Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification
18 de maio de 2020
Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.
Somente e somente proteínas de ligação controlam múltiplos processos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, portanto, para traçar o perfil global do arranjo especial e temporal de RNAs e RBPs em células de mamíferos. Este método permite a detecção eficiente de RNAs diretas ligadas à proteína sem SDS-PAGE e os procedimentos de transferência de membrana.
Comparado com o CLIP-seq tradicional é isótopo livre e não requer anticorpo específico de proteína. Comece emplacando cerca de 3 milhões de células STEM embrionárias de camundongos em uma placa de 10 centímetros e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, remova o meio com um vácuo e trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por dois minutos em temperatura ambiente.
Sacie a trippsina com quatro mililitros de meio MESC fresco, e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifuá-los a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Suspenda as células em quatro mililitros de PBS frios e transfira-as de volta para a placa de 10 centímetros para ligação cruzada.
Irradie as células com uma luz UV de 254 nanômetros, em seguida, transfira as células transversais para um tubo de 15 mililitros. Gire essas células a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, depois remova o sobrenasci e lise as células com 500 microliters de Buffer A preparados de acordo com as instruções do manuscrito. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse e incuba-as a quatro graus Celsius com rotação suave por 30 a 60 minutos.
Trate o lise com 30 microliters de DNAse 1 a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, pare a reação adicionando quatro microliters de 0,5 molar EDTA. Gire a pelota insolúvel centrifugando a 12.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius, e transfira o supernante para um novo tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro.
Transfira a célula para contas flag pré-equilibradas e incubar a amostra a quatro graus Celsius enquanto gira por duas a quatro horas. Após a incubação, centrifufique as contas por dois minutos a 3000 vezes G e remova o supernaspe. Adicione 500 microliters de Buffer A à amostra, e incubado a 4 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, gire as contas e remova o supernante.
Repita a lavagem com buffer A, seguido por duas lavagens com buffer pré-refrigerado B.To elute com um peptídeo X FLAG, prepare a solução de elução conforme descrito no manuscrito do texto e gire as contas de BANDEIRA. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta final estreita e adicione 200 microliters da solução de elução X FLAG para cada amostra. Incubar as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação suave.
Em seguida, gire as contas por dois minutos a 3000 vezes G.Transfira o supernato para um tubo fresco e repita a elução duas vezes. Economize 5% dos eluentes para análise de manchas ocidentais ou coloração de prata para verificar a eficiência da imunoprecipitação flag. Transfira os eluentes puxados para contas de streptavidin preparadas e gire as amostras suavemente a quatro graus Celsius por uma a três horas ou durante a noite.
Em seguida, colete as contas em um suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer C com rotação suave por cinco minutos por lavagem. Em seguida, lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer D, e duas vezes com 500 microliters de tampão PNK gelado, coletando as contas no suporte magnético e removendo o sobrenadante entre as lavagens.
Para realizar a digestão parcial do RNA, adicione 100 microliters de solução MNA a cada amostra e vórtice fixado a 37 graus Celsius com um mixer térmico por 10 minutos. Colete as contas com um suporte magnético por 30 segundos e remova o supernatante. Em seguida, lave-os com tampão PNK-EDTA, Buffer C e PNK buffer de acordo com as instruções do manuscrito.
Colete as contas com o suporte magnético e remova o tampão. Em seguida, adicione a mistura de reação CIP e o vórtice das contas a 37 graus Celsius com uma batedeira térmica por 10 minutos. Lave rapidamente as contas duas vezes com 500 microliters de tampão PNK EDTA gelado, seguido por duas lavagens com 500 microliters de tampão PNK gelado.
Após as lavagens, adicione 40 microliters de três misturas de ligadura de ligação prime às contas, e vórtice-os a 16 graus Celsius com uma batedeira térmica por três horas ou durante a noite. A ligadura eficiente do linker aos aliados é fundamental para este experimento. Verifique o tubo de reação ocasionalmente para ter certeza de que estes não precipitam durante a ligadura.
Após a incubação, repita as lavagens com tampões PNK EDTA e PNK, adicione 40 microliters de PNK misturados às contas e o vórtice deles a 37 graus Celsius com a batedeira térmica por 10 minutos. Lave as contas com buffers PNK EDTA e PNK, em seguida, proceda com o isolamento do RNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Em comparação com a purificação mediada por BANDEIRA ou streptavidin mediada por um passo, a purificação de tandem FLAG-Biotin removeu quase todas as proteínas purificadas do núcleo, evitando a contaminação de interações indiretas de RNA proteica.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq foi realizado usando células STEM embrionárias do rato. No total, cerca de 7,7 milhões e 2,2 milhões de leituras exclusivas foram recuperadas para LIN28 e WDR43, respectivamente. A comparação das visualizações da faixa mostra diferentes padrões de ligação no lócus pré-rRNA RN45.
Os sites intercedentais no motivo GGA G de pré-let7-g RNA por LIN28, Fbio CLIP-seq ou identificados. Além disso, foram determinados motivos enriquecidos de RNA nos locais de ligação e a porcentagem de nucleotídeos mutantes em diferentes tipos de mutações. Mostrando que lin28 prefere se ligar ao nucleotídeo genético.
Bem, às 22:00, este protocolo, é importante confirmar a eficiência da imunoprecipitação para garantir que os complexos da proteína fossem purificados com sucesso.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo CLIP-seq modificado chamado Fbio CLIP-seq, que utiliza purificação em tandem FLAG-biotina para identificar os RNAs alvo de proteínas que ligam RNA (RBPs) em células de mamíferos. O método permite a detecção eficiente de RNAs ligados diretamente às proteínas, sem necessidade de procedimentos de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS nem de transferência para membrana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Contexto
- As proteínas que se ligam ao RNA (RBPs) desempenham papéis cruciais na regulação de diversos processos biológicos.
- Os métodos tradicionais de CLIP-seq frequentemente exigem isótopos e anticorpos específicos.
- O Fbio CLIP-seq tem como objetivo simplificar o processo de análise de RBPs e seus alvos de RNA.
- Este método é particularmente útil para o estudo de células de mamíferos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método mais eficiente para identificar alvos de RNA em PBPs.
- Eliminar a necessidade de procedimentos complexos, como eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente aplicado em estudos com células de mamíferos.
Métodos Utilizados
- Placamento de células-tronco embrionárias de camundongo em uma placa de 10 cm.
- Incubação das células durante a noite antes do tratamento.
- Tratamento com tripsina-EDTA para destacar as células.
- Utilização de purificação tandem FLAG-biotina para o isolamento de RNA.
Resultados Principais
- O método Fbio CLIP-seq perfila com sucesso as RBPs e seus alvos de RNA.
- Eficiência demonstrada na detecção de RNAs ligados a proteínas.
- Mostrou que o método é livre de isótopos e de anticorpos.
- Ofereceu uma abordagem simplificada para o estudo das interações RNA-proteína.
Conclusões
- O fbio CLIP-seq é uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam RBPs em células de mamíferos.
- O método aprimora a capacidade de analisar interações de RNA sem as limitações tradicionais.
- Aplicações futuras podem se expandir para diversos contextos biológicos e tipos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O mapeamento direto de interações proteína-RNA é essencial para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em fases iniciais de descoberta. O método Fbio CLIP-seq permite a identificação em todo o transcriptoma de alvos diretos de proteínas que ligam RNA, sem depender de isótopos ou anticorpos específicos para proteínas, reduzindo interferências decorrentes de interações indiretas. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva e apoia decisões de portfólio ajustadas a riscos na descoberta de fármacos direcionados ao RNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação em todo o transcriptoma de interações diretas proteína-RNA para validação funcional de alvos.
- Reduz a ambiguidade mecanicista ao eliminar contaminantes indiretos de proteínas ligadoras de RNA.
- Apoia a confiança preditiva no engajamento de alvos e no mapeamento de vias.
- Facilita a triagem de proteínas ligadoras de RNA com base em perfis de interação direta.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Oferece um fluxo de trabalho padronizado e livre de anticorpos para o preparo de complexos proteína-RNA validados.
- Fornece leituras quantitativas de eventos de ligação direta adequados para triagem subsequente.
- Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade ao eliminar a dependência de isótopos e anticorpos.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre interações proteína-RNA.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao caracterizar interações endógenas em células de mamíferos.
- Permite a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio da identificação de alvos diretos de RNA.
- Reduz os riscos na seleção de biomarcadores translacionais por meio de dados de interação de alta especificidade.
- Facilita o avanço ajustado ao risco de programas terapêuticos direcionados ao RNA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método Fbio CLIP-seq integra-se na interface entre descoberta inicial e identificação de compostos líderes, fornecendo evidências diretas de interações proteína-RNA para validação de alvos e desenvolvimento de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao mapear alvos diretos de proteínas que ligam RNA.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para triagem de compostos e padronização de ensaios.
- Análises: Permite comparação em todo o transcriptoma de padrões de ligação e enriquecimento de motivos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas a modelos pré-clínicos por meio do perfilhamento de interações em tipos celulares relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e independente de anticorpos para diversos estudos de proteínas que ligam RNA.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho por meio de etapas de purificação sem anticorpos, sem isótopos e escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais informadas de prosseguir/interromper e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos direcionados ao RNA.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em bioquímica de RNA-proteína e técnicas de reticulação cruzada.
- Necessita de acesso a infraestrutura para reticulação cruzada por UV, purificação com microesferas de FLAG e estreptavidina e sequenciamento de alto rendimento.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diversos modelos de células de mamíferos mediante otimização do protocolo.
- Limitações potenciais incluem a necessidade de expressão da proteína marcada e a validação cuidadosa da eficiência de purificação.
