada olfativa e o cerebelo.Mova o córtex para outra placa de Petri contendo dois mililitros de HBSS mais 10% FBS. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipette P1000, transfira cada tecido cerebral com HBSS mais 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mililitros. Se necessário, use o HBSS mais 10% FBS para preencher o volume final a dois mililitros.Lave o tecido cerebral cortado com três mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Repita a lavagem com HBSS mais 10%FBS três vezes adicionais.Em seguida, lave com três mililitros de HBSS puro três vezes. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Em seguida, adicione três mililitros de trippsina e coloque o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 minutos agitando suavemente os tubos a cada cinco minutos.Isso digere o tecido coletado. Evite bolhas. Para inativar a trippsina, lave o tecido com três mililitros de HBSS mais 10% FBS e após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o supernatante.Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, lave o tecido com três mililitros de HBSS puro e repita duas vezes adicionais. Após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenante.Adicione sete mililitros de HBSS puro e homogeneize o tecido através de passagens sucessivas em pipetas, primeiro com uma pipeta sorológica de 10 mililitros, seguida de uma pipeta de cinco mililitros, e finalmente com uma micropipette P1000. Após a homogeneização, centrifugar os tubos a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com quatro mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo.Transfira as células para um frasco T75 pré-tratado comercialmente para uma ótima adesão à cultura celular. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para adesão. Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM F12 suplementados ao frasco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas noites.No terceiro dia, remova sete mililitros de cultura do frasco T75 e adicione sete mililitros de DMEM F12 complementados frescos. Devolva o frasco para a incubadora. No quinto dia, para remover detritos e células não aadeentes, troque todo o meio do frasco T75 com 14 mililitros de DMEM F12 complementados frescos.Em seguida, a cada 48 horas, remova seis mililitros do supernatante e adicione sete mililitros de meio DMEM F12 fresco até o dia 14 da cultura. No dia 14, depois de remover seis mililitros de supernadante e adicionar sete mililitros de médio DMEM F12 complementado fresco, feche os frascos T75 firmemente com embalagem plástica. Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite para dissociar mecanicamente microglia de astrócitos.No dia 15, pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, recolher o supernasal e transferi-lo para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina em cada frasco e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius, a fim de desprender os astrócitos.Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inativar a trippsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar todos os tubos contendo microglia dissociada ou astrócitos a 450 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o supernaspeso. Resuspend a pelota de microglia em um mililitro de DMEM F12 suplementado e os astrócitos em 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Prossiga para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou em um contador automático de células.Aplaque as células com DMEM F12 suplementado na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana pré-tratada. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que elas se conectem. No 14º dia, a cultura celular glial sofreu dissociação mecânica.Observou-se pureza de 89,5% para a população de astrócitos e 96,6% para a população de microglias. Astrócitos e microglia de camundongos C57BL6 foram infectados com T.cruzi Y.Após duas horas, 48 horas e 96 horas, as câmaras foram fixadas com metanol e manchadas com o marcador de nuclease celular DAPI e anti-GFAP. O uso de parasitas geneticamente modificados expressando repórteres fluorescentes ou parasitas rotulados com anticorpos fluorescentes específicos melhorou a microscopia de imunofluorescência, uma vez que são melhor distinguidos do núcleo celular.Dois exemplos são apresentados aqui. T.gondii RH cepa constitutivamente expressando YFP e T.cruzi Y cepa manchada com anticorpo monoclonal não comercial 2C2 proteína anti-SSP4. É importante lavar cuidadosamente as células para não perder nenhum agregado celular.Após a infecção por células gliais, outros parâmetros podem ser avaliados, como ELISA para produção de citocinas presentes no supernanato, mancha ocidental para expressão proteica e PCR quantitativo em tempo real para avaliação de transcrição de RNA. Muitas questões relacionadas à função das células gliais, por exemplo, seu metabolismo, resposta imune e biologia celular em si podem ser abordadas e beneficiadas por essa técnica. Todos os parasitas protozoários são capazes de infectar células humanas, bem como células de camundongos culturais, por isso é importante ter cuidado ao lidar com esse parasita.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Este estudo descreve os procedimentos de criação de um axônio neuronal e romance (astro) glia plataforma de co-cultura. Neste sistema de co-cultura, a manipulação da interacção directa entre um único axónio (e única célula glial) torna-se possível, permitindo a análise mecanicista do neurónio mútuo de sinalização gliais.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do...

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

As células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) têm propriedades imunomoduladoras potentes, úteis para o tratamento de doenças associadas à inflamação. Demonstramos como isolar e cultivar AdMSCs murinas e glia mista primária, estimular AdMSCs para regular positivamente genes anti-inflamatórios e fatores de crescimento, avaliar a migração de AdMSCs e co-cultivar AdMSCs com glia primária mista infectada por príons.

Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Aprenda a isolar astrócitos e microglia primários de camundongos recém-nascidos para estudar infecções por parasitas protozoários no SNC. Este protocolo permite obter ambos os tipos celulares em uma única extração.

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

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