Name: Fabricação de Matrizes de microeletrodo Ti3C2 MXene para gravação neural in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a fabricar matrizes de microeletrodos de Ti₃C₂ MXene para gravação neural in vivo. Este método permite micropatterning preciso de filmes de MXene mantendo sua integridade estrutural e condutividade metálica.

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Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (bolsa nº. R21-NS106434), o Citizens United for Research in Epilepsy Taking Flight Award, a Mirowski Family Foundation e Neil e Barbara Smit (F.V.); o Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência (bolsa nº. DGE-1845298 para N.D. e B.M.); o Escritório de Pesquisa do Exército (Acordo Cooperativo Número W911NF-18-2-0026 para K.M.); e pelo Exército dos EUA através do Programa de Iniciativa de Ciência de Superfície no Edgewood Chemical Biological Center (PE 0601102A Project VR9 para Y.G. e K.M.). Este trabalho foi realizado em parte no Singh Center for Nanotechnology, que é apoiado pelo Programa Nacional de Infraestrutura Coordenada de Nanotecnologia da Fundação Nacional de Ciência (NNCI-1542153).

Todos os procedimentos vivos constituídos ao Guia nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.
1. Síntese de Ti3C2 MXene
NOTA: Os procedimentos de reação descritos nesta seção são destinados ao uso dentro de uma capa de fume química. As etapas de lavagem incluídas neste procedimento devem ser utilizadas com tubos de centrífuga equilibrados. Todos os resíduos produzidos são considerados resíduos perigosos e devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes da Universidade.
ATENÇÃO: O ácido fluorídrico (HF) é um ácido extremamente perigoso e altamente corrosivo. Consulte as folhas de dados de segurança dos materiais (MSDS) para obter os produtos químicos usados para sintetizar MXenes antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas. Equipamentos de proteção individual adequados (EPI) para manuseio de HF incluem um casaco de laboratório, avental resistente ao ácido, sapatos de dedo próximo, calças compridas, óculos, escudo facial completo, luvas de nitrile e luvas resistentes a HF feitas de borracha butil ou borracha neoprene.
<ol><li>Síntese de fase MAX<ol>
<li>Sinthesize Ti3AlC2 por bola moendo TiC (2 μm), Ti (44 μm) e Al (44 μm) em uma relação molar (TiC:Ti:Al) de 2:1:1 para 18 h usando bolas de zircônia. Coloque os pós em um cadinho de alumina, aqueça a 1.380 °C (5 °C) e segure por 2 h argônio. Depois que os pós foram resfriados, moa o bloco MAX e peneira através de uma peneira de malha de 200 (<74 μm tamanho de partículas). NOTA: O precursor da fase Ti3AlC2 MAX usado para sintetizar MXenes mostrou-se ter implicações diretas nas propriedades Ti3C2 MXene resultantes38. O Ti3C2 usado para fabricar eletrodos neurais foi seletivamente gravado a partir de MAX preparado após um procedimento anterior26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gravura: Remoção da camada Al em Ti3ALC2 em uma solução ácida etchant(Figura 1A)<ol>
<li>Prepare a solução de gravura seletiva em um recipiente plástico de 125 mL adicionando primeiro 12 mL de água deionizada (DI H2O) seguido pela adição de 24 mL de ácido clorídrico (HCl). Usando todos os PPE gravuras HF apropriados, adicione 4 mL de HF ao recipiente etchant. Realize a gravação seletiva adicionando lentamente 2 g de ti3alc2 max fase ao recipiente de reação e mexendo com uma barra magnética Teflon por 24 h a 35 °C a 400 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavagem: Trazendo o material para pH neutro.<ol>
<li>Encha dois tubos centrífugas de 175 mL com 100 mL de DI H2O. Divida a mistura de reação de gravação em 175 tubos de centrífuga mL e lave o material por centrífuga repetida a 3.500 rpm (2.550 x g) por 5 min. Decant o supernatante ácido em um recipiente de resíduos perigosos plásticos. Repita até que o pH chegue a 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intercalação: Inserção de moléculas entre partícula Multicamada MXene para despertar interações fora do plano (Figura 1B)<ol>
<li>Adicione 2 g de cloreto de lítio (LiCl) a 100 mL de DI H2O e mexa a 200 rpm até dissolver. Misture 100 mL de LiCl/H2O com o sedimento Ti3C2/Ti3ALC2 e mexa a reação por 12 h a 25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Delaminação: Esfoliação da partícula multicamada a granel em camada única a poucas Ti3C2 MXene (Figura 1C)<ol>
<li>Lave a reação intercalation em 175 tubos de centrífuga mL por centrífuga em 2.550 x g por 5 min. Decant o supernatante claro. Repita até que um supernatante escuro seja encontrado.</li>
		<li>Continue a centrífuga por 1h a 2.550 x g. Decante o supernatante verde diluído.</li>
		<li>Re-disperse o sedimento inchado com 150 mL de DI H2O. Transfira supernatante para tubos centrífugas de 50 mL e centrífuga sem 2.550 x g por 10 minutos para separar max (sedimento) restante de MXene (supernatante). NOTA: A redispersão do sedimento se tornará difícil e exigirá agitação ou agitação manual.</li>
		<li>Colecione supernatant como Ti3C2 MXene. Realize mais seleção de tamanho e otimização da solução para isolar flocos de camada única a pouca camada, coletando o supernatante após uma etapa de centrífuga em 2.550 x g por 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazenamento de soluções: Embalagem da tinta MXene para armazenamento de longo prazo(Figura 1D)<ol>
<li>Argon borbulhe as soluções por 30 min antes da embalagem em um frasco de espaço de cabeça lacrado argon (transferência via seringa). Armazene soluções em altas concentrações (>5 mg/mL), longe da luz solar, e a baixas temperaturas (≤5°C) para garantir a longevidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fabricação de Ti3C2 Matrizes de microeletrodo mxene
NOTA: O procedimento descrito nesta seção destina-se a uso dentro de uma instalação padrão de sala limpa da universidade, como o Singh Center for Nanotechnology da Universidade da Pensilvânia. Esta instalação, assim como instalações similares, são acessíveis a usuários externos como parte da Rede Nacional de Infraestrutura de Nanotecnologia (NNIN) apoiada pela Fundação Nacional de Ciência (NSF). Nessas instalações, muitas das ferramentas, equipamentos e materiais descritos nesta seção são fornecidos juntamente com o acesso à instalação da sala limpa e não exigiriam compra separada.
ATENÇÃO: Muitos dos produtos químicos usados na fabricação de eletrodos MXene são perigosos, incluindo fotoresists, desenvolvedor RD6, remover PG, solução de gravação de alumínio e etchant de óxido tampão. Consulte o MSDS para obter esses produtos químicos antes de usar e implementar e seguir as medidas de segurança apropriadas o tempo todo. Todos os produtos químicos devem ser manuseados em um capô de fumaça.
<ol><li>Deposite uma camada inferior de 4 μm de espessura de parylene-C em um wafer Si limpo (ver Figura 2A).</li>
	<li>Use a primeira fotomáscara (máscara-1) para definir as interconexões metálicas dos dispositivos, bem como um anel de metal ao redor da borda do wafer para auxiliar em etapas posteriores de decolagem(Figura 2B).<ol>
<li>O casaco de giro NR71-3000p no wafer a 3.000 rpm para 40 s. Leve assar o wafer em uma placa quente por 14,5 min a 95 °C.</li>
		<li>Carregue o wafer e a máscara-1 em um alinhador de máscaras. Posicione o wafer para que o anel na fotomáscara se sobreponha a todas as bordas do wafer.</li>
		<li>Expor com i-line (comprimento de onda de 365 nm) em uma dose de 90 mJ/cm2. Asse o wafer em um prato quente por 1 min a 115 °C.</li>
		<li>Mergulhe o wafer no desenvolvedor RD6 por 2 minutos, agitando continuamente a solução. Enxágüe bem com DI H2O e seque com uma arma N2.</li>
		<li>Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 10 nm Ti, seguido por 100 nm Au no wafer. NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.</li>
		<li>Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que a fotoresiste se dissolva e o excesso de metal tenha sido totalmente levantado, deixando Ti/Au apenas nos traços de interconexão desejados e no anel ao redor da borda do wafer. Uma vez que a decolagem aparece completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H2O e secar o wafer com uma arma N2.</li>
	</ol></li>
	<li>Deposite a camada parylene-C sacrificial(Figura 2C).<ol>
<li>Exponha o wafer ao plasma O2 por 30 s para tornar a camada parylene-C subjacente hidrofílica. Solução de limpeza do casaco de giro 2% (por exemplo, Micro-90) no DI H2O no wafer a 1.000 rpm por 30 s. Deixe o wafer secar por pelo menos 5 min. NOTA: A solução de sabão diluído atua como um antiadesivo, permitindo que a camada parylene-C sacrificial seja descascada mais tarde no processo.</li>
		<li>Deposite 3 μm de parylene-C no wafer.</li>
	</ol></li>
	<li>Use a segunda fotomáscara (máscara-2) para definir os padrões MXene e um anel ao redor da borda do wafer (Figura 2D).<ol>
<li>Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-2 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.</li>
		<li>Use a gravura de íonre reativo de plasma O2 (RIE) para gravar através da camada parylene-C sacrificial nas áreas não cobertas pela fotoresistpara definir os eletrodos e traços MXene, que devem se sobrepor parcialmente com as interconexões Ti/Au, bem como o anel ao redor das bordas do wafer. Confirme a gravação completa da camada parylene-C sacrificial usando um profilómetro para medir o perfil entre as interconexões Ti/Au expostas e a camada parylene-C inferior. NOTA: Quando a gravação estiver completa, o perfil através da superfície metálica exposta será suave, enquanto a camada parile-C inferior será áspera e parcialmente gravada. Esta etapa de gravação deve ser completada em um sistema rie planar, não um asher barril, e tempos e parâmetros de gravação serão altamente dependentes do sistema RIE.</li>
	</ol></li>
	<li>Spin-coat a solução MXene no wafer (Figura 2E).<ol>
<li>Pipette MXene solução em cada um dos padrões MXene desejados, em seguida, gire o wafer a 1.000 rpm para 40 s. Seque o wafer em uma placa quente de 120 °C por 10 min para remover qualquer água residual do filme MXene.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 50 nm SiO2 no wafer, para agir como uma camada protetora sobre os padrões de MXene para etapas de processamento subsequentes. NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.</li>
	<li>Remova a camada parylene-C sacrificial para padronizar as camadas MXene e SiO2 (Figura 2F).<ol>
<li>Aplique uma pequena gota de DI H2O à beira do wafer e use pinças para descascar a camada parylene-C sacrificial, começando onde suas bordas são definidas no ringue ao redor do wafer. NOTA: A água se combinará com o resíduo de sabão abaixo da camada parilencial-C sacrificial para permitir essa decolagem.</li>
		<li>Enxágüe o wafer completamente em DI H2O para remover qualquer resíduo de solução de limpeza restante. Seque o wafer com uma arma N2, em seguida, coloque em uma placa quente de 120 °C por 1h para remover qualquer água residual dos filmes mxene padronizados.</li>
	</ol></li>
	<li>Deposite a camada superior de 4 μm de espessura de parylene-C (Figura 2G).</li>
	<li>Use a terceira fotomáscara (máscara-3) para definir contorno saque do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2H).<ol>
<li>Repita as etapas 2.2.1-2.2.4, desta vez usando máscara-3 e alinhando cuidadosamente as marcas de alinhamento entre o wafer e a fotomáscara antes da exposição.</li>
		<li>Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 100 nm Al no wafer. NOTA: Parâmetros típicos de depoimento são uma pressão base de 5 x 10-7 Torr e uma taxa de 2 Å/s.</li>
		<li>Mergulhe o wafer no removedor PG por ~10 minutos até que o metal tenha sido totalmente levantado, deixando Al cobrindo os dispositivos com aberturas para os eletrodos e almofadas de ligação. Quando a decolagem estiver completa, sonicate para 30 s para remover quaisquer traços restantes de metal indesejado. Enxágüe wafer primeiro em solução de remover limpo PG, depois enxaguar completamente em DI H2O e secar o wafer com uma arma N2.</li>
	</ol></li>
	<li>Etch o parylene-C para padronizar o contorno do dispositivo e aberturas sobre eletrodos e almofadas de ligação Au (VIAs) (Figura 2I). Use o O2 plasma RIE para gravar através das camadas parylene-C ao redor dos dispositivos, e através da camada parylene-C superior cobrindo os contatos de eletrodo MXene e as almofadas de ligação Au. NOTA: A gravação é completa quando nenhum resíduo parylene-C permanece no wafer entre os dispositivos. A camada SiO2 que cobre o MXene agirá como uma camada de parada de gravura, impedindo que o plasma O2 gravura ou danificasse os contatos do eletrodo MXene.</li>
	<li>Etch a camada Al cobrindo os dispositivos usando uma gravação química molhada em Al etchant tipo A a 50 °C ou por 10 min, ou por 1 min passado quando todos os traços visuais de Al desapareceram, o que vier primeiro. Etch the SiO2 cobrindo os eletrodos MXene usando uma gravura química molhada em 6:1 etchant de óxido tampão (BOE) para 30 s(Figura 2J). NOTA: As matrizes de microeletrodos MXene estão agora completas.</li>
	<li>Solte os dispositivos do wafer de substrato Si colocando uma pequena gota de DI H2O na borda de um dispositivo e descascando suavemente o dispositivo à medida que a água é perversa por baixo dele por ação capilar(Figura 2K e Figura 3).</li>
</ol>3. Construção e Interface
NOTA: Neste ponto, as matrizes de microeletrodos de filme fino devem ser interfacedas com um adaptador para se conectar ao sistema de gravação de eletrofisiologia. O controlador de estimulação/gravação de 128ch com o headstage RHS2000 16-ch stim/record(Tabela de Materiais)usado neste protocolo requer entrada através de um conector compatível com o conector a79039-001. Esta seção utiliza uma placa de circuito impresso (PCB, Figura 4A) com um conector de força de inserção zero (ZIF) para interagir com as almofadas de ligação Au na matriz de microeletrodos e o conector A79040-001 para interagir com o estágio principal do sistema de gravação. Dependendo do sistema de aquisição de dados, diferentes conectores podem ser usados no PCB para permitir a interligação com o headstage da eletrofisiologia.
<ol><li>Solde os conectores Omnetics e ZIF ao PCB, aplicando uma fina película de pasta solda da pasta solda em cada uma das almofadas de contato no PCB, colocando as peças em seus locais apropriados e aquecendo em uma placa quente até que a solda reflua reflua para formar conexões (Figura 4B). NOTA: A solda de refluxo pode ser feita muito facilmente em uma placa quente ou em um forno de torradeira e não requer o uso de um forno de refluxo caro.</li>
	<li>Aplique duas camadas de fita poliimide (Tabela de Materiais) na parte traseira da região da almofada de ligação Au da matriz de microeletrodo MXene para dar ao dispositivo espessura suficiente para ser fixado no conector ZIF. Depois de aplicar a fita, corte qualquer excesso além das bordas do dispositivo parylene-C usando uma lâmina de barbear ou tesoura de precisão(Figura 4C).</li>
	<li>Seja um escopo de inspeção ou usando óculos de ampliação, alinha mxene matriz de microeletrodo no conector ZIF para que as almofadas de ligação Au se alinham com os pinos dentro do conector ZIF, em seguida, feche o ZIF para formar uma conexão segura (Figura 4D,E). NOTA: O conector ZIF usado aqui é um conector de 18 canais, enquanto o dispositivo usado aqui tem 16 canais. Os canais extras não contatados são facilmente identificados como um circuito aberto por meio de testes de impedância durante as sessões de gravação.</li>
	<li>Teste a impedância eletroquímica dos eletrodos MXene usando um potenciostat para garantir a fabricação e conexão bem sucedidas com o adaptador PCB. NOTA: Valores razoáveis de impedância são dados na seção de discussão para ajudar na solução de problemas.</li>
</ol>4. Implantação aguda e gravação neural
NOTA: Cirurgias em ratos machos adultos Sprague Dawley são realizadas usando instrumentos estéreis e com técnica asséptica. A taxa respiratória, o reflexo palpebral e o reflexo da pitada de pedal são verificados a cada 10 min para monitorar a profundidade da anestesia. A temperatura corporal é mantida com uma almofada de aquecimento.
<ol><li>Administrar analgesia preventiva (injeção subcutânea de liberação sustentada de buprenorfina [SR], 1,2 mg/kg).</li>
	<li>Administrar anestesia (injeção intraperitoneal de uma mistura de 60 mg/kg de cetamina e 0,25 mg/kg dedexmedetomidina).</li>
	<li>Confirme o nível adequado de anestesia a cada 10 min ao longo do experimento, verificando se há ausência de reflexos palpebral e de pitada de pedal.</li>
	<li>Rato seguro em quadro estereotaxico, aplique lubrificante ocular aos olhos e limpe couro cabeludo raspado com 10% de povido-iodo.</li>
	<li>Exponha a calvaria com incisão única do couro cabeludo midline e dissecação contundente do tecido subjacente.</li>
	<li>Coloque um parafuso 00-90 no crânio para servir de chão para gravações.</li>
	<li>Usando uma broca dentária com uma pequena rebarba, faça uma craniotomia no local de gravação cortical desejado.</li>
	<li>Proteja o conector de matriz a um manipulador estereotaxic e posicione o dispositivo sobre a craniotomia. Suavemente mais baixo até que toda a matriz esteja em contato com o córtex exposto.</li>
	<li>Enrole o fio de chão ao redor do parafuso do crânio.</li>
	<li>Conecte o headstage do sistema de gravação à matriz e comece a registrar atividade espontânea.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O procedimento de síntese e delaminação mxene descrito neste protocolo (HF/HCl/LiCl) foi construído a partir da abordagem de gravação MILD que empregava um LiF/HCl (in situ HF) etchant médio26. A abordagem MILD permite que grandes flocos Ti3C2 (vários μm em tamanho lateral) sejam espontaneamente delaminados durante a lavagem uma vez que pH ~5-6 tenha sido alcançado. Em comparação com a gravação apenas com HF, isso resulta em material com maior qualidade e melhoria de propried...

Entender os mecanismos fundamentais subjacentes aos circuitos neurais e como sua dinâmica é alterada em doenças ou lesões, é um objetivo crítico para o desenvolvimento de terapêuticas eficazes para uma ampla gama de distúrbios neurológicos e neuromusculares. As tecnologias de microeletrodos têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural em escalas espaciais e temporais finas. No entanto, obter gravações estáveis com alta relação sinal-ruído (SNR) a partir de eletrodos de microescala provou ser particularmente desafiador. À medida que as dimensões dos eletrodos são reduzidas à aproximação da escala celular, um aumento correspondente na impedância de eletrodos degrada a qualidade do sinal1. Além disso, inúmeros estudos têm demonstrado que eletrodos rígidos compostos por materiais eletrônicos convencionais de silício e metal produzem danos significativos e inflamação no tecido neural, o que limita sua utilidade para o registro a longo prazo2,3,4,5. Diante desses fatos, houve um interesse significativo no desenvolvimento de microeletrodos com novos materiais que podem reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual e podem ser incorporados em fatores de forma suave e flexível.
Um método comumente usado para reduzir a impedância da interface eletrodo-tecidual está aumentando a área sobre a qual espécies iônicas no fluido extracelular podem interagir com o eletrodo, ou a "área de superfície eficaz" do eletrodo. Isso pode ser alcançado através da nanopadronização6, roughening superficial7, ou eletroplating com aditivos porosos8,9. Os nanomateriais ganharam atenção significativa neste campo porque oferecem áreas de superfície específicas intrinsecamente altas e combinações únicas de propriedades elétricas e mecânicas favoráveis10. Por exemplo, nanotubos de carbono têm sido usados como revestimento para reduzir significativamente a impedância de eletrodos11,12,13, óxido de grafeno foi processado em eletrodos de sonda sem fio e flexíveis14, e o grafeno poroso piralificado a laser foi utilizado para eletrocorticografia flexível e de baixa impesão (micro-ECoG) eletrocógrafos15. Apesar de sua promessa, a falta de métodos de montagem escaláveis limitou a adoção generalizada de nanomateriais para eletrodos interligados neurais. Nanomateriais à base de carbono, em particular, são tipicamente hidrofóbicos, e, portanto, requerem o uso de surfactantes16, superácidos17, ou funcionalização superficial18 para formar dispersões aquosas para métodos de fabricação de processamento de soluções, enquanto métodos alternativos de fabricação, como deposição de vapor químico (DCV), normalmente requerem altas temperaturas incompatíveis com muitos substratos poliméricos19,20,21 ,22.
Recentemente, uma classe de nanomateriais bidimensionais (2D), conhecidos como MXenes, foi descrita que oferece uma combinação excepcional de alta condutividade, flexibilidade, capacitância volumétrica e hidrofilia inerente, tornando-os uma classe promissora de nanomateriais para eletrodos interficiais neurais23. MXenes são uma família de carbides de metal de transição 2D e nitrides que são mais comumente produzidos gravando seletivamente o elemento A de precursores em camadas. Estas são tipicamente fases MAX com a fórmula geral Mn+1AXn, onde M é um metal de transição precoce, A é um elemento de grupo 12-16 da tabela periódica, X é carbono e/ou nitrogênio, e n = 1, 2 ou 324. Os flocos mxene bidimensionais têm grupos funcionais de terminação de superfície que podem incluir hidroxilo (−OH), oxigênio (-O) ou fluorina (-F). Esses grupos funcionais tornam os MXenes inerentemente hidrofílicos e permitem modificação ou funcionalidade de superfície flexível. Da grande classe de MXenes, ti3C2 tem sido o mais estudado e caracterizado25,26,27. Ti3C2 mostra capacidade volumétrica notavelmente maior (1.500 F/cm3)28 do que o grafeno ativado (~60-100 F/cm3)29, carbonos derivados de carbóide (180 F/cm3)30, e filmes de gel de grafeno (~260 F/cm3)31. Além disso, ti3C2 mostra uma condutividade eletrônica extremamente alta (~10.000 S/cm)32, e sua biocompatibilidade tem sido demonstrada em diversos estudos33,34,35,36. A alta capacidade volumétrica dos filmes Ti3C2 é vantajosa para aplicações biológicas de sensoriamento e estimulação, pois eletrodos que exibem transferência de carga capacitiva podem evitar reações de hidrólise potencialmente prejudiciais.
Nosso grupo demonstrou recentemente matrizes flexíveis de microeletrodos Ti3C2, preparadas usando métodos de processamento de soluções, que são capazes de registrar tanto a microeletrocorticografia (micro-ECoG) quanto a atividade intracortical neuronal de piqueamento in vivo com o Alto SNR36. Estes eletrodos MXene mostraram impedância significativamente reduzida em comparação com eletrodos de ouro (Au) com tamanho, que podem ser atribuídos à alta condutividade de MXene e à área de superfície alta dos eletrodos. Neste protocolo, descrevemos os passos-chave para a fabricação de matrizes de microeletrodos planar de Ti3C2 MXene em substratos parylene-C flexíveis e utilizando-os in vivo para gravação intraoperatória de micro-ECoG. Este método aproveita a natureza hidrofílica da MXene, o que possibilita o uso de métodos de processamento de soluções simples e escaláveis, sem exigir o uso de surfactantes ou superácidos para alcançar suspensões aquosas estáveis. Essa facilidade de processabilidade pode permitir a produção econômica de biosensores MXene em escalas industriais, o que tem sido uma grande limitação para a adoção generalizada de dispositivos com base em outros nanomateriais de carbono. A principal inovação na fabricação de eletrodos está no uso de uma camada polimérica sacrificial para micropadronizar o MXene após o revestimento spin, um método adaptado da literatura sobre polipoli de solução processada (3,4-etilenoiophene):poly (sulfona estireno) (PEDOT:PSS) microelectrodes37,mas que não havia sido descrito anteriormente para o padrão MXene. As excepcionais propriedades elétricas de Ti3C2,juntamente com sua processabilidade e morfologia 2D fazem dele um material muito promissor para interfaces neurais. Em particular, o Ti3C2 oferece um caminho para superar a troca fundamental entre área geométrica de eletrodos e impedância de interface eletroquímica, fator principal de limitação para o desempenho de eletrodos em microescala. Além disso, o procedimento de fabricação descrito neste protocolo pode ser adaptado para produzir matrizes de eletrodos MXene de tamanhos e geometrias variados para diferentes paradigmas de gravação, e também pode ser facilmente adaptado para incorporar outras tintas condutoras além de MXene.

<table><tbody><tr><td>Parafuso 00-90</td><td>McMaster-Carr</td><td>90910A630</td><td>Parafuso de caveira em torno do qual o fio terra é enrolado</td></tr><tr><td>Controlador de estimulação/gravação de 128 canais</td><td>Intan Technologies</td><td></td><td>Um componente do sistema de gravação neural.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (PP) de 175 mL</td><td>Falcon</td><td>REF: 352076</td><td>Usado para lavar</td></tr><tr><td>o conector ZIF de passo de 0,5 mm de 18 posições</td><td>Molex</td><td>505110-1892</td><td>Usado para fazer a interface do conjunto de microeletrodos de parileno flexível com a placa adaptadora de PCB.</td></tr><tr><td>Conector macho de 18 posições em miniatura (.025"/.64mm)</td><td>Omnetics Connector Corporation</td><td>A79008-001</td><td>Usado para fazer a interface da placa adaptadora PCB com o headstage de gravação.</td></tr><tr><td>Conjunto de Plástico Descartável 3ML Pipetas Graduadas</td><td>de Transferência Rienar</td><td>Rienar-3ML-20PCS</td><td>Usado para transferir soluções de corrosão ou MXene</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga concial de polipropileno (PP) de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>REF: 352070</td><td>Usado para lavagem e seleção de tamanho</td></tr><tr><td>Al etchant Tipo A</td><td>Transene</td><td>060-0026000-QT</td><td>Para remover a camada de máscara de condicionamento de Al após o Parylene-C final.</td></tr><tr><td>Pó de alumínio, malha -325, 99,5% (base de metais), tamanho de partícula < 44 &micro; m</td><td>Alfa Aesar</td><td>CAS: 7429-90-5</td><td>Usado para síntese MAX</td></tr><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Software de design para desenhar fotomáscaras. As alternativas gratuitas incluem o DraftSight e o LayoutEditor.</td></tr><tr><td>Condicionador de óxido tamponado 6:1</td><td>JT Baker</td><td>1178-03</td><td>Para remover a camada de SiO2 para expor os contatos do eletrodo MXene no final do procedimento de fabricação.</td></tr><tr><td>Buprenorfina SR</td><td>Wildlife Pharmaceuticals</td><td></td><td>Analgesia para cirurgia de ratos</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Benchmark Z 446</td><td>Usado para lavagem e seleção de tamanho</td></tr><tr><td>Dexdomitor</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.13250.3</td><td>Anestesia para cirurgia</td></tr> de <tr><td>ratos Broca Fine</td><td>Science Tools</td><td>19007-07</td><td>Rebarbas para furadeira Furadeira</td></tr><tr><td>elétrica</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>Broca micromotor para craniotomias</td></tr><tr><td>Evaporador de feixe de elétrons</td><td>Kurt J. Lesker Company</td><td></td><td>Usado para evaporar Ti, Au e SiO2 durante a fabricação. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr><td>Fio terra</td><td>A-M Systems</td><td>781500</td><td>Fio de prata nu</td></tr><tr><td>Headspace Vial, vidro</td><td>Supelco</td><td>REF: 27298</td><td>Usado para armazenar soluções MXene</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (12.1N)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS: 7647-01-0</td><td>Corrosivo; material de ataque</td></tr><tr><td>Ácido fluorídrico, (solução de 48-51% em H2O)</td><td>Acros</td><td>CAS: 7664-39-3</td><td>Material de ataque</td></tr><tr><td>Júpiter II Sistema RIE</td><td>March Plasma Systems Inc.</td><td></td><td>Sistema de gravação RIE planar usado para gravar o Parylene-C usando plasma O2. A maioria das salas limpas universitárias tem um sistema de gravação RIE planar comparável.</td></tr><tr><td>Fita de poliimida padrão Kapton, 1/4"</td><td>DuPont</td><td></td><td>Usado para adicionar espessura à região da almofada de ligação Au da matriz de microeletrodos de parileno flexível para inserção no conector ZIF.</td></tr><tr><td>Hospital de Cetamina</td><td>da Univ. da Pensilvânia.</td><td></td><td>Anestesia para cirurgia de rato</td></tr><tr><td>KLA P-7 Stylus Profilometer</td><td>KLA Corporation</td><td></td><td>Usou os perfis 2D de medição para confirmar a corrosão completa através da camada de parileno-C sacrificial na etapa 2.4.2. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ou uma ferramenta de perfilômetro de caneta comparável.</td></tr><tr><td>Cloreto de lítio, 99% para análise, anidro</td><td>Acros</td><td>CAS: 7447-41-8</td><td>Higroscópico; material de delaminação</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara MA6</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>Usado para alinhar cada fotomáscara ao padrão no wafer e expor o wafer à luz UV. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr><td>Solução de limpeza Micro-90</td><td>International Products Corporation</td><td>M-9050-12</td><td>Usado como camada antiadesiva para permitir a remoção da camada de Parylene-C sacrificial para padronizar o fotorresistente MXene</td></tr><tr><td>NR71-3000p</td><td>Futurrex Inc.</td><td>NR71-3000p</td><td>Fotorresistente negativo utilizado para definir traços de Ti/Au e padrões MXene nos dispositivos.</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.63200.3</td><td>Para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Sistema de deposição de parileno</td><td>Sistemas</td><td></td> de revestimento especiais <td>Usado para evaporar filmes finos isolantes de Parylene-C</td></tr><tr><td>Dímero de Parylene-C</td><td>Sistemas de revestimento especial</td><td>980130-c-01lbe</td><td>Polímero flexível usado como camadas passivantes inferiores e superiores para os dispositivos</td></tr> <tr><td>MXene flexíveisFotomáscaras (cromo sobre vidro sodo-cálcico)</td><td>Universidade da Pensilvânia</td><td></td><td>Nossas fotomáscaras foram produzidas na sala limpa da Universidade usando um sistema de gravação a laser Heidelberg DWL66+, no entanto, vários fornecedores fabricam fotomáscaras a partir de arquivos de design fornecidos.</td></tr><tr><td>Solução de iodopovidona</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td>Para ajudar a prevenir infecções ao redor da incisão no couro cabeludo</td></tr> <tr><td>Circuitos</td><td></td><td>Avançados da Placa de Circuito Impresso (PCB)</td> <td>Usado para fazer a interface entre o feixe de eletrodos MXene e a eletrônica de medição, como o potenciostato e o sistema de gravação Intan. A Advanced Circuits e outros fornecedores fabricam e montam PCBs com base nos arquivos de design fornecidos.</td></tr><tr><td>Desenvolvedor RD6</td><td>Futurrex Inc.</td><td>RD6 Revelador</td><td>Utilizado para desenvolver o fotorresistente negativo NR71-3000p após exposição aos raios UV</td></tr><tr><td>Referência 600 potenciostato</td><td>Gamry Instruments</td><td></td><td>Utilizado para medir a impedância dos eléctrodos para avaliar a qualidade dos dispositivos</td></tr><tr><td>Removedor PG</td><td>MicroChem Corp.</td><td>G050200</td><td>Usado para remover NR71-3000p após deposição de metal para realizar padrões de decolagem</td></tr><tr><td>RHS2000 cabo de interface Stim SPI</td><td>Intan Technologies</td><td></td><td>Um componente do sistema de gravação neural.</td></tr><tr><td>RHS2116 placa amplificadora</td><td>Intan Technologies</td><td></td><td>Um componente do sistema de gravação neural.</td></tr><tr><td>Bolachas de si</td><td>Wafer World</td><td>2885</td><td>Substrato para fabricação</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Equipamento</td><td></td> econômico <td>Para revestimento de wafers com resiste e aplica as camadas Micro-90 e MXene. A maioria das salas limpas da universidade tem revestidores giratórios.</td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 902</td><td>Para posicionar o rato para neurocirurgia</td></tr><tr><td>Barra de agitação magnética revestida de Teflon</td><td>Corning</td><td>REF: 1233W95</td><td>Usado para mexer durante a gravação e intercalação</td></tr><tr><td>Carbeto de titânio, 99,5% (base de metais), tamanho de partícula ~2 &micro; m</td><td>Alfa Aesar</td><td>CAS: 12070-08-5</td><td>Usado para síntese MAX</td></tr><tr><td>Pó de titânio, malha -325, 99% (base de metais), tamanho de partícula < 44&micro; m</td><td>Alfa Aesar</td><td>CAS: 7440-32-6</td><td>Usado para síntese MAX</td></tr><tr><td>Sonicador de banho ultrassônico</td><td>Reynolds Tech</td><td></td><td>Para remover partículas de metal e fotorresistente durante os processos de decolagem para padronizar metais.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV vis</td><td>ThermoScientific</td><td>Evolution 201</td><td>Usado para determinar a concentração e observar o pico de absorção</td></tr><tr><td>Zetasizer, Análise de Tamanho de Partícula</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>Usado para determinar a distribuição do tamanho lateral da partícula</td></tr></tbody></table>

fabricação de matrizes de microeletrodo ti3c2 mxene para gravação neural in vivo

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

As tecnologias de microeletrodos implantáveis têm sido amplamente utilizadas para elucidar a dinâmica neural na microescala para obter uma compreensão mais profunda dos fundamentos neurais de doenças cerebrais e lesões. Como os eletrodos são miniaturizados à escala de células individuais, um aumento correspondente na impedância da interface limita a qualidade dos sinais registrados. Além disso, os materiais de eletrodos convencionais são rígidos, resultando em uma significativa incompatibilidade mecânica entre o eletrodo e o tecido cerebral circundante, o que provoca uma resposta inflamatória que eventualmente leva a uma degradação do desempenho do dispositivo. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um processo para fabricar microeletrodos flexíveis baseados em Ti3C2 MXene, um nanomaterial recentemente descoberto que possui notável alta capacidade volumétrica, condutividade elétrica, funcionalidade de superfície e capacidade de processamento em dispersões aquosas. Matrizes flexíveis de microeletrodos Ti3C2 MXene têm uma impedância notavelmente baixa devido à alta condutividade e alta área de superfície específica dos filmes Ti3C2 MXene, e eles provaram ser requintadamente sensíveis para registrar atividade neuronal. Neste protocolo, descrevemos um novo método para micropadronizar Ti3C2 MXene em matrizes de microeletrodos em substratos poliméricos flexíveis e delinear seu uso para gravação de microeletrocorticografia ao vivo. Este método pode ser facilmente estendido para criar matrizes de eletrodos MXene de tamanho arbitrário ou geometria para uma gama de outras aplicações em bioeletrônica e também pode ser adaptado para uso com outras tintas condutoras além de Ti3C2 MXene. Este protocolo permite a fabricação simples e escalável de microeletrodos a partir de tintas condutoras baseadas em soluções, e especificamente permite aproveitar as propriedades únicas de icti3C 2 MXene para superar muitas das barreiras que há muito dificultam a adoção generalizada de nanomateriais à base de carbono para microeletrodos neurais de alta fidelidade.

Os dados de micro-ECoG de amostra registrados em uma matriz de microeletrodo MXene são mostrados na Figura 5. Após a aplicação da matriz de eletrodos no córtex, sinais fisiológicos claros foram imediatamente aparentes nos eletrodos de gravação, com aproximadamente 1 mV de amplitude ECoG aparecendo em todos os eletrodos MXene. Espectros de energia desses sinais confirmaram a presença de dois ritmos cerebrais comumente observados em ratos anestesia de cetamina-dexmedetomidina: oscilações lenta...

Descrevemos aqui um método para fabricar matrizes de microeletrodos Ti3C2 MXene e utilizá-las para gravação neural in vivo.

Fabricação de Matrizes de microeletrodo Ti3C2 MXene para gravação neural in vivo

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Este protocolo de síntese produz tinta MXene de alta qualidade com uma condutividade metálica que atinge acima de 10.000 Siemens por centímetro. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a micro-padronização precisa dos filmes MXene sem danificar o filme ou deixar resíduos nocivos nos eletrodos. Para preparar uma tinta de carboneto de titânio, adicione lentamente dois gramas de precursor de carboneto de alumínio de titânio a um recipiente de reação de 125 mililitros contendo solução de gravura seletiva e misture a solução com uma barra magnética Teflon por 24 horas a 35 graus Celsius a 400 rotações por minuto.No final da incubação, adicione 50 mililitros de água deionizada a dois tubos de centrífuga de 175 mililitros, divida a mistura de reação de gravura igualmente entre os tubos e encha a marca de 150 mililitros. Lave o material por centrifugação repetida, decantando o supernanato ácido em um recipiente de resíduos perigosos plásticos e adicionando água doce aos tubos entre etapas de centrifugação até que o pH da solução sobrenante chegue acima do pH seis. Para a intercalação das moléculas entre partícula MXene multicamadas para enfraquecer fora das interações de plano, adicione dois gramas de cloreto de lítio a 100 mililitros de água desionizada e mexa a solução a 200 rotações por minuto.Quando o cloreto de lítio for dissolvido, misture 100 mililitros da solução de cloreto de lítio com o sedimento de carboneto de alumínio de titânio de titânio. Transfira a solução de volta para o recipiente plástico de 125 mililitros e mexa a reação por 12 horas a 25 graus Celsius e 200 rotações por minuto. Para a delaminação da partícula multicamadas a granel em um único a poucos camadas de carboneto de titânio MXene, lave a solução de intercalação com múltiplas centrífugas, decantando o supernatante claro até que um supernatante escuro seja observado.Em seguida, centrifugar o supernatante escuro por uma hora antes de decantar o supernatante verde diluído. Redisperse o sedimento inchado com 150 mililitros de água deionizada e divida a solução igualmente em três tubos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar as amostras para separar o sedimento MXene restante do supernatante MXene e juntar os supernantes em um único recipiente.Em seguida, centrifufique a solução por mais uma hora para seleção de tamanho adicional e otimização da solução para isolar simples a poucos flocos de camada. Para fabricação de matriz de microeletrodes de carboneto de titânio, deposite uma camada inferior de quatro micrômetros de parileno-C em um wafer de silício limpo. Para usar a fotolitografia para definir padrões metálicos no wafer, gire o fotoresist do casaco no wafer a 3.000 rotações por minuto durante 40 segundos antes de assar suavemente o wafer em uma placa quente por 14,5 minutos a 95 graus Celsius.Em seguida, carregue o wafer e mascara um em um alinhador de máscara com o wafer posicionado para que o anel na máscara de foto se sobreponha a todas as bordas do wafer. Exponha o wafer com 365 comprimentos de onda de 365 nanômetros de linha ocular a uma dose quadrada de 90 milímetros e asse duramente o wafer em uma placa quente por um minuto a 115 graus Celsius. No final do cozimento duro, mergulhe o wafer no desenvolvedor RD6 por dois minutos com agitação contínua antes de enxaguar completamente com água deionizada e soprar secando com uma arma de nitrogênio.Use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 10 nanômetros de titânio seguido de 100 nanômetros de ouro no wafer. Em seguida, mergulhe o wafer em stripper solvente por cerca de 10 minutos até que o fotoresiste tenha dissolvido e o excesso de metal tenha totalmente levantado. Uma vez que a decolagem pareça completa, sonicize o wafer por 30 segundos para remover quaisquer vestígios restantes de metal indesejado e enxaguar o wafer com stripper solvente fresco e água desionizada antes de secar com uma arma de nitrogênio.No final do processo de decolagem, o ouro será visível nos traços de interconexão desejados e no anel ao redor da borda do wafer. Para a deposição da camada sacrificial Parileno-C, primeiro exponha o wafer ao plasma de oxigênio por 30 segundos para tornar a camada básica parileno-C hidrofílica antes de girar a solução de limpeza diluída no wafer a 1.000 rotações por minuto durante 30 segundos. Deixe o wafer secar pelo menos cinco minutos antes de depositar três micrômetros de Parileno-C no wafer, como demonstrado.Após uma segunda rodada de fotolitografia usando a máscara dois, use gion reativo de plasma de oxigênio para gravar através da camada sacrificial Parileno-C nas áreas não cobertas pelo fotoresist para definir os eletrodos e traços MXene. A gravura deve se sobrepor parcialmente com as interconexões de ouro de titânio, bem como o anel ao redor das bordas do wafer. Em seguida, use um perfil para medir o perfil entre as interconexões de titânio e ouro expostas e a camada parileno-C inferior para confirmar uma gravação completa da camada sacrificial Parylene-C.Para girar a solução MXene no wafer, primeiro dispense a solução em cada um dos padrões MXene desejados antes de girar o wafer a 1.000 rotações por minuto durante 40 segundos. Seque o wafer em uma placa quente de 120 graus Celsius por 10 minutos para remover qualquer água residual do filme MXene e, em seguida, use um evaporador de feixe de elétrons para depositar uma camada protegida de dióxido de silício de 50 nanômetros no wafer. Para remover a camada sacrificial Parylene-C, coloque uma pequena gota de água deionizada na borda do wafer e use pinças para descascar a camada sacrificial Parylene-C a partir de onde as bordas da camada são definidas no anel ao redor do wafer.Em seguida, enxágue o wafer completamente com água deionizada fresca para remover qualquer resíduo restante da solução de limpeza e secar o wafer com uma arma de nitrogênio. Coloque o wafer seco em uma placa quente de 120 graus Celsius durante uma hora para remover qualquer água residual dos filmes MXene padronizados antes de depositar uma camada de quatro micrômetros de espessura de Parileno-C no wafer, como demonstrado. Depois de realizar outra rodada de fotolitografia com a máscara três, use um evaporador de feixe de elétrons para depositar 100 nanômetros de alumínio no wafer e imergir o wafer em stripper solvente por 10 minutos até que o metal tenha completamente levantado do wafer.Após a sonicação, lavagem e secagem como demonstrado, o alumínio pode ser observado cobrindo os dispositivos com aberturas para os eletrodos e almofadas de ligação. Use gion reativo de plasma de oxigênio para gravar através das camadas Parylene-C que circundam os dispositivos e através da camada superior Parylene-C cobrindo tanto os contatos de eletrodos MXene quanto as almofadas de ligação de ouro. Quando nenhum resíduo de Parileno-C permanecer no wafer entre os dispositivos, use uma etch química molhada no etchant de alumínio tipo A a 50 graus Celsius por 10 minutos ou até que um minuto se passou quando todos os traços visuais do alumínio desapareceram.Para gravar o óxido de silício que cobre os eletrodos MXene, use uma gravação química molhada em etchant de óxido tamponado de seis para um por 30 segundos. Em seguida, coloque uma pequena gota de água deionizada no final do dispositivo. Retire suavemente o dispositivo como a água é perversa sob o dispositivo por ação capilar para liberar o dispositivo do wafer de substrato de silício.Aqui, dados de micro-eletrocorticografia de amostra registrados em uma matriz de microeletrodos MXene são mostrados. Os estados putativos de DOWN cortical são baseados no cocho da oscilação lenta em um a dois hertz. Após a aplicação da matriz de eletrodos no córtex, sinais fisiológicos claros foram imediatamente aparentes nos eletrodos de gravação com aproximadamente um sinal de eletrocorticografia de amplitude milivolt aparecendo em todos os eletrodos MXene.Espectros de energia desses sinais confirmaram a presença de dois ritmos cerebrais comumente observados em ratos sob anestesia de dexmedetomidina de cetamina, oscilações lentas de um a dois hertz e oscilações gama de 40 a 70 hertz. Além disso, foi observada uma atenuação de energia de banda larga durante o estado DOWN da oscilação lenta e uma faixa beta de 15 a 30 hertz e de 40 a 120 hertz durante o estado UP da oscilação lenta. A otimização do método de síntese permitiu a expansão do uso de MXenes em outras aplicações, como em dispositivos optoeletrônicos, têxteis inteligentes e muito mais.Este procedimento envolve o uso de produtos químicos perigosos, incluindo ácido fluorídrico, etchant de alumínio e desenvolvedor fotoresist. Certifique-se de sempre usar os EPI apropriados ao manusear esses produtos químicos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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