Name: Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a quantificar o tamanho do fígado em larvas de zebrafish usando microscopia de campo brilhante. Este método permite avaliar manipulações genéticas e farmacológicas no desenvolvimento hepático.

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Gostaríamos de reconhecer Maurine Hobbs e o Centralizado Zebrafish Animal Resource (CZAR) da Universidade de Utah por fornecer maçaria de zebrafish, espaço de laboratório e equipamentos para realizar partes desta pesquisa. A expansão do CZAR é apoiada em parte pela subvenção do NIH # 1G20OD018369-01. Também gostaríamos de agradecer a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e o Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility por cuidados com zebrafish. Gostaríamos de agradecer a Kenneth Kompass por ajuda com a programação R. Este trabalho foi financiado em parte por subsídios da Huntsman Cancer Foundation (em conjunto com a concessão P30 CA042014 concedida ao Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Estudos em animais são realizados seguindo procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Utah.
1. Corrigir larvas
<ol><li>Em 3 a 7 dias após a fertilização (DPF), eutaniza larvas com metanosulfonato de tricaina (0,03%) e coletar até 15 larvas em um tubo de 2 mL usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta.</li>
	<li>Lave larvas duas vezes com 1 mL de salino frio (4 °C) 1x de fosfato tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para cada lavagem, remova o máximo de líquido possível do tubo com uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, e adicione 1 mL de PBS frio ao tubo.</li>
	<li>Remova o máximo de PBS possível usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, e adicione 1 mL de paraformaldeído frio (4°C) 4% de paraformaldeído (PFA) na PBS. ATENÇÃO: PfA é um irritante e suspeito de carcinógeno. As luvas devem ser usadas ao manusear pfa, e soluções concentradas devem ser manuseadas em um capô de fume químico.</li>
	<li>Incubar a 4 °C pelo menos durante a noite (mas até vários meses) com balanço suave.</li>
</ol>2. Dissecando tecidos ao redor do fígado
<ol><li>Remova larvas da PFA enxaguando 3x com 1 mL de PBS frio (4 °C) e balançando por 5 min entre enxágües. NOTA: Não há problema em manter as larvas enxaguadas na PBS por um dia ou dois a 4 °C.</li>
	<li>Pipette várias larvas em PBS em um poço de um prato de vidro de fundo redondo de 9 poços.</li>
	<li>Remova a pele ao redor do fígado.<ol>
<li>Use fórceps finos para segurar larvas nas costas (barriga para cima), agarrando-se em ambos os lados da cabeça o mais suavemente possível. Em seguida, use fórceps muito finos em sua outra mão para agarrar a pele apenas sobrepostando o coração.</li>
		<li>Puxe a pele para baixo diagonalmente em direção à cauda do peixe e ao fundo do prato no lado esquerdo ou direito do peixe. Repita para o outro lado (lado direito ou esquerdo).</li>
		<li>Continue agarrando retalhos de pele e puxando para baixo/para trás até que toda a pele e melanoforos sobrepostas ou perto do fígado tenham sido removidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a gema, se estiver presente.<ol>
<li>Para larvas de 5-6 dpf, levante a gema em uma peça segurando o peixe com fórceps finos nas costas e usando os fórceps muito finos para cutucar a gema suavemente.</li>
		<li>Para larvas de 3 a 4 dpf, raspe a gema em pedaços. Segure o peixe com fórceps finos nas costas e use os fórceps muito finos para acariciar a gema, começando pelo lado ventral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque larvas dissecadas em PBS frio fresco suspito usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta.</li>
</ol>3. Imagem
<ol><li>Para montar larvas, despeje alguns mL de 3% de celulose metila na tampa de uma placa de Petri de plástico limpo.</li>
	<li>Use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para adicionar larvas à celulose de metila, adicionando o mínimo de PBS com as larvas possível.</li>
	<li>um microscópio dissecando em baixa ampliação, use fórceps finos para orientar os peixes para que eles estejam deitados no lado direito, de frente para a esquerda. NOTA: Certifique-se de que os peixes estão orientados perfeitamente ao seu lado ou as medidas hepáticas podem não ser precisas.</li>
	<li>Tire uma foto de cada peixe.<ol>
<li>Confirme que o peixe a ser fotografado está alinhado perfeitamente, com um olho diretamente em cima do outro olho. Se necessário, use fórceps finos para tocar levemente na cabeça ou na cauda do peixe para ajustar a orientação. Se a cauda do peixe estiver dobrada, remova a cauda beliscando-a com força com fórceps para removê-la para que o peixe fique liso.</li>
		<li>Amplie para alta ampliação e concentre-se no fígado, certificando-se de que o contorno do fígado é claramente visível.</li>
		<li>Tire uma foto e salve o arquivo.</li>
		<li>Repita para todos os peixes, certificando-se de que a ampliação é a mesma para cada imagem.</li>
		<li>Tire uma foto de um micrômetro usando a mesma ampliação (ver Figura 2H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de Imagens
<ol><li>Meça a área do fígado de cada peixe usando software de processamento de imagens.<ol>
<li>Cegar todas as imagens hepáticas para evitar o viés do investigador em potencial e promover o rigor científico15. Esta etapa pode ser feita manualmente por outro membro do laboratório ou usando um programa de computador (Material Suplementar). Renomear arquivos aleatoriamente e criar um "arquivo de randomização" contendo uma lista dos nomes de arquivos originais e nomes de arquivos cegos correspondentes.</li>
		<li>Abra arquivos randomizados em ordem, começando pelo arquivo 1.</li>
		<li>Escolha a ferramenta de seleções de mão livre e esboce cada fígado.</li>
		<li>Pressione ctrl-M para medir a área de cada fígado.</li>
		<li>Para quaisquer fígados que não podem ser medidos com precisão, insira uma medição do espaço reservado (muito pequena ou muito grande, para que possa ser facilmente excluída mais tarde).</li>
		<li>Salve as medidas em um arquivo de texto ("arquivo de medições").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descego e analise dados<ol>
<li>Abra "arquivo de medidas" e "arquivo de randomização" em um programa de planilha.</li>
		<li>Insira uma nova coluna no "arquivo de medidas" e adicione os nomes originais dos arquivos para os arquivos cegos, usando o "arquivo de randomização". Salve este arquivo como "arquivo de medidas não cegadas".</li>
		<li>Classificar dados pelo nome do arquivo original.</li>
		<li>Certifique-se de excluir quaisquer medidas hepáticas para as quais as imagens foram inadequadas (ver Figura 2A-G).</li>
		<li>Se necessário, converta valores de medição em escala desejada (mm2,por exemplo).<ol>
<li>Abra a barra de escala no software de processamento de imagens.</li>
			<li>Use a ferramenta de linha reta para medir 1 mm na barra de escala. O software de processamento de imagens irá medir nas mesmas unidades que os fígados (pixels), dando um fator de conversão.</li>
			<li>Use o fator de conversão para converter medidas no "arquivo de medições não cegadas".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando o programa de planilha ou colando dados em um software científico de gráficos e estatísticas, determine o desvio médio e padrão e calcule os valores p.s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A quantificação do tamanho do fígado é crucial em estudos que visam entender o desenvolvimento do fígado, a regeneração e a oncogênese. O protocolo descrito aqui é uma técnica relativamente rápida, fácil e barata para quantificação do tamanho do fígado em zebrafish larval. Exercitar a cautela adequada ao realizar certos aspectos do protocolo pode ajudar no aumento da precisão dos resultados e diminuição da frustração.
A fixação adequada das larvas é crucial para obter amostras biológicas bem p...

O carcinoma hepatocelular (CCH) é a malignidade primária mais comum do fígado1 e a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer2. Para entender melhor os mecanismos da hepatocarcinogênese e identificar potenciais terapêuticas de HCC, nós e outros desenvolvemos zebrafish transgênicos nos quais a expressão específica do hepatocito de oncogenes como β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, ou Yap18 leva ao HCC em animais adultos. Nestes zebrafish, o alargamento do fígado é observado já em 6 dias após a fertilização (DPF), fornecendo uma plataforma fácil para testar os efeitos das drogas e alterações genéticas no crescimento excessivo do fígado orientado por oncogenes. Medição precisa e precisa do tamanho do fígado larval é essencial para determinar os efeitos dessas manipulações.
O tamanho e a forma do fígado podem ser avaliados semi-quantitativamente em larvas fixas de zebrafish por CY3-SA rotulando9 ou em larvas de zebrafish vivos usando repórteres fluorescentes específicos de hepatocito e microscopia dissecante5,6. Este último método é relativamente rápido, e sua falta de precisão pode ser abordada fotografando e medindo a área de cada fígado usando software de processamento de imagem7,10. No entanto, pode ser tecnicamente desafiador posicionar uniformemente todas as larvas vivas em um experimento de tal forma que a área hepática bidimensional é uma representação precisa do tamanho do fígado. Uma técnica semelhante para quantificar o tamanho do fígado envolve o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para quantificar o volume de fígadolarval 8, o que pode ser mais preciso para detectar diferenças de tamanho quando o fígado é expandido não uniformemente em diferentes dimensões. A classificação celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para contar o número de hepatocitos fluorescentes rotulados e outros tipos de células hepáticas em fígados larvais8,11. Neste método, os fígados larvais são agrupados e dissociados, por isso se perdem informações sobre o tamanho e a forma individuais do fígado. Em combinação com outro método de determinação do tamanho do fígado, o FACS permite diferenciação entre o aumento do número celular (hiperplasia) e o aumento do tamanho celular (hipertrofia). Todos esses métodos empregam tecnologia de fluorescência cara (microscópio ou aparelho celular) e, com exceção da rotulagem CY3-SA, exigem rotulagem de hepatocitos com um repórter fluorescente.
Aqui descrevemos em detalhes um método para quantificar a área hepática larvalde zebrafish usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagem3,12,13,14. Este protocolo permite quantificação precisa da área de fígados individuais in situ sem o uso de microscopia de fluorescência. Ao analisar o tamanho do fígado, cegamos a identidade da imagem para reduzir o viés do investigador e melhorar o rigor científico15.

<table><tbody><tr><td>Câmara para dissecar microscópio</td><td>Leica, por exemplo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica, por exemplo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fine (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Image J/FIJI</td><td></td><td>O ImageJ/FIJI pode ser baixado gratuitamente: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9-well prato de vidro de fundo redondo</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Software para cegar arquivos</td><td>R project</td><td>R pode ser baixado gratuitamente: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>Software de gráficos e estatísticas científicas <td></td></tr><tr><td></td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet program</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td> <td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Muito fino (Dumont # 55) fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Em vários modelos transgênicos de zebrafish do carcinoma hepatocelular (CcH), hepatomegaly pode ser observado durante estágios larvais precoces. Quantificar o tamanho do fígado larval em modelos de HCC de zebrafish fornece um meio de avaliar rapidamente os efeitos das drogas e outras manipulações em um fenótipo relacionado ao oncogene. Aqui mostramos como consertar larvas de zebrafish, dissecar os tecidos ao redor do fígado, fotografar fígados usando microscopia de campo brilhante, medir a área hepática e analisar os resultados. Este protocolo permite quantificação rápida e precisa do tamanho do fígado. Como este método envolve medir a área hepática, pode subestimar diferenças no volume do fígado, e metodologias complementares são necessárias para diferenciar entre alterações no tamanho celular e alterações no número celular. A técnica de dissecção descrita aqui é uma excelente ferramenta para visualizar o fígado, intestino e pâncreas em suas posições naturais para inúmeras aplicações a jusante, incluindo a coloração de imunofluorescência e a hibridização situ. A estratégia descrita para quantificar o tamanho do fígado larval é aplicável a muitos aspectos do desenvolvimento e regeneração hepática.

Zebrafish transgênico expressando β-catenina ativada com hepatocyte(Tg(fabp10a:pt-β-cat)zebrafish) 3 e irmãos de controle não transgênicos foram eutanizados a 6 dpf e a área hepática foi quantificada usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagens. Zebrafish transgênico aumentaram significativamente o tamanho do fígado (0,0006 cm2) em comparação com seus irmãos não transgênicos (0,0004 cm2, p &lt; 0,0001; <strong class="...

Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Este método fornece uma maneira de quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval. Também permite avaliar os efeitos da manipulação genética e farmacológica no crescimento e desenvolvimento do fígado. Esta técnica fornece uma maneira rápida e precisa de visualizar e medir o fígado, bem como o intestino e pâncreas.Além de quantificar o tamanho do fígado, este método de dissecção pode ser útil para preparar o fígado, intestino e pâncreas para hibridização in situ ou imagem confocal. Antes de tentar deskinning em larvas experimentais, certifique-se de que você passou muito tempo praticando em amostras não experimentais e tenha uma taxa de sucesso significativa. É fundamental visualizar a orientação e o movimento adequados das larvas de zebrafish e fórceps, a fim de remover a pele sem perturbar os órgãos ao redor.Em três a sete dias após a fertilização, após eutanásia de larvas, use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para coletar até 15 larvas em um tubo de dois mililitros. Lave as larvas duas vezes com um mililitro de 1X PBS frio no gelo. Remova o máximo de PBS possível usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta e adicione um mililitro de PFA frio de 4% em PBS.Incubar a quatro graus Celsius pelo menos durante a noite com balanço suave. Usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, remova o PFA do tubo e enxágue três vezes com um mililitro de PBS frio. Arrase por cinco minutos entre as enxágües.Pipeta várias larvas em PBS em um poço de nove bem prato de vidro de fundo redondo. Sob um microscópio, remova a pele ao redor do fígado usando fórceps finos para segurar uma larva em suas costas, agarrando-se em ambos os lados da cabeça o mais suavemente possível. Em seguida, use fórceps muito finos na outra mão para agarrar a pele apenas sobreolecando o coração.Puxe a pele para baixo diagonalmente em direção à cauda do peixe no fundo do prato no lado esquerdo ou direito do peixe. Repita para o outro lado. Continue agarrando retalhos de pele e puxando para baixo até que toda a pele e melanoforos sobrevoando ou perto do fígado tenham sido removidos.Se a gema estiver presente por cinco a seis dias de larvas pós-fertilização, levante a gema inteira segurando o peixe com fórceps finos nas costas e usando as fórceps muito finas para suavemente cutucar a gema. Para três a quatro larvas DPF, segure o peixe com fórceps finos nas costas e use os fórceps muito finos para acariciar a gema a partir do lado ventral. Raspe a gema em pedaços.Coloque as larvas dissecadas em PBS fresco e frio em um tubo de dois mililitros usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta. Para montar as larvas, despeje alguns mililitros de 3% de metilcelulose na tampa da placa de Petri de plástico limpa. Use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para adicionar larvas à metilcelulose, adicionando o mínimo de PBS com as larvas possível.Sob um microscópio dissecando em baixa ampliação, use fórceps finos para orientar os peixes para que eles estejam deitados do lado direito voltados para a esquerda. Confirme que o peixe a ser fotografado está perfeitamente alinhado com um olho diretamente em cima do outro olho. Se a cauda do peixe estiver dobrada, remova a cauda beliscando-a com força com fórceps para removê-la para que o peixe fique liso.Amplie para alta ampliação e foque no fígado, certificando-se de que o contorno do fígado é claramente visível. Pressione o botão Capturar imagem para tirar uma imagem e salvar o arquivo. Repita para todos os peixes, certificando-se de que a ampliação é a mesma para cada imagem.Tire uma foto de um micrômetro usando a mesma ampliação. Para usar o programa R para cegar todas as imagens do fígado para evitar viés potencial de investigador e promover o rigor científico, renomeie arquivos aleatoriamente e crie um arquivo de randomização contendo uma lista dos nomes de arquivos originais e nomes de arquivos cegos correspondentes. Abra arquivos randomizados em ordem, começando com o arquivo um.Escolha a ferramenta Seleções à Mão Livre e delineie cada fígado. Pressione control-M para medir a área de cada fígado. Para quaisquer fígados que não podem ser medidos com precisão porque têm pele residual, gema, estão fora de foco, ou não estão intactos, insira uma medida de espaço reservado.Salve as medidas em um arquivo de texto. Para não cegos e analisar dados, abra o arquivo de medição e o arquivo de randomização em um programa de planilha. Insira uma nova coluna no arquivo de medidas e adicione os nomes originais dos arquivos para os arquivos cegos usando o arquivo Randomization.Salve este arquivo como o arquivo Medidas Não Cegas. Classifique os dados pelo nome do arquivo original. Exclua quaisquer medidas hepáticas para as quais as fotos não eram adequadas.Se necessário, converta os valores de medição na escala desejada em milímetros quadrados. Abra a barra Escala no software de processamento de imagens. Use a ferramenta Linha Reta para medir um milímetro na barra de escala.O software de processamento de imagens então mede nas mesmas unidades que os fígados, dando um fator de conversão. Use o fator de conversão para converter medidas no arquivo Medidas Não Cegas. Determine o desvio médio e padrão e calcule os valores P.Aos seis dias após a fertilização, as larvas de zebrafish não transgênicas mostraram posição natural e forma de fígado sobreposto ao intestino. Os zebrafish transgênicos aumentaram significativamente o tamanho do fígado em comparação com seus irmãos não transgênicos. Alguns exemplos de imagens inadequadas e micrômetros são mostrados aqui.Larva com pele cobrindo o fígado, larva com gema obscurecendo o fígado, larva com partes do fígado beliscadas, e larva com fígado deslocado e caindo, larva com fígado faltando, larva com contorno hepático que é difícil de identificar, e larva com posicionamento inadequado. Ao tentar este procedimento, é importante usar movimentos pequenos e controlados para evitar danos ao fígado. Além da microscopia de campo brilhante, também podemos usar larvas dissecadas dessa forma, para microscopia confocal, para visualizar proteínas fluorescentes de repórteres ou manchas imuno-fluorescentes, e para hibridização in situ.O formaldeído ou PFA é um carcinógeno irritante e suspeito. As luvas devem ser usadas ao manusear PFA e as soluções concentradas devem ser manuseadas em um capô de fumaça química.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

A microscopia de fluorescência de folha de luz é uma excelente ferramenta para imagens do desenvolvimento embrionário. Permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas. Demonstramos sua aplicação para o desenvolvimento de imagens do olho do peixe-zebra em amplas escalas espaço-temporais e apresentamos um pipeline para fusão e deconvolução de conjuntos de dados multiview.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

O peixe-zebra está emergindo como um modelo valioso de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. São descritos protocolos de alimentação de larvas ricas em lipídios, imagens ao vivo de análogos lipídicos fluorescentes da dieta e quantificação da ingestão de alimentos. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma variedade de técnicas de triagem, imagem e investigação orientada por hipóteses.

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

Aprenda a quantificar o tamanho do fígado em larvas de zebrafish usando microscopia de campo brilhante. Este método permite avaliar manipulações genéticas e farmacológicas no desenvolvimento hepático.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

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