Analisando a Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica por Travessia Microbiana através de Células Endoteliais Microvasculares
14 de fevereiro de 2020
A barreira sangue-cérebro humana impede seletivamente a penetração de moléculas hidrofônicas e patógenos no cérebro. Várias patologias, incluindo meningite e delírio pós-operatório, estão associadas a uma maior permeabilidade da barreira hematoencefálica. Aqui, descrevemos um modelo de cultura celular endotelial para testar a permeabilidade da barreira por travessia microbiana.
Este método permite analisar a barreira hemencefálica humana medindo a travessia bacteriana em diferentes tratamentos. Pode ajudar a descobrir a patogênese da meningite bacteriana e o delírio pós-operatório. É um método simples e os efeitos do tratamento são diretamente representados pelo número de bactérias.
Pode ser modificado para permitir a análise de alto rendimento de compostos nas células endoteliais. Comece montando a placa de 12 poços em um armário de segurança biológica. Desempacotar a placa e cada inserção, em seguida, use fórceps esterilizados para pegar as pastilhas em sua base e colocá-las nos poços.
Cubra a membrana porosa de cada inserção com 90 microlitadores de 10 microgramas por mistura de colágeno microliter IV e fibronectina e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, lave as pastilhas duas vezes, encanar um mililitro de PBS em cada inserção e aspirando-o com uma bomba de vácuo. Em seguida, equilibre as membranas ao tubo de tubos pré-armados DMEM F12 médio nas câmaras superior e inferior e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para semear as células endoteliais microvasculares humanas, aspirar o meio do frasco de cultura celular e lavar as células com 10 mililitros de PBS. Cubra as células completamente com cinco mililitros de trippsina EDTA e incubar o frasco por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Transfira cinco mililitros das células em um tubo de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de FCS contendo meio para parar a reação enzimática.
Centrifugar a suspensão por três minutos a 210 vezes g, remover o supernaspe e resuspensar a pelota da célula em cinco mililitros de médio. Adicione 10 microliters da suspensão celular a 10 microliters de 0,4% de mancha azul trypan, em seguida, adicione 10 microliters da mistura a uma câmara de contagem. Coloque a câmara de contagem no balcão da célula e inicie o programa apropriado certificando-se de que o contador está focado.
Após a contagem, semente 200.000 células em cada câmara superior na placa de 12 poços e incubar a placa a 37 graus Celsius por 14 dias mudando a mídia na câmara superior e inferior a cada dois ou três dias. Após 14 dias, certifique-se de que a confluência celular é 100% ao imagens deles com um microscópio. Um dia antes da medição da permeabilidade, colocou uma colônia de cepa E.coli GM2163 em três mililitros de meio LB.
Cultue as células a 37 graus Celsius por 24 horas em um shaker de incubação. Para tratar as células com um composto de interesse, dilui-as à sua concentração final no meio DMEM F12 e adicione essa mistura nas câmaras superior e inferior na placa de 12 poços, em seguida, incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após a incubação, troque o meio completo com meio livre de antibióticos.
Determine a concentração da cultura bacteriana durante a noite medindo sua densidade óptica em 600 nanômetros, em seguida, dilui-lo para um OD600 de 0,5 em um tubo Falcon de 50 mililitros. Em um gabinete de segurança biológica, adicione 450 microliters da solução bacteriana em cada câmara superior da placa de 12 poços, em seguida, incubar a placa por seis horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a inserção com fórceps e prove 50 microlitadores do meio de cada câmara inferior, tomando cuidado para não derramar o meio das câmaras superiores para as mais baixas.
É importante separar estritamente a mídia da câmara superior e inferior como uma repercussão das bactérias da câmara superior levaria a resultados falsos positivos. Solte cada amostra em uma placa de ágar separada e esque a solução com um espalhador de células. Incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas, depois conte as colônias.
Para investigar o efeito da glicação na travessia microbiana através da barreira hematoencefálica, as células foram tratadas com uma solução glixacional de 0,5 milimiliar por uma hora com células não tratadas servindo como controle. A glicoção foi então detectada através de imunoblotting com anticorpos anti-IDADE. As colônias bacterianas obtidas foram contadas e representadas como o número absoluto de colônias ou o número relativo de colônias normalizadas ao controle.
Amostras tratadas com glixal apresentaram um número aumentado de colônias indicando que o tratamento tem um efeito na densidade da barreira celular. Para investigar a glicização da proteína induzida pela glicose, os THBMECs foram cultivados em glicose normal e meio de glicose alta. O número absoluto de colônias e o número relativo de colônias normalizadas ao controle indicaram que a glicose não teve efeito significativo na integridade da barreira hemencefálica.
As células endoteliais tratadas podem ser analisadas por abordagens proteômicas, por exemplo, espectrometria de massa, para analisar alterações no proteome. Essa técnica ajuda na compreensão da barreira heórfencena humana e da travessia bacteriana. Pode ser usado para descobrir aspectos do envelhecimento e doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para analisar a barreira hematoencefálica humana (BHE) mediante a medição da travessia bacteriana sob diversos tratamentos. Tem como objetivo aprimorar a compreensão de condições como meningite bacteriana e delirium pós-operatório.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microbiologia
Contexto
- A BHE restringe seletivamente a entrada de moléculas hidrofílicas e patógenos no cérebro.
- O aumento da permeabilidade da BHE está associado a várias patologias.
- Compreender a permeabilidade da BHE pode auxiliar na descoberta da patogênese de certas doenças.
- Modelos de cultivo de células endoteliais são essenciais para estudar as propriedades da BHE.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo confiável para testar a permeabilidade da BHE.
- Investigar os efeitos de tratamentos na travessia microbiana.
- Explorar as implicações para doenças associadas à disfunção da BHE.
Métodos Utilizados
- Revestimento de inserts com colágeno IV e fibronectina para cultura celular.
- Plaquiação de células endoteliais microvasculares humanas e manutenção por 14 dias.
- Medição da travessia bacteriana utilizando E. coli e análise dos resultados por contagem de colônias.
- Investigação dos efeitos da glicação na travessia microbiana utilizando tratamento com glioxal.
Resultados Principais
- O tratamento com glioxal aumentou o número de colônias bacterianas, indicando alteração na densidade da barreira.
- Condições de alta glicose não afetaram significativamente a integridade da BHE.
- Abordagens proteômicas podem analisar mais detalhadamente as células endoteliais tratadas.
- O método permite análise de alto rendimento de compostos que afetam a BHE.
Conclusões
- O modelo desenvolvido é eficaz para estudar a permeabilidade da BHE.
- Os achados contribuem para a compreensão da patogênese de doenças neurológicas.
- Pesquisas futuras podem utilizar este método para explorar o envelhecimento e condições neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a avaliação quantitativa da permeabilidade da barreira hematoencefálica por meio da travessia microbiana, fornecendo uma leitura funcional para a validação de alvos na descoberta de fármacos para o SNC. Ao associar a integridade da barreira a fenótipos relevantes para doenças, como meningite e delirium, ele contribui para a redução de riscos mecanicistas de hipóteses terapêuticas. O formato do ensaio permite a triagem de compostos que modulam a função da barreira endotelial, auxiliando na identificação de compostos líderes e na confiança preditiva em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas relativas à permeabilidade da barreira e aos mecanismos de travessia de patógenos.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura quantitativa baseada na contagem de colônias para a validação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que alteram a densidade da barreira com relevância para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados para triagem de compostos e avaliação de permeabilidade.
- Valor Operacional: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio do cultivo definido de células endoteliais em colágeno IV/fibronectina.
- Escalabilidade: Permite análise de alto rendimento dos efeitos de compostos sobre células endoteliais, conforme descrito no protocolo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Modela a travessia microbiana associada a patologias como meningite, permitindo a avaliação de sistemas relevantes para doenças.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a análise de fatores celulares endógenos e dos efeitos da glicação na integridade da barreira.
- Continuidade Pré-clínica: Apoia decisões de avanço ajustadas a riscos ao conectar a permeabilidade in vitro à patogênese in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, especialmente para terapêuticas direcionadas ao SNC, onde a penetração na barreira é um parâmetro crítico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de barreira e a elucidação de vias por meio de modelos de glicação e tratamento com glicose.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e resultados quantitativos para avaliar os efeitos de compostos na permeabilidade endotelial.
- Análises: Fornece variáveis dependentes mensuráveis (contagem de colônias) que permitem comparação entre diferentes condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Estabelece ligação com a continuidade pré-clínica ao modelar a travessia bacteriana relevante para infecções e inflamações neurológicas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar a modulação da BHE em múltiplas bibliotecas de compostos e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na função de barreira.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio do cultivo celular definido e da medição de travessia.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir/não prosseguir ao identificar precocemente compostos moduladores da barreira, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em perfis de permeabilidade da BHE vinculados a mecanismos de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, técnica estéril e manipulação microbiana dentro de uma cabine de segurança biológica.
- Depende de instrumentação para contagem de células, incubação e quantificação de colônias.
- Necessita padronização entre equipes nos fluxos de trabalho de biologia e microbiologia para prevenir artefatos de contaminação cruzada.
- Exige considerações de adaptação ao ser estendido a outras cepas bacterianas ou modelos patogênicos.
- As limitações práticas incluem a janela de incubação de seis horas e a necessidade de separação rigorosa das câmaras para evitar resultados falsos positivos.
