Name: Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a monitorar metástase de câncer de mama em tempo real usando ensaios de veia de cauda e imagens in vivo. Este método permite quantificar colonização metastática e carga tumoral nos pulmões de forma não invasiva.

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Agradecemos emily norton para ajudar com infecções virais e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também Ryan Kanai para ajudar a adquirir imagens dos pulmões e Kate E. Tubbesing para ajudar com a análise de imagem das metástases verdes nos pulmões. Agradecemos ao pessoal do centro de investigação animal pelo seu apoio e pela assistência na preparação deste vídeo. Este trabalho foi apoiado por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).

Os autores não têm nada a divulgar.

Etapas críticas do método É fundamental otimizar o número de células injetadas (passo 3) para uma determinada linha celular e tensão do mouse, pois isso pode influenciar muito o número de metástases que se formam e a duração do experimento. Se muitas células são injetadas ou as metástases crescem por muito tempo, as metástases podem ser difíceis de contar tornando os efeitos da manipulação genética difíceis de avaliar. No entanto, se muito poucas células são injetadas, poucas ou nenhuma metástases pod...

O câncer continua a ser a segunda principal causa de morte em todo o mundo1 e metástase é responsável pela maioria dessas mortes2,3. No entanto, uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares que regem a colonização metastática e o crescimento subsequente tem dificultado o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a doença metastática. A identificação de novos alvos terapêuticos requer um ensaio para testar como a expressão ou função perturbada de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Embora os modelos de mouse autrátecos tenham suas vantagens, eles são demorados e caros de gerar, tornando-os mais adequados para a validação de destino em vez de descoberta de destino. Os sistemas de modelos de transplante em que o gene candidato é perturbado nas células cancerosas in vitro e, em seguida, os efeitos sobre o potencial metastático são avaliados in vivo, são menos caros e de maior rendimento do que os modelos autótos. Além disso, os vetores virais para entrega estável de RNAi, CRISPR/CAS9 e transgenes estão amplamente disponíveis, tornando relativamente fácil perturbar praticamente qualquer gene ou genes de interesse em linhas de células cancerosas. Esta abordagem também pode ser usada para analisar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento em linhas de células cancerosas humanas, transplantando as células em camundongos imunocomprometidos ou humanizados.
Os dois tipos de ensaios utilizados para testar a formação da metástase por células cancerosas transplantadas in vivo são ensaios de metástase espontânea e ensaios de metástase experimental. Em ensaios metástase espontânea4,5, as células cancerosas são injetadas em camundongos, autorizados a formar um tumor primário, e, em seguida, a formação metástase espontânea e crescimento subseqüente são ensaios. A força deste modelo é que as células devem completar todas as etapas do processo metastático, a fim de formar tumores metastáticos. No entanto, muitas linhas de células cancerosas não metástase eficientemente em modelos de metástase espontânea, e qualquer manipulação das células que impacta o crescimento do tumor primário pode confundir os resultados do ensaio metástase. Ensaios experimentais de metástase, em que as células cancerosas são injetadas diretamente em circulação, são usados para evitar essas armadilhas. Os ensaios experimentais comuns da metástase incluem a injeção da veia da cauda6,7,8 (e demonstrado aqui), injeção intracardiac9,e injeção da veia do portal10.
O objetivo do protocolo apresentado aqui é fornecer um ensaio de metástase experimental in vivo que permita que um pesquisador monitore a formação e o crescimento da metástase em tempo real, bem como quantificar o número e o tamanho da metástase do ponto final nos pulmões do mesmo rato. Para isso, a tradicional metástase experimental da veia da cauda conta6,7,8 são combinadas com imagens de animais vivos, utilizando um dispositivo de imagem in vivo9,11,12,13,14. As células tumorais expressando de forma evigorada tanto a luciferase quanto uma proteína fluorescente são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda e, em seguida, o dispositivo de imagem in vivo é usado para medir mudanças na carga metastática nos pulmões ao longo do tempo (Figura 1). No entanto, o dispositivo de imagem animal vivo in vivo não pode distinguir ou medir o tamanho das metástases individuais. Assim, no final do experimento, um estreoscópio fluorescente é usado para contar o número e medir o tamanho das metástases fluorescentes nos pulmões sem a necessidade de secção e histologia ou imunohistoquímica (Figura 1). Este protocolo pode ser usado para testar como alterar a expressão ou função de um gene candidato influencia a formação e o crescimento da metástase. Potenciais compostos terapêuticos, como pequenas moléculas ou anticorpos de bloqueio de função também podem ser testados.
Para demonstrar essa abordagem, primeiro realizamos um experimento de prova de conceito no qual o fator essencial de replicação, a proteína de replicação A3 (RPA3) é derrubado em células metastáticas de câncer de mama de camundongos. Nós mostramos que os ratos injetados com células rpa3 knockdown têm significativamente menos carga metastática em cada ponto de tempo em comparação com ratos injetados com células de controle. A análise dos pulmões contendo metástasidade mostra que essa redução da carga metastática é o resultado de uma colonização metastática significativamente reduzida e crescimento prejudicado das metástases que se formam. Para demonstrar ainda mais essa técnica, testamos se a queda sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) prejudica a colonização metastática ou o crescimento subsequente. YAP e TAZ são dois co-ativadores transcricionais relacionados que são os efetores críticos a jusante do Caminho do Hipopótamo. Nós15,16 e outros implicamos YAP e TAZ na metástase (revista em17,18,19), sugerindo que essas proteínas são bons alvos terapêuticos. Consistentemente, nós encontramos que os ratos injetados com pilhas do knockdown de YAP/TAZ tinham reduzido significativamente a carga metastática. A análise dos pulmões mostrou que as células knockdown YAP/TAZ formaram muito menos metástases e que as metástases que se formaram eram menores. Esses experimentos demonstram como os ensaios de metástase experimental permitem que um pesquisador teste rapidamente e barata o papel de um gene candidato na formação e crescimento da metástase. Eles mostram ainda como o uso combinado de imagens de animais vivos e quantificação fluorescente de metástases em pulmões inteiros permite ao pesquisador entender melhor os passos durante a colonização metastática.

<table><tbody><tr>Gel <td></td><td></td><td>SDS-PAGE 10%</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>2,5% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Tripsina para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>96 placa de ensaio branca de fundo plano de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Para medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas</td></tr><tr><td>Toalhetes</td><td></td><td></td><td>com álcool Para esterilizar o local da injeção antes das injeções da veia da cauda</td></tr><tr><td>Camundongos BALB/C ( fêmea, 6 semanas)</td><td>Taconic</td><td>BALB-F</td><td>Para colonização metastática da veia da cauda e ensaios de carga</td></tr><tr><td>BSA regular</td><td>VWR Ameresco</td><td>97061-416</td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>Tampão de lise celular</td><td>Sinalização</td><td></td> celular <td>Para coletar amostras de protien</td></tr><tr><td>Filtros de seringa Celltreat, PES 30mm, 0,45 &mu; m</td><td>Celltreat</td><td>40-229749-CS</td><td>Para filtrar o sobrenadante viral</td></tr><tr><td>CO2 e câmara</td><td></td><td></td> de eutanásia <td>Para eutanásia de camundongos</td></tr><tr><td>Kit de ensaio repórter de luciferase dupla</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Para medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas</td></tr><tr><td>Dulbecco& 39; s fosfato tampolado solução salina</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Usado para diluir tripsina para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>FBS 100% origem dos EUA</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Componente de mídia de crescimento completa</td></tr><tr><td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabibit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>2118</td><td>Para anticorpo</td></tr><tr><td>secundário do anti-coelho IgG da cabra do blot ocidental (H+L), soldado</td><td>Thermo científico</td><td>31460</td> de HRP <td>para o western blot</td></tr><tr><td>Células embrionárias humanas do rim, HEK-293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Linha celular usada embalando o vírus</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/High clucose</td><td>GE Healthcare life sciences</td><td>SH30243,01</td><td>Componente de meios de crescimento completos</td></tr><tr><td>Hygromycin B, grau ultra puro</td><td>VWR Ameresco</td><td>97064-810</td><td>Para a selecção de antibióticos de células infectadas</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>Para medir o sinal de luciferase e renilla em células cultivadas</td></tr><tr><td>Imagej</td><td></td><td></td><td>Utilizado para análise de imagens de metástases pulmonares: limiar definido para 25 & 100</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immuno-Blot</td><td>Biorad</td><td>1620177</td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td></td><td></td><td>Para anestesia de camundongo</td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Sistema de imagem in vivo (dispositivo de imagem de animais vivos in vivo)</td> <td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td>Para imagens in vivo de carga metastática</td></tr><tr><td>Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP e filtros de campo claro)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscópio e câmera para visualização, contagem e tomada de amostras de metástases nos pulmões; ampliação de 10X, exposição de 3,5 segundos, ganho de 1,4</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Componente de meio de crescimento completo</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Para transfecção</td></tr> <tr><td>de repórter YAP/TAZ-TEADImagem viva 3.2 (programa de software de imagem)</td> Software <td>PerkinElmer</td><td></td> para <td></td></tr><tr><td>células de câncer de mama de camundongo IVIS, 4T1</td><td>Karmanos Cancer Institute</td><td>Aslakson, CJ et al., 1992</td><td>Linha celular de câncer mamário metastático de camundongo</td></tr><tr><td>Multi-Gauge versão 3.0</td> Software <td>Fujifilm</td><td></td><td>para quantificar a intensidade da banda de western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM (tampão de transfecção)</td> <td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Para embalagem de vírus e transfecção</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente de meio de crescimento completo</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Para quantificar a concentração de proteína</td></tr><tr><td>Mini comprimidos de inibidor de fosfatase Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32957</td><td>Adicionado ao tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Mini comprimidos</td> <td>de inibidor de protease PierceThermo Scientific</td><td>A32953</td><td>Adicionado ao tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Polybrene (brometo de hexadimerina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Para infecção</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Para seleção antibiótica de células infectadas</td></tr><tr>Restrição <td></td><td></td> de<td>roedores</td><td>Para conter camundongos durante a injeção da veia da cauda</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de corrida SDS-PAGE<td>Para western blot</td></tr><tr><td>TAZ (V3886)</td><td>Anticorpo Cell Signaling</td><td>4883</td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>TBST buffer</td><td></td><td></td><td>Para western blot</td></tr><tr><td>TC20 contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para contagem</td></tr><tr><td>de células Vectores</td><td></td><td></td><td>Consulte a Tabela 1 para obter a lista completa de vectores</td></tr><tr><td>VWR Microscópio de Fluorescência Invertida</td><td>VWR</td><td>89404-464</td><td>Para visualizar a fluorescência em Células marcadas com ZSGreen</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de transferência ocidental <td>Para western blot</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferina K + Sal</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Substrato injetado em camundongos para imagens IVIS bioluminescentes in vivo</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de DNA X-tremeGENE 9 (solução lipídica para transfecção)</td> <td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Para embalagem de vírus</td></tr><tr><td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>14074</td><td>Para western blot</td></tr></tbody></table>

uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

A metástase é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e há opções terapêuticas limitadas para pacientes com doença metastática. A identificação e o teste de novos alvos terapêuticos que facilitarão o desenvolvimento de melhores tratamentos para doençametastática requer modelos in vivo pré-clínicos. Demonstrado aqui é um modelo de camundongo singênico para atribuir câncer de mama colonização metastática e crescimento subseqüente. As células cancerosas metastáticas são transinduzidas de forma estrutumsónte com vetores virais codificando protecções de vaga-lume e ZsGreen. Os genes candidatos são então manipulados de forma evigorada em células cancerosas lúciferase/ZsGreen e, em seguida, as células são injetadas em camundongos através da veia lateral da cauda para analisar a colonização e o crescimento metastáticos. Um dispositivo de imagem in vivo é então usado para medir a bioluminescência ou fluorescência das células tumorais nos animais vivos para quantificar as mudanças na carga metastática ao longo do tempo. A expressão da proteína fluorescente permite que o número e o tamanho das metástases nos pulmões sejam quantificados no final do experimento sem a necessidade de secção ou coloração histológica. Esta abordagem oferece uma maneira relativamente rápida e fácil de testar o papel dos genes candidatos na colonização metastática e crescimento, e fornece muito mais informações do que os ensaios tradicionais de metástase da veia da cauda. Usando essa abordagem, mostramos que o knockdown sim da proteína associada sim (YAP) e co-ativador transcricional com um motivo de ligação pdz (TAZ) em células de câncer de mama leva à redução da carga metastática nos pulmões e que esta carga reduzida é o resultado de colonização metastática significativamente prejudicada e crescimento reduzido de metástases.

Para demonstrar a abordagem acima, realizamos um experimento de prova de conceito no qual um fator crítico de replicação, o RPA3 foi derrubado em uma linha de células carcinoma mamária samária do camundongo metastático (4T122). Enquanto o protocolo descreve a rotulagem das células com proteínas luciferase e fluorescentes antes da manipulação genética, usamos uma abordagem modificada porque os vetores RNAi também entregam ZsGreen (Figura 2A). Primeiro,...

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Nosso protocolo pode ser usado para testar rapidamente e facilmente o papel de qualquer gene candidato na colonização e crescimento metastático. O protocolo também permite o monitoramento em tempo real de metástase, formação e crescimento, bem como quantificação do número e tamanho da metástase nos mesmos animais sem a necessidade de ressecção ou coloração histológica. Placa quatro células T1 a 150.000 células por poço em uma placa de 12 poços em mídia de crescimento completo.Incubar a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, aspire a mídia de crescimento das células. Adicione 500 microliters de supernanato viral luciferase e 500 microliters de proteína fluorescente supernante viral para infectar simultaneamente as células com as supernantes virais luciferase e proteína fluorescente.Em seguida, adicione um microliter de oito miligramas por brometo de hexadimetrina mililitro e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Tentepsinizar as quatro células T1 com 500 microliters de trippsina. Depois de dois a cinco minutos, transfira todas as células para um prato de seis centímetros em quatro mililitros de mídia de seleção,

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

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