Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification
May 18th, 2020
Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.
Somente e somente proteínas de ligação controlam múltiplos processos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, portanto, para traçar o perfil global do arranjo especial e temporal de RNAs e RBPs em células de mamíferos. Este método permite a detecção eficiente de RNAs diretas ligadas à proteína sem SDS-PAGE e os procedimentos de transferência de membrana.
Comparado com o CLIP-seq tradicional é isótopo livre e não requer anticorpo específico de proteína. Comece emplacando cerca de 3 milhões de células STEM embrionárias de camundongos em uma placa de 10 centímetros e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, remova o meio com um vácuo e trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por dois minutos em temperatura ambiente.
Sacie a trippsina com quatro mililitros de meio MESC fresco, e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifuá-los a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Suspenda as células em quatro mililitros de PBS frios e transfira-as de volta para a placa de 10 centímetros para ligação cruzada.
Irradie as células com uma luz UV de 254 nanômetros, em seguida, transfira as células transversais para um tubo de 15 mililitros. Gire essas células a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, depois remova o sobrenasci e lise as células com 500 microliters de Buffer A preparados de acordo com as instruções do manuscrito. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse e incuba-as a quatro graus Celsius com rotação suave por 30 a 60 minutos.
Trate o lise com 30 microliters de DNAse 1 a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, pare a reação adicionando quatro microliters de 0,5 molar EDTA. Gire a pelota insolúvel centrifugando a 12.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius, e transfira o supernante para um novo tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro.
Transfira a célula para contas flag pré-equilibradas e incubar a amostra a quatro graus Celsius enquanto gira por duas a quatro horas. Após a incubação, centrifufique as contas por dois minutos a 3000 vezes G e remova o supernaspe. Adicione 500 microliters de Buffer A à amostra, e incubado a 4 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, gire as contas e remova o supernante.
Repita a lavagem com buffer A, seguido por duas lavagens com buffer pré-refrigerado B.To elute com um peptídeo X FLAG, prepare a solução de elução conforme descrito no manuscrito do texto e gire as contas de BANDEIRA. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta final estreita e adicione 200 microliters da solução de elução X FLAG para cada amostra. Incubar as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação suave.
Em seguida, gire as contas por dois minutos a 3000 vezes G.Transfira o supernato para um tubo fresco e repita a elução duas vezes. Economize 5% dos eluentes para análise de manchas ocidentais ou coloração de prata para verificar a eficiência da imunoprecipitação flag. Transfira os eluentes puxados para contas de streptavidin preparadas e gire as amostras suavemente a quatro graus Celsius por uma a três horas ou durante a noite.
Em seguida, colete as contas em um suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer C com rotação suave por cinco minutos por lavagem. Em seguida, lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer D, e duas vezes com 500 microliters de tampão PNK gelado, coletando as contas no suporte magnético e removendo o sobrenadante entre as lavagens.
Para realizar a digestão parcial do RNA, adicione 100 microliters de solução MNA a cada amostra e vórtice fixado a 37 graus Celsius com um mixer térmico por 10 minutos. Colete as contas com um suporte magnético por 30 segundos e remova o supernatante. Em seguida, lave-os com tampão PNK-EDTA, Buffer C e PNK buffer de acordo com as instruções do manuscrito.
Colete as contas com o suporte magnético e remova o tampão. Em seguida, adicione a mistura de reação CIP e o vórtice das contas a 37 graus Celsius com uma batedeira térmica por 10 minutos. Lave rapidamente as contas duas vezes com 500 microliters de tampão PNK EDTA gelado, seguido por duas lavagens com 500 microliters de tampão PNK gelado.
Após as lavagens, adicione 40 microliters de três misturas de ligadura de ligação prime às contas, e vórtice-os a 16 graus Celsius com uma batedeira térmica por três horas ou durante a noite. A ligadura eficiente do linker aos aliados é fundamental para este experimento. Verifique o tubo de reação ocasionalmente para ter certeza de que estes não precipitam durante a ligadura.
Após a incubação, repita as lavagens com tampões PNK EDTA e PNK, adicione 40 microliters de PNK misturados às contas e o vórtice deles a 37 graus Celsius com a batedeira térmica por 10 minutos. Lave as contas com buffers PNK EDTA e PNK, em seguida, proceda com o isolamento do RNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Em comparação com a purificação mediada por BANDEIRA ou streptavidin mediada por um passo, a purificação de tandem FLAG-Biotin removeu quase todas as proteínas purificadas do núcleo, evitando a contaminação de interações indiretas de RNA proteica.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq foi realizado usando células STEM embrionárias do rato. No total, cerca de 7,7 milhões e 2,2 milhões de leituras exclusivas foram recuperadas para LIN28 e WDR43, respectivamente. A comparação das visualizações da faixa mostra diferentes padrões de ligação no lócus pré-rRNA RN45.
Os sites intercedentais no motivo GGA G de pré-let7-g RNA por LIN28, Fbio CLIP-seq ou identificados. Além disso, foram determinados motivos enriquecidos de RNA nos locais de ligação e a porcentagem de nucleotídeos mutantes em diferentes tipos de mutações. Mostrando que lin28 prefere se ligar ao nucleotídeo genético.
Bem, às 22:00, este protocolo, é importante confirmar a eficiência da imunoprecipitação para garantir que os complexos da proteína fossem purificados com sucesso.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo CLIP-seq modificado chamado Fbio CLIP-seq, que utiliza purificação tandem FLAG-biotina para identificar alvos de RNA de proteínas ligantes de RNA (RBPs) em células de mamíferos. O método permite a detecção eficiente de RNAs ligados diretamente a proteínas sem a necessidade de procedimentos de SDS-PAGE e transferência de membrana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Fundo
- Proteínas ligantes de RNA (RBPs) desempenham papéis cruciais na regulação de vários processos biológicos.
- Métodos tradicionais de CLIP-seq frequentemente requerem isótopos e anticorpos específicos.
- Fbio CLIP-seq visa simplificar o processo de perfilamento de RBPs e seus alvos de RNA.
- Este método é particularmente útil para estudar células de mamíferos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais eficiente para identificar alvos de RNA de RBPs.
- Eliminar a necessidade de procedimentos complexos como SDS-PAGE.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente aplicado em estudos de células de mamíferos.
Métodos Utilizados
- Semeadura de células-tronco embrionárias de camundongos em uma placa de 10 cm.
- Incubação das células durante a noite antes do tratamento.
- Tratamento com tripsina EDTA para desprender as células.
- Utilização de purificação tandem FLAG-biotina para isolamento de RNA.
Principais Resultados
- O método Fbio CLIP-seq perfila com sucesso RBPs e seus alvos de RNA.
- Demonstrou eficiência na detecção de RNAs ligados a proteínas.
- Mostrou que o método é livre de isótopos e anticorpos.
- Proporcionou uma abordagem simplificada para estudar interações RNA-proteína.
Conclusões
- Fbio CLIP-seq é uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam RBPs em células de mamíferos.
- O método melhora a capacidade de perfilar interações de RNA sem as limitações tradicionais.
- Aplicações futuras podem se expandir para vários contextos biológicos e tipos celulares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
