Name: Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda o rastreamento retrógrado de neurônios motores em embriões de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes. Esta técnica permite visualizar a morfogênese neuronal e a conectividade do sistema motor com alta resolução.

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Agradecemos aos membros do Laboratório Kamiyama por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 NS107558 (para M.I., K.B., e D.K.).

1. Equipamentos e Suprimentos
<ol><li>Materiais para a coleta de embriões e treinamento de adultos para pôr ovos<ol>
<li>Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa. NOTA: Alternativamente, filtros celulares com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)podem ser usados para a etapa de filtragem da coleta de embriões.</li>
		<li>Faça pratos de ágar com premix de ágar de uva(Mesa de Materiais)de acordo com as instruções listadas. Resumidamente, mexa suavemente 1 pacote da mistura de pó em 500 mL de temperatura ambiente (RT, 23 °C) dH2O e microondas a mistura dissolvida para ferver vigorosamente. Depois de esfriar a 70 a 75 °C, despeje a mistura em placas de Petri (60 mm). Depois que o ágar é solidificado, placas de loja em 4 °C.</li>
		<li>Prepare a pasta do fermento misturando o fermento seco ativo(tabela dos materiais)e a água a uma consistência da pasta, e mantenha-se em 4 °C.</li>
		<li>Use gaiolas de coleta de ovos (para 60 mm placa de Petri, Mesa de Materiais)que fornecem fluxo de ar suficiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de agulhas de dissecação e micropipettes de injeção de tine<ol>
<li>Prepare micropipette de injeção de tingelo e agulha de dissecação da mesma tubulação capilar com um diâmetro interno de 0,6 mm e um diâmetro externo de 1,2 mm(Mesa de Materiais). Puxe a tubulação capilar por um puxador de micropipette em 7% de 170 V saída máxima(Mesa de Materiais)para criar uma agulha afiada com uma cone de ~ 0,4 cm de comprimento.</li>
		<li>Para injeção de tine, ajuste a micropipette com um beveler micropipette(Tabela de Materiais)por uma técnica de veveling bolha descrita no manual do instrumento.<ol>
<li>Em suma, mergulhe o moedor com um agente molhado(Mesa de Materiais)para evitar que a água 'arraste' a ponta da agulha. Coloque a agulha na braçadeira micropipette em 25-30° e abaixe a ponta em dois terços do raio para fora do centro da superfície beveling. Moer a agulha enquanto uma seringa com tubos empurra o ar para a agulha, para garantir que a micropipette estará livre de aparas de vidro.</li>
			<li>Marque a micropipette com um marcador permanente de ponta fina para indicar a posição da abertura na ponta depois de biving como é um desafio para localizar a abertura estreita da micropipette que é formada em um ângulo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação para a coleta de embriões
<ol><li>Certifique-se de que as moscas adultas (20-40 wild-type Canton-S ou moscas brancas), machos e fêmeas, são mantidos em jovens (<7 dias) e condições saudáveis para a coleção de ovos ideal. NOTA: Para estimular a postura de ovos, as moscas são treinadas em sua gaiola de coleta de ovos um par de dias antes da coleta de ovos em placas de ágar listradas com pasta de fermento pelo menos uma vez por dia.</li>
</ol>3. Encenação de embriões
<ol><li>Permitir que as moscas coloquem ovos durante a noite (ou pelo menos 15 h) na RT para coletar os embriões a 15 h AEL, ou seja, estágio 1618, para ver a dendritogênese dos neurônios motores aCC e RP3. De manhã, recolher o prato com os ovos. NOTA: Os embriões em 15 h AEL terá um intestino distinto de 4câmaras 18. Para a imagem de imagem diferentes estágios seguem seus critérios morfológicos específicos e condições de envelhecimento.</li>
	<li>Para coletar os embriões, dechorionate os ovos colocados na placa com 50% de lixívia por 5 min.</li>
	<li>Uma vez que os chorões tenham limpado, despeje o conteúdo da placa através do aparelho de filtragem ou filtro celular para isolar os embriões. Usando uma garrafa de água espremer, diluir a lixívia deixada no prato e recolher tantos embriões quanto possível, decantando a mistura no filtro.</li>
	<li>Lave os embriões no filtro 3-4x com mais água ou até que o odor de lixívia se dissipe. Retire o filtro do aparelho e lave os embriões em outra placa limpa com água. Decantar a água da nova placa em que os embriões estão.</li>
	<li>Prepare um slide de vidro, cobrindo-o com duas camadas de fita de vinil no centro, formando um retângulo. Corte uma piscina retangular da fita usando uma lâmina de barbear. Coloque uma fina tira de fita dupla face para a extremidade superior da piscina, este é o lugar onde os embriões serão colocados como mostrado na Figura 1.</li>
	<li>Usando fórceps finos, selecione individualmente 5-10 embriões em 15 h AEL e coloque-os na fita dupla face com o lado dorsal virado para cima. Adicione o soro sorode Ringer 19 ao pool de dissecação para proteger os embriões da dessecação (Figura 1).</li>
</ol>4. Dissecação e coloração
<ol><li>Usando uma agulha de vidro um microscópio de dissecação(Tabela de Materiais),corte através da linha média de um único embrião em sua superfície de seu posterior a sua extremidade anterior. Em seguida, arraste o embrião para fora da membrana vitelline da fita para o vidro (encaixotado na Figura 1). Tome cuidado para não danificar os tecidos interiores do embrião.</li>
	<li>Vire os tecidos epiteliais do centro e anexar a borda epidérmica na superfície do slide de vidro (Figura 1, inserção).</li>
	<li>Usando uma agulha conectada ao tubo com uma abertura de ponta de ~ 300 μm (preparado quebrando a ponta fina de uma agulha de dissecação), aspirar ou soprar ar para separar e remover os troncos traqueais dorita longitudinal, bem como quaisquer tripas restantes.</li>
	<li>Use 4% de paraformaldeído (PFA) em sosseo tampão de fosfato (PBS) para corrigir os embriões por 5 min em RT. Lave os embriões 3x com PBS.</li>
	<li>Manchar os embriões com 1 μL de anticorpo anti-rábano peroxidase conjugado com cinina 3 tina (anti-HRP Cy3) (Tabela de Materiais) em 200 μL da PBS por 1 h. Lave os embriões com PBS 3x após a coloração. NOTA: O corante da anti-HRP pode ser alterado com base nos corantes lipofílicos de escolha para injeção.</li>
</ol>5. Enchimento da micro-pipeta de injeção
<ol><li>Corantes lipofílicos térmicos (5 mg/mL de DiO ou DiD, Tabela de Materiais)a 60 °C em uma mistura de 1:10 de etanol: óleo vegetal antes de usar.</li>
	<li>Prepare um toque dissolvido em óleo para a micropipette de injeção. Coloque a micropipette no suporte capilar(Figura 2,#1). Usando o micromanipulador(Tabela de Materiais),ajuste a micropipette para estar sobre o toque slide. Em seguida, ajuste o palco para colocar a micropipette no corantes (Figura 2,#2).</li>
	<li>Para encher a micropipette, use um microinjetor (Tabela de Materiais) ( Figura2, #3). Colete o tinuismo na micropipette, definindo o Pi (pressão de injeção) entre 200-500 hPa (hectopascal), o Ti (tempo de injeção) entre 0,1-0,5 s e Pc (pressão de compensação) a 0 hPa para 5 min (Figura 2, #4).</li>
	<li>Uma vez que o corante foi coletado, retire o toque slide e coloque a amostra no estágio do microscópio. Em seguida, aumente o Pc para um intervalo de 20 a 60 hPa antes de abaixar a micropipette na amostra para evitar a contaminação do PBS por ação capilar.</li>
</ol>6. Injeção de corantes em neurônios
<ol><li>Localizar o embrião no centro usando o microscópio com lente 10x objetiva(Tabela de Materiais)e alinhar a micropipette com o embrião. NOTA: O tamanho da gota de tinua pode ser ajustado alterando o Pi ou o tamanho da abertura da ponta da micropipette. A gota deve ser de 10 a 20 μm, que é aproximadamente a largura de 1 músculo.</li>
	<li>Mude a lente objetiva para uma lente 40x de imersão na água(Mesa de Materiais)e submerte a lente em PBS para ver o embrião.<ol>
<li>Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção.</li>
		<li>Durante a injeção, use microscopia de campo brilhante para ver a gota de corantes. Quando o embrião estiver em foco, mude a posição da micropipette para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse (por exemplo, aCC, RP3).</li>
		<li>Deixe cair o corante em um abdominal direito (A2−A6) hemi-segmento na junção neuromuscular de aCC ou RP3 (Figura 3) com DiD ou DiO, usando os neurônios marcados por anti-HRP Cy3. Usando o controle da mão (mouse; Figura 2, 5) liberar o tinuismo e remover a micropipette depois de deixar cair o tinulado com o micromanipulador e passar para o próximo local de injeção. NOTA: Ao contrário de outros corantes (por exemplo, amarelo Lúcifer, calcein) que se espalham para as células vizinhas através de junções gap, corantes lipofílicos associam-se com membranas celulares e não se transferem para os vizinhos. Devido ao tamanho relativamente grande da gota de tinua, no entanto, esta técnica também resulta na rotulagem dos músculos em parceria (Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a amostra em RT por 1 h após a tine-gota antes da imagem latente. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui antes da montagem, e a amostra pode ser mantida em 4 °C durante a noite. Corantes lipofílicos também podem ser entregues usando iontoforese, se um amplificador intracelular acoplado diretamente (DC) estiver prontamente disponível20.</li>
</ol>7. Imagem com microscópio confocal
<ol><li>Retire a fita dupla face e fita de vinil do slide de vidro com a ajuda de fórceps.</li>
	<li>Prepare um deslizamento de cobertura (22 x 22 mm2 No.1 vidro de cobertura) com uma pequena quantidade de graxa de vácuo(Mesa de Materiais)nos quatro cantos e cuidadosamente coloque na amostra, evitando bolhas de ar. Remova todo o excesso PBS usando limpadores da tarefa.</li>
	<li>Empurre para baixo o deslizamento da tampa para ajustar a distância de funcionamento entre a lente objetiva e a amostra. Selar completamente as bordas da tampa escorregar com esmalte.</li>
	<li>Imagem na ampliação de 10x e de 100x usando um microscópio confocal.</li>
	<li>Use o software ImageJ para processar imagens brutas do microscópio(Tabela de Materiais). NOTA: A observação deve começar dentro de 10 minutos após a montagem para as melhores imagens. Caso contrário, na RT, o tinativo se espalhará para locais adjacentes ao local da injeção, criando fundo indesejado para imagens. Para retardar a difusão de tine, a amostra pode ser armazenada a 4 °C por algumas horas.</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
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<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
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<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O uso de rotulagem de corante para estudar morfologia neuronal tem várias vantagens sobre as técnicas genéticas de rotulagem de células. A técnica de rotulagem de corante pode minimizar a quantidade de tempo necessário para rotular e imaginar as morfologias dos neurônios motores. O processo de rotulagem de corante é bastante rápido, pois é preciso menos de 2 h e nos permite definir o contorno das projeções neuronais. Como alternativa, pode-se visualizar o neurônio motor aCC escolhendo uma linha GAL4 que expressa o fator ...

O sistema de neurônio motor embrionário de Drosophila oferece um poderoso modelo experimental para analisar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)1,2,3. O sistema de neurônios motores é passível de técnicas bioquímicas, genéticas, de imagem e eletrofisiológicas. Usando as técnicas, manipulações genéticas e análises funcionais podem ser realizadas no nível dos neurônios motores individuais2,4,5,6.
Durante o desenvolvimento inicial do sistema nervoso, neuroblasts dividir e gerar um grande número de glia e neurônios. A relação espaço-temporal entre a delaminação e o perfil de expressão gênica dos neuroblastos já foi investigada em detalhes7,8,9. No caso do sistema de neurôniomotor, a formação da junção neuromuscular embrionária (NMJ) tem sido extensivamente estudada usando o aCC (célula de canto anterior), RP2 (camarão cru 2) e neurônios motores RP52,10. Por exemplo, quando o neurônio motor RP5 forma uma junção sináptica nascente, a filopodia pré-sináptica e pós-sináptica está misturada11,12,13. Essa comunicação celular direta é vital para iniciar a formação nmj. Ao contrário do que sabemos sobre os ramos nervosos periféricos, nosso conhecimento de como os dendritos motores iniciam conectividade sináptica dentro do SNC ainda é primitivo.
Neste relatório, apresentamos uma técnica que permite a rotulagem retrógrada dos neurônios motores em embriões por meio de entrega mediada por micropipette de corantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear os 38 neurônios motores innervating cada um dos 30 músculos da parede do corpo em um hemi-segmento em 15 h após a postura de ovos (AEL)14. Ao utilizar esta técnica, o nosso grupo investigou exaustivamente numerosos alelos de ganho de função/perda de função15,16,17. Recentemente, desvendamos os mecanismos moleculares que impulsionam o início da conectividade de dendrita motoreae e demonstramos que uma interação Dscam1-Dock-Pak define o local de conseqüência dendrita no neurônio motoraCC 17. Em geral, esta técnica é adaptável para a análise fenotípica de quaisquer neurônios motores embrionários em tipo selvagem ou cepas mutantes, aumentando a nossa capacidade de fornecer novos insights sobre o design funcional do sistema nervoso Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Lente objetiva 10x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>Lente de imersão em água 40x</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>Tubo capilar</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Libélula Unidade confocal de disco giratório</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Quadrado #</td></tr>1 <tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>Fita Dupla Face</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Graxa de Alto Vácuo</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de coleta de ovos</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>descontinuado</td><td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Software de processamento de imagem</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Chanfrador de micropipetas</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulhas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Ágar Uva em Pó Pacotes de Pré-mistura FlyStuff</td><td></td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Rede</td> de <td>Nylon Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% Solução, Microscopia Eletrônica de grau EM</td><td>Ciências</td><td>15710</td><td>Qualquer grau EM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Vendido em sigmaaldrich, solução 10x em caixa</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Agente umectante</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência vertical</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci com fonte de luz LED</td></tr><tr><td>Fita isolante de vinil</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Cell Strainers</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Levedura</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Levedura seca ativa (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Descrevemos uma técnica para rotulagem retrógrada de neurônios motores em Drosophila. Usamos um corante lipofílico dissolvido em óleo e entregamos uma pequena gota para uma preparação de filé embrionário por um microinjetor. Cada neurônio motor cuja membrana é contatada pela gotícula pode então ser rapidamente rotulado. Neurônios motores individuais são continuamente rotulados, permitindo que detalhes estruturais finos sejam claramente visualizados. Dado que os corantes lipofílicos vêm em várias cores, a técnica também fornece um meio para obter neurônios adjacentes rotulados em multicolor. Esta técnica de rastreamento é, portanto, útil para estudar morgênese neuronal e conectividade sináptica no sistema de neurônios motores de Drosophila.

Uma imagem representativa dos neurônios motores aCC e RP3 é mostrada na Figura 3C para demonstrar a rotulagem multicolorida dos neurônios motores a 15 h AEL. Suas morfologias dendríticas são em grande parte invariáveis entre embriões. O padrão de coloração obtido com anticorpo anti-HRP é mostrado em cinza. Uma pequena gota de DiO ou DiD foi depositada no NMJ do músculo 1 ou 6/7, respectivamente. A Figura 4 demonstra a capacidade de medir quantit...

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

A técnica de rastreamento descrita neste protocolo nos ajuda a estudar a morfogênese neuronal e a quebrar a conectividade no sistema de neurônios motores de Drosophila. O corante lipofílico pode difundir rapidamente cada parte da membrana celular com uma densidade extremamente alta. É por isso que nosso protocolo resolve eficientemente encontrar estruturas de um neurônio rotulado.Se um terminal de axônio estiver acessível com uma micropipette de injeção, essa técnica pode ser aplicada a qualquer neurônio nos estágios larval e adulto de moscas ou em outros organismos. Se você não tem experiência em dissecar ou usar um microinjetor precisa da operação no espécime, pode ser desafiador. Entender a anatomia do embrião, ajudará com orientação para a porção adequada de ferramentas para realizar dissecção ou uma dinjeição.Para iniciar, prepare e desemem tudo sobre materiais de coleta de embriões. Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mililitros e cortando um orifício na tampa. Em seguida, coloque um filtro de malha com 100 poros de micrômetro entre o tubo e a tampa.Prepare a micropipette de injeção de corante e a agulha de dissecção a partir da mesma tubulação capilar com

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o...

Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Fonte: Inal, M. A. et. al., Rastreamento retrógrado de Drosophila neurônios motores embrionários usando corantes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o método de rotulagem retrógrada de Drosophila neurônios motores usando corantes lipofílicos. O corante entra no axônio, viaja retrógrada e rotula os neurônios em verde, permitindo a visualização detalhada de sua morfologia e projeções sob um microscópio confocal.

Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Fonte: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/58365/ visualize-drosophila-perna-motor-neurônio-axônios-através-da-cutícula-adulta'&gt;Guan, W., et. al. Visualize Drosophila axônios do neurônio motor da perna através da cutícula adulta. J. Vis. Exp. (2018) &lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Este vídeo demonstra imagens deDrosophila pernas com neurônios motores que expressam proteínas fluorescentes verdes usando microscopia...

Imagem de neurônios motores marcados com fluorescência em uma perna adulta de Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Aqui descrevemos um protocolo para visualizar o direcionamento axonal com uma proteína fluorescente em adultas pernas de drosófila por fixação, montagem, imagem e pós-imagem passos.

Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Aprenda o rastreamento retrógrado de neurônios motores em embriões de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes. Esta técnica permite visualizar a morfogênese neuronal e a conectividade do sistema motor com alta resolução.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

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