Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

Este método fornece uma maneira de quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval. Também permite avaliar os efeitos da manipulação genética e farmacológica no crescimento e desenvolvimento do fígado. Esta técnica fornece uma maneira rápida e precisa de visualizar e medir o fígado, bem como o intestino e pâncreas.

Além de quantificar o tamanho do fígado, este método de dissecção pode ser útil para preparar o fígado, intestino e pâncreas para hibridização in situ ou imagem confocal. Antes de tentar deskinning em larvas experimentais, certifique-se de que você passou muito tempo praticando em amostras não experimentais e tenha uma taxa de sucesso significativa. É fundamental visualizar a orientação e o movimento adequados das larvas de zebrafish e fórceps, a fim de remover a pele sem perturbar os órgãos ao redor.

Em três a sete dias após a fertilização, após eutanásia de larvas, use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para coletar até 15 larvas em um tubo de dois mililitros. Lave as larvas duas vezes com um mililitro de 1X PBS frio no gelo. Remova o máximo de PBS possível usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta e adicione um mililitro de PFA frio de 4% em PBS.

Incubar a quatro graus Celsius pelo menos durante a noite com balanço suave. Usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, remova o PFA do tubo e enxágue três vezes com um mililitro de PBS frio. Arrase por cinco minutos entre as enxágües.

Pipeta várias larvas em PBS em um poço de nove bem prato de vidro de fundo redondo. Sob um microscópio, remova a pele ao redor do fígado usando fórceps finos para segurar uma larva em suas costas, agarrando-se em ambos os lados da cabeça o mais suavemente possível. Em seguida, use fórceps muito finos na outra mão para agarrar a pele apenas sobreolecando o coração.

Puxe a pele para baixo diagonalmente em direção à cauda do peixe no fundo do prato no lado esquerdo ou direito do peixe. Repita para o outro lado. Continue agarrando retalhos de pele e puxando para baixo até que toda a pele e melanoforos sobrevoando ou perto do fígado tenham sido removidos.

Se a gema estiver presente por cinco a seis dias de larvas pós-fertilização, levante a gema inteira segurando o peixe com fórceps finos nas costas e usando as fórceps muito finas para suavemente cutucar a gema. Para três a quatro larvas DPF, segure o peixe com fórceps finos nas costas e use os fórceps muito finos para acariciar a gema a partir do lado ventral. Raspe a gema em pedaços.

Coloque as larvas dissecadas em PBS fresco e frio em um tubo de dois mililitros usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta. Para montar as larvas, despeje alguns mililitros de 3% de metilcelulose na tampa da placa de Petri de plástico limpa. Use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para adicionar larvas à metilcelulose, adicionando o mínimo de PBS com as larvas possível.

Sob um microscópio dissecando em baixa ampliação, use fórceps finos para orientar os peixes para que eles estejam deitados do lado direito voltados para a esquerda. Confirme que o peixe a ser fotografado está perfeitamente alinhado com um olho diretamente em cima do outro olho. Se a cauda do peixe estiver dobrada, remova a cauda beliscando-a com força com fórceps para removê-la para que o peixe fique liso.

Amplie para alta ampliação e foque no fígado, certificando-se de que o contorno do fígado é claramente visível. Pressione o botão Capturar imagem para tirar uma imagem e salvar o arquivo. Repita para todos os peixes, certificando-se de que a ampliação é a mesma para cada imagem.

Tire uma foto de um micrômetro usando a mesma ampliação. Para usar o programa R para cegar todas as imagens do fígado para evitar viés potencial de investigador e promover o rigor científico, renomeie arquivos aleatoriamente e crie um arquivo de randomização contendo uma lista dos nomes de arquivos originais e nomes de arquivos cegos correspondentes. Abra arquivos randomizados em ordem, começando com o arquivo um.

Escolha a ferramenta Seleções à Mão Livre e delineie cada fígado. Pressione control-M para medir a área de cada fígado. Para quaisquer fígados que não podem ser medidos com precisão porque têm pele residual, gema, estão fora de foco, ou não estão intactos, insira uma medida de espaço reservado.

Salve as medidas em um arquivo de texto. Para não cegos e analisar dados, abra o arquivo de medição e o arquivo de randomização em um programa de planilha. Insira uma nova coluna no arquivo de medidas e adicione os nomes originais dos arquivos para os arquivos cegos usando o arquivo Randomization.

Salve este arquivo como o arquivo Medidas Não Cegas. Classifique os dados pelo nome do arquivo original. Exclua quaisquer medidas hepáticas para as quais as fotos não eram adequadas.

Se necessário, converta os valores de medição na escala desejada em milímetros quadrados. Abra a barra Escala no software de processamento de imagens. Use a ferramenta Linha Reta para medir um milímetro na barra de escala.

O software de processamento de imagens então mede nas mesmas unidades que os fígados, dando um fator de conversão. Use o fator de conversão para converter medidas no arquivo Medidas Não Cegas. Determine o desvio médio e padrão e calcule os valores P.

Aos seis dias após a fertilização, as larvas de zebrafish não transgênicas mostraram posição natural e forma de fígado sobreposto ao intestino. Os zebrafish transgênicos aumentaram significativamente o tamanho do fígado em comparação com seus irmãos não transgênicos. Alguns exemplos de imagens inadequadas e micrômetros são mostrados aqui.

Larva com pele cobrindo o fígado, larva com gema obscurecendo o fígado, larva com partes do fígado beliscadas, e larva com fígado deslocado e caindo, larva com fígado faltando, larva com contorno hepático que é difícil de identificar, e larva com posicionamento inadequado. Ao tentar este procedimento, é importante usar movimentos pequenos e controlados para evitar danos ao fígado. Além da microscopia de campo brilhante, também podemos usar larvas dissecadas dessa forma, para microscopia confocal, para visualizar proteínas fluorescentes de repórteres ou manchas imuno-fluorescentes, e para hibridização in situ.

O formaldeído ou PFA é um carcinógeno irritante e suspeito. As luvas devem ser usadas ao manusear PFA e as soluções concentradas devem ser manuseadas em um capô de fumaça química.