Name: Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a gerar organóides mamários mosaicos por tripsinização diferencial para biologia celular usando células de glândula mamária de camundongo. Este método preserva a integridade celular para cultura 3D.

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Agradecemos a Ben Abrams pela assistência técnica e apoio do Instituto de Biologia de Células-Tronco da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC). Agradecemos a Susan Strome e Bill Saxton pelo uso de seu Microscópio Confocal do Disco Giratório Solamere. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios à UCSC do Howard Hughes Medical Institute através do James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), do NIH (NIH GM058903) para a iniciativa de maximizar o desenvolvimento estudantil (H.M.) e de a Fundação Nacional de Ciência para uma bolsa de pós-graduação em pesquisa (O.C. DGE 1339067) e por uma bolsa (A18-0370) do Comitê Coordenador de Pesquisa de Câncer da UC (LH).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Santa Cruz.
1. Dia 1: Digestão da glândula mamária
<ol><li>Prepare-se para colher os GMs de camundongos maduros de 10 a 14 semanas de idade.<ol>
<li>Realize a colheita em um banco aberto condições assépticas.</li>
		<li>Esterilize todos os suprimentos cirúrgicos, placas de cortiça e pinos por autoclaving e imersão em 70% de álcool por 20 min antes da cirurgia.</li>
		<li>Anestesiar animais com pentobarbital de sódio (dose anestéstica 2X de 0,06 mg/g de peso corporal) entregue através de injeção intraperitoneal com uma seringa de insulina de 0,5 mL.</li>
		<li>Monitore o nível de anestesia apertando os dedos do animal para verificar se há uma resposta reflexo e inicie o protocolo somente após o animal ser totalmente anestesiado.</li>
		<li>Coloque o animal de costas, fixe seus apêndices no quadro de cortiça, e limpe seu abdômen e peito com etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para colher o #2, 3, 4 e 5 MGs de um rato (ou seja, 8 MGs, Figura 1A), identifique a linha média entre as duas pernas traseiras e faça uma pequena incisão (1 cm) na pele abdominal com uma tesoura afiada, depois estenda o corte até o pescoço18.</li>
	<li>Siga fazendo pequenos cortes lateralmente em direção às pernas e braços para permitir a liberação da pele usando um cotonete. Puxe a pele para longe e estique-a bem antes de fixá-la em um lado (Figura 1B, passo 1)18. Remova os GMs cortando-os e remova os linfonodos das glândulas #4(Figura 1B, passos 2, 3)18. Repita o procedimento do outro lado do corpo.</li>
	<li>Coletar o tecido MG em 50 mL de 4 °C De Mídia de Águia Modificada (DMEM)/Mistura de Nutrientes F12 (F12) suplementada com 5% de soro bovino fetal (FBS) e 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti-anti)18.</li>
	<li>Pique as glândulas em um prato de 35 mm ou em uma placa de cerâmica usando uma lâmina de barbear ou um helicóptero de tecido. Gire a placa a cada cinco costeletas manuais ou cada rodada no helicóptero de tecido até que os pedaços de tecido possam caber através de uma ponta de micropipete de 1 mL com facilidade (~0,1 mm/fragmento, Figura 1C).</li>
	<li>Digerir os GMs no meio de digestão (ver Tabela 1) para 14 horas em um prato de adesão 6 bem baixo a 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>2. Dia 2: Isolamento de fragmentos de tecido epitelial mamário
<ol><li>Após 14 h de digestão, misture suavemente o tecido digerido 10X usando uma micropipeta de 1 mL para quebrar qualquer estroma restante ou tecido adiposo, garantindo que nem bolhas nem força mecânica em excesso sejam geradas. NOTA: Se houver digestão incompleta após 14 h, isso pode ser devido ao acúmulo de DNA de cisalhamento. Neste caso, adicione 1 μL de 1 mg/mL dedesoxribonuclease I (DNase I) por 2 mL de Digestion Medium. Incubar por mais 30 min a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Coletar tecido em um tubo de 15 mL e enxaguar o poço utilizado para digestão com 2-3 mL de cultura tecidual grau 1X Salino tamponado de fosfato de Dulbecco livre de Ca2+ e Mg2+. Centrífuga a 600 x g por 10 min.</li>
	<li>Evacuar o sobrenadante contendo a camada lipídica e o meio, e depois resuspender a pelota em 5 mL de DPBS e mudar para um novo tubo de 15 mL. Centrífuga a 600 x g por 10 min.</li>
	<li>Durante a centrifugação coloque um filtro de células de nylon de 70 μm em um tubo de 50 mL e predefina o coador usando 10 mL de 37 °C DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspender fragmentos de tecido da etapa 2.4 do protocolo usando 5 mL de DPBS e passar a suspensão através de um coador de células de nylon de 70 μm para remover células estrômicas e células únicas(Figura 1D).</li>
	<li>Colete os fragmentos de tecido no filtro celular. Enxágüe 4X com 10 mL de 37 °C DMEM/F12(Figura 1D). ATENÇÃO: A lavagem incompleta resultará em culturas contaminadas com células não epiteliais.</li>
	<li>Solte os fragmentos de tecido segurando a aba do coador com dedos enluvados, invertendo o coador sobre um prato de cultura de tecido de 60 mm e passando alíquotas de 1 mL de Meio de Manutenção (ver Tabela 1) através da parte inferior do coador 4X(Figura 1E).</li>
	<li>Verifique o filtro para remanescentes de fragmentos de tecido, que serão visíveis a olho nu, e enxágue o filtro 1X mais com 1 mL de Meio de Manutenção se algum fragmento ainda estiver aderindo ao coador. Os fragmentos de tecido enxaguado devem agora estar livres de células estrômicas.</li>
	<li>Examine rapidamente o prato de 60 mm contendo os fragmentos mg da etapa 2.9 do protocolo um microscópio invertido (objetivo 4X ou 10X, Figura 1F). Uma preparação típica de oito MGs produz ~500 fragmentos. Procure por células individuais ou gotículas de gordura e se há células contaminantes. NOTA: Se houver células contaminantes, repita a etapa de filtragem coletando o prato médio e fragmentado da antena de 60 mm usando uma pipeta de 5 mL e filtrando o fragmento novamente através de um filtro de 70 μm fresco, repetindo as etapas do protocolo 2.6, 2.8-2.10.</li>
	<li>Incubar 24 h a 37 °C, 5% CO2, permitindo que o fragmento de tecido adere e gere fragmentos bicamadas(Figura 2A). NOTA: Se os fragmentos não tiverem sido instalados até 24 h, continue a incubar até que sejam aderidos. Se os fragmentos não aderirem bem, a separação dos compartimentos das células não funcionará. Se os pesquisadores estão preocupados com a adesão, as placas de cultura de tecido podem ser tratadas para promover o apego ao fragmento (por exemplo, poli-L-lisina).</li>
</ol>3. Dia 3: Trippsinização diferencial de células epiteliais mioepitelélicas e luminais
<ol><li>Para separar myoECs dos LECs, esvazie a mídia do prato, enxágue 1x com 1 mL de DPBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA fresca (0,05%), e monitore cuidadosamente a digestão um microscópio invertido (objetivo 10X ou 20X, Figura 2B,C,F). O desprendimento da camada myoec externa exigirá 3-6 min, dependendo da tripsina-EDTA (0,05%) Força. NOTA: Consulte a Figura 2 para obter imagens representativas que mostrem esse processo. iluminação brightfield, os MyoECs aparecem arredondados e têm uma aparência mais brilhante em comparação com os LECs, que permanecem aderidos no centro e parecem mais escuros.</li>
	<li>Coletar a fração MyoEC em um tubo de 15 mL contendo 2 mL 10% FBS/DPBS. Sem perturbar os LECs, enxágue suavemente o prato de 60 mm com 2 mL de DPBS e depois descarte o DPBS(Figura 2H-I). NOTA: A recuperação usual para MyoECs está dentro de uma faixa de (3,5 x 106-1,5 x 106) dependendo do tamanho dos MGs.</li>
	<li>Para remover a fração LEC, adicione 1 mL de trypsin-EDTA (0,05%) para o prato novamente e incubar 7-15 min, monitorando cuidadosamente para evitar a superdigestão. Saciar o trypsin-EDTA (0,05%) no prato com 2 mL de 10% FBS/DPBS. Coletar a fração LEC em um novo tubo de 15 mL. NOTA: A recuperação usual dos LECs está dentro de um intervalo (2 x 106-4,2 x 106) dependendo do tamanho dos GMs. Rotineiramente, a pureza de ambas as frações assimétricas é ~90%19 (Figura 2E).</li>
	<li>Centrifugagem de cada fração por 5 min a 300 x g para remover a tripsina-EDTA (0,05%). Resuspender a pelota em 250 μL de Meio de Manutenção e contar cada população celular usando um hemocytometro ou contador de células automatizado. Coloque as células no gelo enquanto conta. NOTA: Se a manipulação genética das frações celulares for desejada, as células primárias podem ser cultivadas em pratos de baixa adesão e infectadas com lentivírus20.</li>
</ol>4. Dia 3: Combinar e incorporar frações celulares em uma matriz extracelular
NOTA: Uma vez que as frações MyoEC e LEC tenham sido coletadas e contadas, elas podem ser combinadas. A relação típico MyoEC/LEC é 1:3 (Figura 3A)19. Diferentes estudos podem ser realizados. Por exemplo, para realizar estudos de mosaico, as frações podem ser geradas a partir de ratos do tipo selvagem (WT) e mut (Mut) e combinadas (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, ou frações podem ser combinadas usando diferentes proporções de MyoECs/LECs19.
<ol><li>Com base na contagem celular, calcule o número de poços (8 câmaras de poços, ver Tabela de Materiais) que precisam ser preparados para 12.000 células/poço (por exemplo, 3.000 MyoECs:9.000 LECs).</li>
	<li>Estabeleça a camada base para a cultura 3D adicionando 90 μL de 50% de ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sem fenol vermelho - ver a Tabela de Materiais) a cada poço. Certifique-se de que não há bolhas e os poços são revestidos uniformemente. Para solidificar a camada de base, incubar as lâminas a 37 °C, 5% CO2 por 30 min. NOTA: O ECM precisa permanecer frio até esta etapa, caso contrário, polimerizará prematuramente e levará a revestimento de base desigual e polimerização. O uso de um ECM base aumenta o crescimento organóide em um único plano, o que auxilia na captura de imagens. Isso também obtém crescimento organóide mais rápido e usa menos ECM22.</li>
	<li>Durante a polimerização, prepare as misturas celulares. Pelotas as frações MyoEC e LEC a 300 x g por 5 min e resuspender cada fração celular em 10% ECM /90% De Crescimento Médio para que cada poço tenha 100 μL (ver Tabela 1 para como fazer O Meio de Crescimento). NOTA: Para facilitar a preparação, replique poços usando as mesmas misturas celulares. Estes podem ser combinados e preparados em um tubo (por exemplo, quatro poços da mesma mistura celular podem ser preparados em 400 μL de 10% de ECM/90% de crescimento médio).</li>
	<li>Adicione 100 μL de cada mistura celular em 10% de ECM/90% de crescimento Médio para cada poço e permita que os organóides se contentem com 20 min a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Uma vez que as células tenham se acomodado, adicione suavemente 100 μL de Meio de Crescimento, encanando suavemente a parede da câmara de cada poço. Incubar os slides a 37 °C, 5% CO2 (ver Figura 3A para a composição total de cada poço). NOTA: O inibidor de Rho Kinase, R-spondin e Nrg1 são fatores que foram identificados como importantes para a cultura de longo prazo de organóides cultivados a partir de células mamárias primárias de murina e células de câncer de mama humanas13,14. Além disso, os fatores de células-tronco B27 e N2 ampliam o tempo que os organóides podem ser cultivados.</li>
	<li>Células de imagem a cada 24 h para acompanhar seu crescimento e renovar suavemente o Meio de Crescimento a cada 2-3 dias usando 100 μL/poço(Figura 3B-E). NOTA: Tenha extrema cuidado ao renovar o meio. Incline os slides da câmara para coletar o meio em um canto dos poços. Remova ≤100 μL do meio e reabasteca com o cuidado de deixar a camada de ECM intacta.</li>
	<li>Se os pesquisadores estiverem interessados em investigar a lactação/alveologênese, mude para Alveologenesis Medium (ver Tabela 1) no dia 5 e continue a renovar o meio a cada 2-3 dias até o dia 10 (Figura 3F) ou além de passar por meio de solução de recuperação (ver tabela de materiais)13. NOTA: Neste ponto, os organóides podem ser isolados do ECM incubando a 4 °C em 400 μL de solução de recuperação de 4 °C (ver Tabela de Materiais para informações de protocolo e reagente).</li>
</ol>5. Dia 5 ou 10: Fixação e imunocoloração organóides
<ol><li>Remova o meio cuidadosamente, encanando suavemente a mídia (uma pipeta de bulbo funciona melhor). Enxágüe cada poço usando 200 μL de 1x de Salino Tampão de Fosfato de Dulbecco (DPBS, veja receitas).</li>
	<li>Fixar os organóides usando frio (4 °C) 4% (c/v) paraformaldeído (PFA, ver receitas) por 10 min à temperatura ambiente. ATENÇÃO: PfA é perigoso. Use equipamentos de proteção individual (jaleco, luvas e óculos de segurança). Esta etapa deve ser realizada dentro de uma capa de fumaça. NOTA: O ECM é dissolvido pelo tratamento PFA. A remoção incompleta do ECM pode levar à coloração do fundo quando os organóides são analisados pela imunofluorescência.</li>
	<li>Remova o PFA de 4% e adicione 200 μL de 0,2% (c/v) de glicina/DPBS (ver Tabela 1) a cada poço. Incubar os slides à temperatura ambiente durante 30 min ou 4 °C durante a noite em uma superfície de balanço definida para um ajuste lento. NOTA: Os organóides podem ser armazenados por 1-3 dias em DPBS a 4 °C antes do próximo passo.</li>
	<li>Permeabilizar os organóides usando DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, ver Tabela 1) por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloqueie os organóides usando soro de burro de 5% (DS) (ou outro soro que corresponda às espécies do anticorpo secundário) em DPBS por 1 h em uma superfície de balanço. NOTA: Esta etapa pode ser realizada durante a noite a 4 °C em uma superfície de balanço.</li>
	<li>Prepare anticorpos primários em 1% de DS/DPBS. Use 125-200 μL para cada poço. Realize a imunocoloração incubando os organóides em anticorpos primários durante a noite a 4 °C em uma superfície de balanço.</li>
</ol>6. Dia 11: Imunofluorescência completa
<ol><li>Lave cada poço 2X com 200 μL PBST por 5 min. Adicione anticorpo secundário em 1% DS/DPBS usando 125-200 μL para cada poço. Incubar à temperatura ambiente em uma superfície de balanço por 45 min.</li>
	<li>Lave cada poço 2X usando 200 μL PBST por poço.</li>
	<li>Manche os núcleos usando dine de DNA hoechst em DPBS (1:2.000 em DPBS) por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova todo o líquido deixado no poço, aspirando suavemente com um vácuo.</li>
	<li>Remova cuidadosamente as câmaras e a junta, coloque uma gota (~30 μL) de mídia de montagem (ver Tabela de Materiais)em cada poço e deslizamento de cobertura, tomando cuidado para remover bolhas. Deixe o escorregador secar em um espaço escuro por 1-2 dias. Vedação com esmalte claro. Imagem dos organóides em um microscópio confocal(Figura 3E-F).</li>
</ol>

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<li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).</li>
<li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li>
<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui, um método é apresentado detalhando como os pesquisadores podem gerar culturas organóides 3D usando células MG primárias. A diferença entre este e outros protocolos é que detalhamos um método para separar os dois compartimentos de células MG distintos: os MyoECs basais externos e lecs internos. Nosso método emprega uma trypsin-EDTA de duas etapas (0,05%) tratamento que chamamos de trippsinização diferencial19. Este procedimento permite que os pesquisadores isolem MyoECs e LECs sem usar citome...

A glândula mamária (MG) é uma estrutura epitelia tubular em forma de árvore embutida dentro de um estroma rico em adrócitos. O epitélio ductal bicamada compreende uma camada externa, basal de contratura, células mioepitelélicas (MioECs) e uma camada interna de células epiteliais luminais e secretas (LECs), circundando um lúmen central1. Durante a lactação quando os MyoECs externos se contraem para espremer leite dos LECs alveolares internos, o MG sofre inúmeras alterações que estão o controle de fatores de crescimento (por exemplo, EGF e FGF) e hormônios (por exemplo, progesterona, insulina e prolactina). Essas alterações causam a diferenciação de estruturas especializadas, aveoli, que sintetizam e secretam o leite durante a lactação1. A epitelia mamária pode ser manipulada experimentalmente usando técnicas nas quais fragmentos de tecido epitelial, células ou mesmo uma única célula basal são transplantados em almofadas de gordura mamária hospedeira, pré-limpas de parênquima mamária endógena, e permitidas a crescer para reconstituir uma árvore epitelial completaefuncional 2,3,4,5. O transplante é uma técnica poderosa, mas é demorada e impossível se uma mutação resultar em letalidade embrionária precoce (antes do E14) que impede o resgate de anlaga mamária transplantável. Além disso, os pesquisadores frequentemente desejam pesquisar os papéis dos dois compartimentos diferentes, que são derivados de células progenitoras restritas à linhagem. Embora a tecnologia Cre-lox permita a manipulação genética diferencial de MyoECs e LECs, esta também é uma empresa demorada e cara. Assim, desde a década de 1950, os pesquisadores têm usado organóides mamários in vitro como uma maneira relativamente fácil e eficiente de abordar questões relativas à estrutura e função do tecido mamário6,7.
Nos protocolos iniciais que descrevem o isolamento e a cultura das células epiteliais mamárias primárias, os pesquisadores descobriram que uma matriz de membrana de porão (BME), composta por um coágulo de plasma e extrato de embrião de frango, era necessária para fragmentos de MG cultivados em um prato6. Nas décadas seguintes, matrizes extracelulares (ECMs, colágeno e matriz de proteínas geleias secretadas por células de sarcoma de murina Engelbreth-Holm-Swarm) foram desenvolvidas para facilitar a cultura 3D e imitar melhor o ambiente in vivo7,8,9,10. O cultivo de células em matrizes 3D revelou por múltiplos critérios (morfologia, expressão genética e resposta hormonal) que tal microambiente melhor modela em processos fisiológicos vivos9,,10,,11,12. Pesquisas utilizando células murinaprimárias identificaram fatores-chave de crescimento e morfogênios necessários para a manutenção prolongada e diferenciação dos organóides13. Esses estudos prepararam o cenário para o protocolo aqui apresentado, e para a cultura das células mamárias humanas como organóides 3D, que hoje é uma ferramenta clínica moderna, permitindo a descoberta de medicamentos e testes de drogas em amostras de pacientes14. No geral, a cultura organóide destaca as capacidades de auto-organização das células primárias e suas contribuições para a morfogênese e diferenciação.
Apresentado aqui é um protocolo para a epiteria murina cultural que pode ser diferenciada em acini produtor de leite. Uma técnica diferencial de trypsinização é usada para isolar os MyoECs e LECs que compõem os dois compartimentos celulares MG distintos. Essas frações de células separadas podem então ser geneticamente manipuladas para superexpressá-la ou derrubar a função genética. Como a linhagem intrínseca, a auto-organização é uma propriedade inata das células epiteliais mamárias15,,16,17, recombinando essas frações celulares permite que os pesquisadores gerem organóides bicamadas e mosaicos. Começamos digerindo enzimticamente o tecido adiposo e, em seguida, incubando os fragmentos de mamária em um prato de cultura de tecido por 24 h (Figura 1). Os fragmentos de tecido se instalam em pratos de poliestireno como fragmentos bicamadas com sua organização in vivo: camada mioepitelial externa em torno de camadas luminais internas. Esta organização celular permite o isolamento dos MyoECs externos por trypsin-EDTA (0,05%) tratamento para 3-6 min seguido de uma segunda rodada de trypsin-EDTA (0,05%) tratamento que destaca os LECs internos restantes(Figura 2). Assim, esses tipos de células com sensibilidade à tripsina diferente são isolados e podem, posteriormente, ser misturados e banhados em ECM (Figura 3). As células passam por auto-organização para formar esferas bicamadas, compreendendo uma camada externa de MyoECs em torno de LECs internos. A formação de lúmen ocorre à medida que as células crescem em um meio contendo um coquetel de fatores de crescimento (ver receitas para o Meio de Crescimento)13. Após 5 dias, os organóides podem ser diferenciados em acini produtores de leite, mudando para Alveologenesis Medium (ver receitas e Figura 3F) e incubados por mais 5 dias. Como alternativa, os organóides continuarão a expandir-se e ramificar-se no Meio de Crescimento por pelo menos 10 dias. Os organóides podem ser analisados utilizando imunofluorescência(Figura 3D-F) ou liberados do ECM utilizando uma solução de recuperação (ver Tabela de Materiais) e analisados por outros métodos (por exemplo, imunoblot, RT-qPCR).

<table><tbody><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 15 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>placa de fixação ultrabaixa de 24 poços (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura de células de estilo fácil de segurar tratado com TC de 35 mm (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 50 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>Prato de Cultura de Células de Fácil Aderência de 60 mm tratado com TC (BD Falcon)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; Filtro de células de nylon M (Corning)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep também funciona</td></tr><tr><td>suplemento B27 sem vitamina A (50x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B6 ACTb-EGFP</td><td>camundongos The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringa de insulina 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Classe 2 Dispase (Roche)</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Classe 3 Colagenase</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Células Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>354253</td><td>Siga as diretrizes de uso &ndash; Extração de Estruturas Tridimensionais da Matriz Corning Matrigel Corning</td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, sem vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Desoxirribonuclease I)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-cabra 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21447</td><td>Uso a 1:500, Lote: 1608641, estoque 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>Burro anti-rato 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>Uso a 1:1000, Lote: 140554, estoque 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered salina (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>Sem Mg2+/Ca2+</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>VWR</td><td>97068&ndash; 085</td><td>100% Origem dos EUA, grau premium, Lote: 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>Referido como mídia de montagem no texto</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>Use em 1:250, Lote: J1011, estoque 200 &micro; g/mL, RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>Use 1:2000, estoque é 20mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash; CreERtam</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG); Sem Fenol Vermelho; 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>Lote: 8204010, concentração de estoque 8.9 mg/mL</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro MillexGV 0.22 &micro; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE Vidro de 8 poços, estéril</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>Estas corrediças de câmara são ótimas para remoção de juntas, mas outras marcas podem funcionar bem (por exemplo, Lab Tek II).</td></tr><tr><td>Uso de camundongo anti-SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>a 1:500, Lote: 128M4881V, estoque 5,2 mg/mL, RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R& D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr>Programa <td></td><td>Nacional de Hormona e Peptídeos</td> da<td>Profissura Ovina Hipofisária</td><td>Comprado do Dr. Parlow no Instituto de Pesquisa e Educação Harbor-UCLA</td></tr><tr><td>Paraformaldaído</td><td>Millipore Sigma</td><td>PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>R26R-EYFP</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Rho Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro Filtrado Estéril</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro Filtrado Estéril</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,05%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de organóides mammary mosaicos por trypsinização diferencial

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organóides oferecem estruturas de tecidos tridimensionais auto-organizadas que recapitulam processos fisiológicos na conveniência de um prato. A glândula mamária murina é composta por dois compartimentos de células epiteliais distintos, servindo funções diferentes: o compartimento mioepitelal externo e contraído e o compartimento luminal interno e secreto. Aqui, descrevemos um método pelo qual as células que compõem esses compartimentos são isoladas e, em seguida, combinadas para investigar suas contribuições individuais de linhagem para morfogemeee e diferenciação da glândula mamária. O método é simples e eficiente e não requer tecnologias sofisticadas de separação, como a triagem celular ativada por fluorescência. Em vez disso, colhemos e digerimos enzimáticamente o tecido, sedeo o epitélio em pratos de cultura de tecido aderente e, em seguida, usamos a tripsinização diferencial para separar o mioepitelial das células luminais com ~90% de pureza. As células são então banhadas em uma matriz extracelular onde se organizam em organóides bicamadas tridimensionais (3D) que podem ser diferenciadas para produzir leite após 10 dias na cultura. Para testar os efeitos das mutações genéticas, as células podem ser colhidas de modelos de camundongos selvagens ou geneticamente modificados, ou podem ser geneticamente manipuladas antes da cultura 3D. Esta técnica pode ser usada para gerar organóides de mosaico que permitem a investigação da função genética especificamente no compartimento luminal ou mioepitelélico.

O protocolo aqui apresentado descreve um método para investigar contribuições específicas de linhagem de células epiteliais mamárias, fazendo uso de organóides de mosaico. Para obter células murinas primárias para organóides, o epitélio da glândula mamária deve primeiro ser isolado do estroma rico em adifrócito circundante(Figura 1). Este processo é descrito brevemente aqui e também é descrito em um estudo publicado anteriormente18. Pa...

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Nosso método é significativo porque permite que os pesquisadores isolem e manipulem diferentes tipos de células para a investigação de suas contribuições individuais de linhagem à forma e função tecidual. Esta técnica é um método suave e eficiente para separar tipos de células e, como resultado, a integridade das células é preservada para a cultura 3D. Essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas para isolar células que não possuem biomarcadores bem caracterizados.Para colher as glândulas mamárias número dois, três, quatro e cinco de um rato fêmea de 10 a 14 semanas, primeiro faça uma incisão de um centímetro na linha média entre os dois traseiros. Estenda o corte até o pescoço e faça pequenos cortes laterais da incisão da linha média em direção aos membros. Em seguida, estique a pele ensinada antes de fixá-la com um alfinete em cada lado do animal.Usando fórceps, colete os linfonodos das glândulas número quatro. Para remover as glândulas mamárias, use uma tesoura afiada para cortar sob cada região do tecido, colocando os tecidos em 50 mililitros de quatro graus Celsius DMEM-F12 suplementados com 5% de FBS e antibiótico-antimíctico à medida que são colhidos. Quando todos

generation-of-mosaic-mammary-organoids-by-differential-trypsinization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Disponibilidade de SCs somáticas é crucial para a medicina regenerativa, modelagem de doença e para ganhar a introspecção em Propriedades de SC. Aqui nós apresentamos estratégias experimentais para reprogramar, em vitro, células adultas diferenciadas em suas células tronco/progenitoras expansível do tecido-específica correspondente pela expressão transiente do único ativador transcricional co YAP.

De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Este protocolo detalha o desenvolvimento de modelos de camundongos com carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir da derivação de organoides das trompas de Falópio murina, sua modificação genética para recapitular a genética do HGSOC humano e sua introdução na bursa ovariana de camundongos singênicos para o desenvolvimento in vivo de tumores.

Desenvolvimento de Linhagens Organoides Derivadas de Camundongos a partir de Células Epiteliais da Trompa de Falópio para Modelagem de Carcinoma Seroso de Ovário de Alto Grau

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

O objetivo deste estudo é demonstrar como a estratégia de transgênese em mosaico pode ser usada em peixe-zebra para avaliar de forma rápida e eficiente as contribuições relativas de múltiplos oncogenes na iniciação e progressão do tumor in vivo.

Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Aprenda a gerar organóides mamários mosaicos por tripsinização diferencial para biologia celular usando células de glândula mamária de camundongo. Este método preserva a integridade celular para cultura 3D.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

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