Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Esclarecer a espacialidade e a quantidade de vírus nos vetores da mosca branca pode ajudar na compreensão das interações begomovírus-mosca branca e no desenvolvimento de novas estratégias para o controle de doenças begomovirais graves. As vantagens desta técnica são que podemos rapidamente isolar tecidos de mosca branca, co-localizar proteínas virais e de mosca branca, e quantificar vírus em corpos inteiros e plantas infectadas por vírus. No momento experimental apropriado, após a aquisição do vírus, coloque moscas brancas anestesiadas no gelo em uma gota de PBS em um slide de microscópio e use uma agulha de acupuntura fina para abrir o abdômen da mosca branca sob um microscópio estéreo.

Use a agulha para extrair o midgut e coloque o midgut em um prato de coleta de PBS. Para coletar os PSGs, divida o corpo no tórax do lado dorsal perto da cabeça e fixe a mosca branca com uma agulha através do tórax. Use uma segunda agulha para agitar a mosca branca até que as duas glândulas salivares sejam separadas do corpo e transfira as glândulas para um novo prato de PBS.

Para coletar os ovários, abra completamente o abdômen e use uma agulha para separar os ovários dos outros tecidos. Use uma pipeta para remover o excesso de tecido e transfira os ovários para um novo prato de PBS. Para coletar uma amostra de hemolímph, adicione 10 microlitros de PBS em um novo slide de microscópio e coloque uma nova mosca branca na goteta.

Use uma agulha de acupuntura fina para fazer um buraco suavemente no abdômen. Em seguida, aplique uma leve pressão no abdômen para liberar o hemisfão no buffer e coletar uma amostra de oito microliter do líquido. Para visualizar a localização do TYLCV em tecidos pedais colhidos, midgut ou ovário, transfira de 15 a 20 espécimes em uma placa de Petri de vidro de 3,5 centímetros e aspire o excesso de tampão.

Fixar os tecidos em um mililitro de 4% de paraformaldeído por duas horas à temperatura ambiente antes de lavar cuidadosamente as amostras três vezes por dois minutos em um mililitro de TBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, permeabilize as amostras com um mililitro de 0,5% Triton X-100 por 30 minutos antes de lavar três vezes como apenas demonstrado com um mililitro de TBST por lavagem. Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação inespecífica com um mililitro de 1%de albumina de soro bovino por duas horas em temperatura ambiente, seguido por três lavagens em TBST, como demonstrado.

Após a última lavagem, rotule as células com os anticorpos primários de interesse durante a noite a quatro graus Celsius protegidos da luz. Na manhã seguinte, lave as amostras três vezes com TBST antes de adicionar os anticorpos secundários apropriados por duas horas à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, lave os pontões médios três vezes e transfira os espécimes para um slide de microscópio limpo.

Remova o máximo de tampão possível e manche os núcleos com uma gota de DAPI antes de montar com um tapa de cobertura e examinar os tecidos rotulados por microscopia confocal. Para quantificação TYLCV, lave as amostras de tecido de mosca branca colhidas duas a três vezes em PBS fresco e transfira 20 múguês médios, 20 PSGs ou um ovário em cinco microliters de PBS em tubos PCR individuais contendo 25 microliters de solução de lise. Adicione de cinco a sete contas de cerâmica de dois milímetros de diâmetro em cada tubo e triture as amostras em um homogeneizador.

Adicione uma amostra de oito microlitrais de hemóglifo em um novo tubo PCR e adicione 10 microliters de lise ao tubo com uma mistura completa. Incubar todas as amostras a 65 graus Celsius por uma hora seguida de uma incubação de 10 minutos a 100 graus Celsius e uma breve centrifugação. Em seguida, adicione 18 microliters de mistura mestra nos frascos de tubos quantitativos de tiras PCR e adicione dois microliters de cada amostra de DNA a pelo menos três frascos.

Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, feche os tubos e centrífuga para sedimentar a solução na parte inferior de cada frasco. Carregue os frascos em um cicloviário térmico em tempo real para PCR quantitativo, selecionando o cyber como o corante fluoróforo e desconhecido como o tipo de amostra. Em seguida, exporte os dados quantitativos para uma planilha para análise da quantidade relativa de DNA viral em cada amostra.

Aqui, imagens representativas de TYLCV em coloração DAPI em PSGs de mosca branca, midguts e ovários são mostradas. Como observado, o TVLCV demonstra um maior acúmulo dentro dos PSGs e dos múguês médios do que nos ovários. A quantificação do vírus em PSGs de mosca branca, mífios, hemofísicas e ovários após se alimentar de tomate infectado por TYLCV por 24, 48 e 72 horas indica que a quantidade de vírus aumenta em diferentes tecidos de mosca branca em correlação direta com o aumento do período de acesso à aquisição.

É melhor usar moscas brancas frescas, pois insetos mortos aumentarão a dificuldade de dissecção. Após esse procedimento, outras análises, como manchas ocidentais e co-imunoprecipitação, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre expressão de proteína viral e interações de proteínas virais e vetoriais.