Name: Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda um método de triagem rápida para identificar supressores de silenciamento de RNA em patógenos vegetais usando Nicotiana bethamiana. Esta técnica melhora a eficiência e precisão na detecção desses agentes secretados.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do "Programa Shuguang" da Fundação de Desenvolvimento educacional de Xangai e da Comissão Municipal de Educação de Xangai, do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da Chave Nacional da China ( 2018YFD0201500), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31571696 e 31660510), o Programa Mil Talentos para Jovens Profissionais da China e a Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (18DZ2260500).

NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR).
ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar.
1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos
<ol><li>Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a infecção, conforme determinado pelo sequenciamento de RNA (RNA-Seq), e ainda pela técnica quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).</li>
	<li>Determine o site do decote do peptídeo de sinal de cada effector usando uma ferramenta de software como o SignalP18.</li>
	<li>Projete primers e execute PCR para amplificar o gene codificando o efeito de interesse usando polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute a eletroforese de gel de agarose para verificar o produto PCR e, em seguida, clonar o amplicon no vetor de entrada gateway pQBV3 usando o kit de clonagem sem ligação(Tabela de Materiais),e posteriormente no vetor de expressão de destino pEG100 usando a reação de recombinação LR19.</li>
	<li>Transforme 3-5 μL de mistura de reação LR em 100 μL de células E. coli competentes (por exemplo, TOP10, DH5α), espalhe as células bacterianas transformadas em Meio agar Luria-Bertani (LB) complementada com 50 μg/mL kanamicina, e incubar a 37 °C por 16-20 h. NOTA: Os transformantes positivos podem ser identificados pela colônia PCR20 e analisados por miniprep e sequenciamento plasmáticos.</li>
	<li>Introduza 50-100 ng de plasmídeos recombinantes transportando proteína sucroável em 100 μL de células A. tumefaciens quimicamente competentes (por exemplo, GV3101 ou C58C1), misture suavemente e, em seguida, congele em nitrogênio líquido por 1 min. Descongele as células em um banho de água de 37 °C por 5 min.</li>
	<li>Adicione 500 μL de caldo LB e incuba a 30 °C para 4-6 h com agitação suave, e depois transfira e espalhe todas as células de agrobactérias em meio LB agar complementado com 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina a 30 °C por 2 dias. NOTA: Clones positivos podem ser verificados pela colônia PCR.</li>
	<li>Use uma única colônia transformada para experimentos de agroinfiltração, a menos que seja dirigido de outra forma. NOTA: Na presente pesquisa, nenhum dos genes realizadores testados continha intronas previstas; cada um dos genes foi diretamente amplificado a partir de DNA genômico de um isolado fitophthora sojae. Recomenda-se um vetor de expressão de planta Gateway sem qualquer etiqueta, mas não necessário.</li>
</ol>2. Preparação de plantas N. benthamiana 16c
<ol><li>Prepare misturas de solo de vasos constituídas por (por volume) 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite, e autoclave a 120 °C por 20 min.</li>
	<li>Misture o solo autoclavo com solução de fertilizante vegetal (1 g/L) e subembaem em potes menores (80 mm x 80 mm x 75 mm) armazenados em uma bandeja maior (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Semea uma ou duas sementes de N. benthamiana 16c na superfície do solo de cada panela. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.</li>
	<li>Coloque a bandeja câmaras de crescimento leves e controladas pela temperatura com temperatura de 23-25 °C, 50-60% umidade relativa e um período de fotoperiod de longo dia (14h claro/10h escuro, com iluminação de 130-150 μE·m-2s-1).</li>
	<li>Tire a cúpula de plástico após o germinar as sementes (3-4 dias) e permita que as mudas cresçam as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.</li>
	<li>Adicione uma quantidade adequada de água, mantendo o solo úmido, mas não encharcado, a cada 2-3 dias; adicionar fertilizante a cada 10 dias para promover um crescimento adicional. Mantenha as plantas N. benthamiana 16c em condições normais até estarem prontas para uso; nesta fase, a planta deve ter pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas e nenhum axillário visível ou brotos de flores, e as folhas devem ter uma aparência verde saudável).</li>
	<li>Use folhas de 3 a 4 semanas de N. benthamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA, e as plantas jovens N. benthamiana 16c (10-14 dias de idade) para ensaios sistêmicos de silenciamento de RNA. NOTA: As condições e instalações de crescimento das plantas variam entre laboratórios; escolher folhas saudáveis, bem desenvolvidas e totalmente expandidas para infiltração.</li>
</ol>3. Preparação da cultura Agrobacterium para infiltração
<ol><li>Escolha uma colônia positiva da placa LB e inocule as células em tubo de vidro contendo 5 mL de meio LB complementado com 50 μg/mL kanamicina e 50 μg/mL rifampicina. Cresça as células a 30 °C com tremor a 200 rpm por 24-48 h.</li>
	<li>Transfira 100 μL de cultura para 5 mL de meio LB complementado com mesmos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES; pH 5.6) e 20 μM acetosyringononona (AS). Cresça bactérias a 30 °C com tremor a 200 rpm por 16-20 h.</li>
	<li>Células centrífugas a 4.000 x g por 10 min. Despeje o supernatante e resuspenda a pelota em 2 mL de 10 mM MgCl2 tampão.</li>
	<li>Repita o passo 3.3 para garantir a remoção completa dos antibióticos.</li>
	<li>Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nm (OD600). Ajuste-se a um OD600 de 1,5-2.0 com tampão MgCl2 de 10 mM.</li>
	<li>Adicione 10 mM MES (pH 5.6) e 150 μM AS às culturas finais de suspensão e incuba as células na RT por pelo menos 3 h sem tremer. NOTA: Não deixe as culturas finais de suspensão durante a noite.</li>
</ol>4. Co-infiltração N. benthamiana folhas
<ol><li>Misture volumes iguais de uma cultura Agrobacterium contendo 35S-GFP com uma cultura Agrobacterium contendo 35S- supressor de vírus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efeito putativo ou vetor vazio (EV).</li>
	<li>Cuidadosamente e lentamente, infiltrar-se nas suspensões mistas de agrobacterium nos lados abaxiais das folhas n. benthamiana 16c usando uma seringa sem agulha de 1 mL.</li>
	<li>Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com limpadores de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta fabricante.</li>
	<li>Deixe as plantas infiltradas na câmara de crescimento as mesmas condições de crescimento. NOTA: Por razões de segurança e saúde, óculos de proteção e uma máscara devem ser usados durante a infiltração. Para evitar a contaminação cruzada, as luvas devem ser trocadas ou esterilizadas com etanol entre infiltrações. Normalmente, pelo menos 1 mL de suspensões de agrobacterium por folha é necessário para infiltração. Para silenciamento sistêmico, pelo menos duas folhas serão necessárias para infiltração.</li>
</ol>5. Análise de imagem gfp
<ol><li>Detecte visualmente fluorescência gfp em folhas recém-cultivadas de plantas inteiras 2 semanas após a infiltração (para silenciamento sistêmico de RNA) ou manchas infiltradas de folhas 3-4 dpi usando uma lâmpada ultravioleta de ondas longas (UV) sem a coleta de folhas.</li>
	<li>Fotografe plantas coletadas e/ou folhas separadas com uma câmera digital equipada com filtros UV e amarelo. NOTA: Para ensaios de silenciamento local, investigue remendos infiltrados de folhas n. benthamiana 16c, enquanto para atividade sistêmica de silenciamento, investigue folhas recém-cultivadas. A atividade de supressão de silenciamento de RNA pode variar entre os efeitos individuais. Portanto, observe as manchas ou folhas ao longo de alguns dias a partir de 3 dpi. Use CMV2b e EV como controles positivos e negativos, respectivamente.</li>
</ol>6. Análise de manchas norte dos níveis de GFP mRNA em folhas infiltradas
<ol><li>Isolamento do RNA total do tecido folha usando o reagente de isolamento rna (Tabela de Materiais)<ol>
<li>Colete tecidos de folhas de manchas infiltradas n. benthamiana 16c a 4-7 dpi, pulverizar em nitrogênio líquido para um pó fino e transferir o pó para um tubo estéril de 2 mL.</li>
		<li>Adicione o reagente de isolamento rna (1 mL/100 mg tecidual) imediatamente ao tubo amostrado em um capô, agite vigorosamente para homogeneizar e incubar na RT por 5 min.</li>
		<li>Adicione clorofórmio (200 μL/1 mL RNA reagente de isolamento) a cada tubo em um capô, agite vigorosamente por 15 s e incuba r 5 min. Centrífuga o homogeneado a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o supernatant para um novo tubo livre de RNase e descarte a pelota. Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernatante, inverta delicadamente várias vezes e incuba a mistura na RT por 10 minutos.</li>
		<li>Precipitar a pelota de RNA por centrífuga em 12.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o supernatante, lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato diethyl (DEPC) incubando em um banho de água de 65 °C por 10-20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de manchas norte do nível de GFP mRNA nas folhas infiltradas<ol>
<li>Prepare um gel de agarose de dedenação de formaldeído de 1,2% em 1x mops tampão de execução.</li>
		<li>Misture rna 1:1 com tintura de carregamento de RNA e denatureza por incubação a 65 °C por 10 min, esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por 1 min.</li>
		<li>Carregue as amostras no gel e eletroforese a 100 V por 50 min até que o RNA esteja bem separado.</li>
		<li>Enxágüe o gel em 20x tampão de citrato salino-sódio (SSC) para remover formaldeído e transfira o gel para membrana de nylon por transferência capilar em tampão SSC de 20x durante a noite. Mergulhe a membrana em 2x SSC e fixe o RNA na membrana expondo a membrana molhada à ligação da cruz UV.</li>
		<li>Adicione a quantidade apropriada de tampão de hibridização (10 mL por membrana de 100 cm2; Tabela de Materiais) em um tubo de hibridização e agitar a 60 °C em um forno de hibridização.</li>
		<li>Coloque a membrana no tubo de hibridização e incuba por 60 min a 60 °C. Diluir uma sonda de DNA com rótulo DIG de 5'DIG (concentração final, 50 ng/mL) na solução de hibridização contendo tampão de hibridização pré-aquecido.</li>
		<li>Descarte o buffer de pré-hibridização e substitua imediatamente por uma solução de hibridização pré-aquecida contendo a sonda rotulada dig. Incubar a mancha com sonda a 60 °C durante a noite, com agitação suave.</li>
		<li>Após a hibridização, lave a membrana duas vezes em buffers de cada fio de 60 °C por 20 min cada. Limpe delicadamente a membrana para remover o tampão extra de lavagem e adicione reagentes conforme sugerido no kit de hibridização e detecção quimiologo(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Detecte sinais hibridizados pela reação quimiológica combinada com o sistema de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Virulence+Annotation+%28RVA%29%3A+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li>
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<li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li>
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<li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SignalP+4.0%3A+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li>
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<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li>
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<li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+and+its+suppression%3A+novel+insights+from+in+planta+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss10.
Aqui...

Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas1. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da resposta imune. Assim, os efetivadores estão sujeitos a diversas pressões seletivas, levando à diversificação de processos ou repertórios entre as linhagens patógenas2. Nos últimos anos, os agentes putativos de patógenos vegetais têm mostrado interromper a imunidade inata da planta, impedindo processos celulares hospedeiros para beneficiar os micróbios de várias maneiras, incluindo a disregulação de caminhos de sinalização, transcrição, transporte intracelular, estabilidade do citoesqueleto, tráfico de vesículos e silenciamento de RNA3,4,5. No entanto, a grande maioria dos patógenos, particularmente os de patógenos filamentous, permaneceram enigmáticos.
O silenciamento de RNA é uma máquina de inativação genética mediada por homologia que é conservada entre eupedia. O processo é desencadeado por longoR de dupla cadeia (dsRNA) e tem como alvo o RNA homônimo de uma única cadeia (ssRNA) de forma específica de sequência, e manipula uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a defesa antiviral6. Para superar as respostas imunes inatas do hospedeiro, alguns vírus evoluíram para compensar o silenciamento de RNA, incluindo a capacidade de se replicar dentro de compartimentos intracelulares ou escapar do sinal reorganizado silenciante. No entanto, a estratégia mais geral pela qual os vírus protegem seus genomas contra a perda dependente de RNA da função genética é codificar proteínas específicas que suprimem o RNA silenciando7,8. Várias abordagens mecanicamente diferentes foram estabelecidas para tela e caracterizam supressores virais de silenciamento de RNA (VSRs), incluindo a co-infiltração de culturas de tumefaciens Agrobacterium, plantas transgênicas expressando supressores putativos, enxerto e cultura celular9,10,11,12,13.
Cada um desses ensaios tem vantagens e desvantagens, e identifica VSRs de sua maneira distinta. Uma das abordagens mais comuns baseia-se na co-infiltração de culturas individuais a. tmuefaciens que abrigam a proteína viral potencial e um gene repórter (tipicamente proteína fluorescente verde [GFP]) nas plantas nicotiana benthamiana 16c constitutivamente expressando GFP o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor. Na ausência de um supressor viral ativo, o GFP é identificado como exógeno pelas células hospedeiras e é silenciado dentro de 3 dias após a infiltração (dpi). Em contrapartida, se a proteína viral possui atividade de supressão, o nível de expressão do GFP permanece estável além de 3-9 dpi9. Este ensaio de co-infiltração é simples e rápido; no entanto, não é altamente estável nem sensível. No entanto, o ensaio identificou inúmeros VSRs com diversas sequências e estruturas proteicas em muitos vírus RNA7,8.
Recentemente, várias proteínas effectoras que podem inibir a atividade de silenciamento de RNA celular foram caracterizadas a partir de patógenos vegetais bacterianos, oomycete e fúngicos14,15,16. Esses achados implicam que a silenciamento de RNA é uma estratégia comum para facilitar a infecção que é usada por patógenos na maioria dos reinos. Em teoria, muitos, se não todos, dos efetivadores podem codificar supressores de rna silenciando (RSSs); até o momento, porém, apenas alguns foram identificados, principalmente devido à escassez da estratégia de triagem confiável e geral. Além disso, supressores de silenciamento de RNA não foram investigados na grande maioria dos patógenos vegetais17.
Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado e geral para identificar os efeitos de patógenos vegetais que podem suprimir o silenciamento de RNA local e sistêmico usando o ensaio de agroinfiltração. O principal objetivo deste estudo foi enfatizar os aspectos-chave do protocolo e descrever as etapas detalhadas, fornecendo assim um ensaio de triagem adequado para quase todos os efeitos dos patógenos vegetais.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-morfolifelistanossulfônico (MES)</td> <td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3- (N-morfolino) ácido propanossulfônico (MOPS)</td> <td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Acetosiringona (AS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Indução de Ágar</td></tr> <tr><td></td><td>AgrobacteriumSigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB médio</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Eletroforese</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Imagem</td></tr><tr><td>Bacto Triptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB médio</td></tr><tr><td>Extração</td> <td>de levedura BactoBD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB câmera média</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografia</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo de detecção quimioluminescente componente de kits dafa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Detecção de luminescência</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Kit de clonagem de uma etapa ClonExpress II</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Ligation</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Tampão de hibridização</td></tr><tr><td>Easypure Plasmid Miniprep kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Extração de plasmídeo</td></tr><tr><td>EasyPure Quick Gel Extraction</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Extração de gel</td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico di-hidratado</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Electroforese Fonte de Alimentação</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Eletroforese de ácido nucleico.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Gel de digestão vetorial</td></tr><tr><td>Sistema de imagem</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Imagem</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>LR Clonase II enzima</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>reação LR</td></tr><tr><td>Membrana de borrão de nitrocelulose 0,45um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south kit de rotulagem de DNA primário aleatório de biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Rotulagem de biotina</td></tr><tr><td>PCR Termocicladores</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Musgo de turfa</td><td>PINDSTRUP</td><td>Ouro Escuro + argila</td><td>Plantas</td></tr><tr><td>Peters Fertilizante solúvel em água</td><td>ICE</td><td>Peter Fertilizante Profissional 20-20-20</td><td>Phanta</td></tr><tr><td>Max Super-Fidelidade DNA Polimerase</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Corante de Carregamento de Gel de RNA (2X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>Corante de Carregamento de Gel de RNA</td></tr><tr><td>Acetato de Sódio Hidratado</td><td>Amresco / VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB médio</td></tr><tr><td>citrato trissódico</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC Buffer</td></tr><tr><td>Trizol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>reagente de isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>Observação</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Forno</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Norte</td></tr></tbody></table>

triagem e identificação de supressores de silenciamento de rna de agentes secretos de patógenos vegetais

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.

Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da hausto...

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como rastrear os supressores de silenciamento de RNA secretados por patógenos vegetais. A principal vantagem desta técnica é fornecer um ensaio de triagem rápido, preciso e extensivo para identificação de supressores de silenciamento de RNA. Prepare misturas de solo de vasos compostas por 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite e autoclave a 120 graus Celsius por 20 minutos.Mergulhe as misturas de solo autoclaved com solução de fertilizante vegetal a um grama por litro e subembale-as em potes menores armazenados em uma bandeja maior. Semear uma ou duas sementes de Nicotiana bethamiana 16c na superfície do solo de cada vaso. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.Coloque a bandeja sob câmaras de crescimento controladas pela luz e temperatura com uma temperatura de 23 a 25 graus Celsius, 50 a 60% de umidade relativa e um longo período de tempo. Depois de três a quatro dias, as sementes germinam. Tire a cúpula de plástico e permita que as mudas cresçam sob as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.A cada dois ou três dias, adicione uma quantidade apropriada de água mantendo o solo úmido, mas não encharcado. A cada 10 dias, adicione fertilizante para promover um crescimento maior. Mantenha as plantas nicotiana bethamiana 16c em condições normais até que as plantas tenham pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas sem botões axilares ou florais visíveis e as folhas têm uma aparência verde saudável.Use plantas nicotiana bethamiana de 10 a 14 dias para ensaios de silenciamento de RNA sistêmico e folhas de três a quatro semanas de nicotiana bethamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA. Use uma dica para escolher uma colônia positiva da placa LB e inocular as células em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de meio LB suplementados com 50 microgramas por mililitro Kanamycin e 50 microgramas por mililitro Rifampicin. Cresça as células a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por 24 a 48 horas.Transfira 100 microliters da cultura em cinco mililitros de meio LB suplementados com os mesmos antibióticos, 10 mililitros MES no pH 5.6 e 20 micromolar AS. Cresça a bactéria a 30 graus Celsius com tremor a 200 RPM por 16 a 20 horas. Centrifugar as células a 4.000 vezes g por 10 minutos. Descarte o supernascer e resuspenque a pelota em dois mililitros de 10 mililitros de cloroium tampão de cloreto de magnésio.Repita a lavagem para garantir a remoção completa dos antibióticos. Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nanômetros. Ajuste a cultura celular com 10 mililitros de cloreto de magnésio a um OD 600 de 1,5 a 2,0.Adicione 10 milimôlares MES no pH 5.6 e 150 micromolar AS à cultura final de suspensão e incubar as células em temperatura ambiente por pelo menos três horas sem tremer. Misture volumes iguais de uma cultura agrobacterium contendo proteína fluorescente verde 35S com uma cultura agrobacterium contendo supressor de vírus do mosaico de pepino 35S 2b, efeito putativo ou vetor vazio. Usando uma seringa sem agulha de um mililitro, infiltrar-se cuidadosamente e lentamente nas suspensões mistas de Agrobacterium nas laterais abaxial das folhas de Nicotiana bethamiana 16c.Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com lenços de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta marcadora. Três a quatro dias após a infiltração, use uma lâmpada ultravioleta de ondas longas para detectar visualmente a fluorescência GFP nas manchas infiltradas das folhas. Duas semanas após a infiltração, use a lâmpada para detectar folhas recém-cultivadas de toda a planta para silenciar RNA sistêmico.Para isolar o RNA total do tecido da folha em quatro a sete dias após a infiltração, colete os tecidos da folha das manchas de Nicotiana bethamiana 16c infiltradas em uma argamassa. Coloque nitrogênio líquido na argamassa e triture o tecido em um pó fino com uma vara de moagem e transfira o pó para um tubo estéril de dois mililitros. Adicione imediatamente o reagente de isolamento de RNA ao volume de um mililitro por 100 miligramas de tecido ao tubo de amostra em um capô, vórtice vigorosamente para homogeneizar e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Adicione clorofórmio ao volume de 200 microliters por um mililitro de reagente de isolamento de RNA a cada tubo no capô, agite vigorosamente por 15 segundos e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o homogeneizar a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo sem RNase e descarte a pelota.Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernasciente, inverta suavemente várias vezes e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Precipitar a pelota de RNA por centrifugação a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso.Lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato de dietil incubando em um banho de água de 65 graus Celsius por 10 a 20 minutos. Para realizar a análise de manchas do Norte dos níveis de RNA do mensageiro GFP, prepare um gel de agarose de desnatação de formaldeído de 1,2% em 1X MOPS em execução de buffer.Misture o RNA um-a-um com corante de carregamento de RNA e desnaturar o RNA por incubação a 65 graus Celsius por 10 minutos. Esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por um minuto. Com uma pipeta, carregue as amostras nos poços do gel e eletroforese a 100 volts por 50 minutos até que o RNA esteja bem separado.Enxágüe o gel em 20X tampão de citrato de sódio salino para remover o formaldeído. Realize a transferência capilar durante a noite, configurando 20X tampão de citrato de sódio salino, uma camada de papel toalha, duas camadas de papel Whatman molhado, uma camada de gel, uma camada de membrana de nylon, duas camadas de papel Whatman molhado, duas camadas de papel Whatman seco, uma placa de vidro e um peso. Pela manhã, o RNA no gel é transferido para a membrana de nylon.Mergulhe a membrana em 2X citrato de sódio salino e fixe o RNA na membrana expondo a membrana úmida ao crosslinking UV. Prossiga de acordo com o manuscrito. Folhas totalmente desenvolvidas de três a quatro semanas de plantas Nicotiana bethamiana 16c foram co-infiltradas em remendos com misturas de Agrobacterium que transportavam 35S GFP.Aos quatro dias após a infiltração, a fluorescência GFP da área infiltrada foi imagen sob luz natural e luz UV de ondas longas. A mancha norte revelou que o RNA do mensageiro GFP acumulou maior nas folhas expressando 35S GFP mais 35S CMV2b ou 35S GFP mais 35S PSR1 do que nas folhas expressando 35S GFP mais EV. O ensaio de agroinfiltração foi realizado para avaliar a disseminação do sinal de silenciamento nas folhas das mudas Nicotiana bethamiana 16c de duas semanas. Em 14 dias após a infiltração, mais de 98% do EV não apresentava sinalização óbvia de GFP em folhas sistêmicas.Considerando que tanto o CMV2b quanto o PSR1 inibiram eficientemente a propagação sistêmica do sinal de silenciamento. A fluorescência GFP foi observada em cerca de 80% das plantas co-infiltradas e nos 20% restantes das plantas infiltradas com apenas algumas veias vermelhas apareceram em folhas recém-emergidas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores identificarem novos supressores de silenciamento de RNA secretados por muitos patógenos vegetais.A combinação de plantas e o OD adequado é a coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento. Após este procedimento, a caracterização funcional do supressor de silenciamento de RNA pode ser feita para explorar o mecanismo de como esses supressores pressionam o silenciamento do RNA do host e qual é a saída. Por favor, use os óculos de segurança quando você se infiltrar nas plantas e também use as luvas de látex durante todas as etapas do experimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica...

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

Fonte: Shi, J., et al. Triagem e identificação de supressores silenciadores de RNA a partir de efetores secretados de patógenos vegetais. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra um ensaio de coinfiltração para identificar proteínas efetoras de patógenos que suprimem o silenciamento de RNA na Nicotiana benthamiana 16c. Um repórter fluorescente e um gene efetor candidato são entregues às folhas da planta via Agrobacterium. Normalmente, o silenciamento de RNA degrada os transcritos repórteres,...

Ensaio de Co-Infiltração para Triagem de Efetores de Patógenos que Suprimem o Silêncio do RNA Vegetal

Induzida por vírus silenciamento de genes é uma ferramenta útil para a identificação de genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras. Nós demonstramos o uso de bactérias patogênicas que expressam GFPuv em identificar plantas silenciados genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Esta abordagem é simples, rápido e facilita a triagem em grande escala e protocolo semelhante pode ser aplicado ao estudo de várias outras interacções planta-microorganismo.

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

Aqui, descrevemos uma metodologia para realizar uma siRNA alvo "ubiquitome" tela para identificar romance ubiquitina e reguladores de ubiquitina-like da resposta celular mediada por HIF1A à hipóxia. Isto pode ser adaptado para qualquer via biológica, onde uma leitura robusta de actividade repórter está disponível.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

A quantificação do crescimento de patógenos é uma ferramenta poderosa para caracterizar várias respostas imunes de Arabidopsis thaliana (doravante: Arabidopsis). O método descrito aqui apresenta um ensaio otimizado de infiltração de seringa para quantificar a Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 crescimento em folhas adultas de Arabidopsis.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patossistema

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Um pipeline de bioinformática, ou seja, miRDeep-P2 (miRDP2 para breve), com critérios de miRNA de plantas atualizados e um algoritmo revisado, poderia analisar com precisão e eficiência transcriptomas microRNA em plantas, especialmente para espécies com genomas complexos e grandes.

Um pipeline de bioinformática para analisar com precisão e eficiência os transcriptomas de MicroRNA em plantas

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

Descrevemos um método simples, mas altamente reprodutível, para isolar o RNA extracelular da superfície da folha e do apoplasto de plantas de Arabidopsis.

Um guia passo a passo para o isolamento e análise da superfície foliar e RNA apoplástico usando rosetas de Arabidopsis

Aprenda um método de triagem rápida para identificar supressores de silenciamento de RNA em patógenos vegetais usando Nicotiana bethamiana. Esta técnica melhora a eficiência e precisão na detecção desses agentes secretados.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

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