Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

As amostras de PBMC e plasma são simples de adquirir e altamente informativas no desenvolvimento clínico precoce. Este protocolo robusto minimiza a variabilidade pré-analítica introduzida nos locais clínicos. Este protocolo é rápido e fácil, exigindo equipamentos básicos de laboratório e experiência mínima do operador para processar o sangue em PBMCs e plasma.

É compatível com dias de laboratório ocupados em hospitais. A análise a jusante dos componentes sanguíneos resultantes deste protocolo pode informar relações farmacocinéticas e farmacodinâmicas, agendamento de doses de drogas e prova de engajamento de alvos e fornecer insights sobre mecanismos de ação medicamentosos, apoiando análises em tempo real e introspectivas. Usamos este protocolo para estudos oncológicos, especificamente para analisar mecanismos de resposta a danos no DNA.

No entanto, os materiais coletados por este protocolo podem ser relevantes em muitas áreas da doença e múltiplas modalidades terapêuticas. Depois de receber oito mililitros de sangue doador por amostra, registe o tempo em que o sangue foi extraído e inverta suavemente cada tubo oito a dez vezes antes de transferir amostras de sangue tratados anticoagulantes para cada um dos tubos rotulados para radiação. Para amostras clínicas, centrifugar os tubos logo após inverí-los.

Coloque os tubos cinza 0,2 em um armário de raio-x pré-aquecido, feche a porta e aplique uma dose cinza de 0,2 nos tubos. Substitua os tubos irradiados de baixa dose pelos sete tubos cinzentos e ajuste a dose para aplicar uma dose de radiação de sete cinzas às amostras de irradiação de alta dose. Depois que ambas as amostras foram irradiadas, incubar os três tubos a 37 graus Celsius por uma hora.

Transfira as amostras para tubos de preparação celular antes de separar as células com centrifugação de alta velocidade, certificando-se de definir as unidades como x g ou RCF equivalente. Após a centrifugação, veja os tubos contra um fundo escuro para identificar as camadas de plasma, glóbulos vermelhos e casacos de buffy. Usando uma pipeta sorológica, transfira aproximadamente metade do plasma para uma centrífuga cônica de 15 mililitros sem perturbar a camada do casaco e armazene o tubo de plasma em gelo molhado.

Em seguida, use uma pipeta de pastagem para transferir toda a PBMC contendo camada de casaco buffy em um novo tubo de 15 mililitros e adicionar PBS de temperatura ambiente ao PBMC a um volume final de 15 mililitros por amostra. Misture suavemente as células por inversão cinco vezes e colete as células por centrifugação a uma velocidade mais baixa, certificando-se de verificar as unidades de centrifugação. Aspire todos, menos os últimos 500 microliters de supernascer sem perturbar as pelotas.

Adicione PBS fresco a um volume final de 10 mililitros em cada tubo e resuspend invertendo suavemente os tubos. Use 40 alíquotas de microliter das células para contar. Após a contagem, colete as células com outra centrifugação e remova o máximo de supernanato possível sem perturbar as pelotas.

Para armazenar o PBMC para processamento posterior, resuspenja as pelotas em 50 microliters de PBS fresco por amostra com tubulação suave e transfira cada suspensão celular inteira para um criovial de 1,5 mililitro rotulado em gelo molhado. Em seguida, o flash congele as células pelo método preferido e coloque-as em uma caixa de congelamento a menos 80 graus. Regissou o tempo em que as células foram congeladas.

Alternativamente, resuspensar as pelotas em uma mistura de mililitro ou congelamento por amostra e transferir as suspensões celulares para criovias rotuladas individualmente. Em seguida, coloquei os tubos e caixas de congelamento pré-refrigerados para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para congelar o plasma, adicione a um mililitro aliquots lotes do plasma até cada um dos cinco microtubos mililitros sem perturbar a pelota residual e regise o volume total de plasma em cada tubo.

Em seguida, congele imediatamente as alíquotas de plasma em uma orientação vertical em um congelador de menos 80 graus Celsius. Para a análise ocidental das amostras, resuspenque a pelota em cada tubo com um volume apropriado de tampão de lise complementado com inibidores de protease e fosfatase iguais aos do volume de pelotas celulares com tubulação suave e incubar as amostras de células por 10 minutos no gelo. No final da incubação, transfira as amostras para tubos de 1,5 mililitro e sonicá-las com três segundos e 30 segundos em ciclos de 30 segundos a quatro graus Celsius.

Colete as amostras por centrifugação e transfira os supernacantes para novos tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, misture 40 microgramas por amostra com tampão de carga e ferva as amostras por cinco minutos. Carregue 20 microgramas de cada amostra por faixa em duplicação em um gel de proteína Bis-Tris de 4-12% e execute um SDS-PAGE.

O número de células obtidas a partir de oito mililitros de sangue varia de acordo com o paciente e a configuração da doença. Em geral, a pelota celular é pequena em tamanho e de cor branca transparente. Às vezes as pelotas podem ter alguma contaminação de glóbulos vermelhos, o que tem um efeito negativo na qualidade da preparação.

Um rendimento típico de um paciente com leucemia linfocítica crônica usando este protocolo varia de 1,62 vezes 10 a 1,99 vezes 10 a nona células por oito mililitros de preparação de células mononucleares com uma concentração final de proteína variando entre 1,62 e 19,77 miligramas por mililitro. Nesta análise representativa de três amostras de pacientes, observou-se aumento das modificações pós-translacionais em doses de radiação ionizante mais elevadas. Curiosamente, a fosforilação da ataxia-telangiectasia mutada e RAD50 foi substancial na baixa dose de 0,2 cinzas, o que sugere que essas modificações pós-translacionais podem ser interrogadas como biomarcadores farmacodinâmicos para tratamentos envolvendo a geração de quebras de fios duplos de DNA com um bom alcance dinâmico no tumor, bem como amostras de sangue periféricos.

Para uma preparação ótima da amostra, processe o sangue dentro de uma hora da coleta à temperatura ambiente, centrifufique as amostras corretamente e visualize o tubo contra o fundo escuro para ser capaz de distinguir o casaco buffy.