Demonstrando uma relação linear entre fator de crescimento endotelial vascular e hormônio luteinizador em extratos de córtex renal
22 de janeiro de 2020
Apresentado aqui é um protocolo para a utilização de uma preparação de extrato renal cortical e normalização total da proteína para demonstrar a correlação entre fator de crescimento endotelial vascular e hormônio luteinizador no rim de mamíferos.
Nosso protocolo observa que o uso de extratos renais de vacas e suínos é um excelente recurso econômico para o estudo da fisiologia renal, examinando particularmente a correlação entre fator de crescimento endotelial vascular e outros analitos. Sempre foi um desafio correlacionar o VEGF, fator essencial de crescimento na angiogênese de órgãos, com outras proteínas. Essa técnica nos permite examinar a associação entre VEGF e analitos como hormônios.
Isso certamente avançará nossa base de conhecimento em relação a este importante fator de crescimento. Este método pode ser útil para correlacionar outros analitos em extratos cortical renais além dos mencionados neste vídeo. A demonstração visual ajudará outras pessoas a obter resultados reprodutíveis sem erros de amostragem.
O uso de tecido fresco é essencial para o sucesso desta técnica. É importante obter rins inteiros frescos imediatamente após o abate de um animal. Sempre transfira o tecido para o laboratório no gelo.
Use tesouras estéreis, fórceps, uma faca e placas de Petri para dissecar rins e extirir a porção de tecido necessária. Corte suavemente o rim ao meio ao longo do plano sagital e corte um pedaço de tecido da região do córtex no centro do rim. Pique o tecido em pequenos pedaços com a faca e transfira-o para um tubo de microfuge com um mililitro de tampão de extração de lise RIPA 1X frio.
Rotule o tubo com detalhes específicos da amostra e coloque-o no gelo. Use um homogeneizador portátil com uma sonda estéril para homogeneizar o tecido por um a dois minutos até que nenhum pedaço seja visível, em seguida, imediatamente centrifugar o tubo a 9.600 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, prepare alíquotas separadas da amostra para ELISA e análise total de proteínas para evitar múltiplos ciclos de congelamento/degelo.
Antes de iniciar o ensaio, leve todos os reagentes e a placa de ensaio à temperatura ambiente removendo os poços em excesso e armazenando-os a quatro graus Celsius até que usem mais. Diluir o tampão de lavagem 20X para 300 mililitros com água dupla destilada e configurar os poços em branco sem qualquer solução. Adicione 50 microliters de padrão ou amostra e outros 50 microliters de peroxidase de rabanete conjugados a cada poço, em seguida, adicione imediatamente 50 microliters de solução de anticorpos para cada poço e selar a placa.
Misture a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, lave cada poço com 200 microliters de tampão de lavagem. Adicione 50 microliters de substrato A e substrate B a cada poço, misture a placa suavemente tocando na lateral, depois lacre e incuba-a no escuro por 15 minutos a 37 graus Celsius.
Adicione 50 microliters de solução stop a cada poço. Bata suavemente na placa e leia a absorvância em 450 nanômetros com um espectrômetro. Prepare os reagentes e lave o tampão como descrito anteriormente, em seguida, adicione 100 microliters de padrão ou amostra para cada poço, sele a placa, misture bem e incuba-a por duas horas a 37 graus Celsius.
Remova o líquido em cada poço e adicione 100 microliters de reagente de detecção A.Sele a placa e incuba-a por mais uma hora. Em seguida, lave cada poço com 400 microliters de tampão de lavagem, em seguida, adicione 90 microliters de solução de substrato para cada poço, bata suavemente na placa e incuba-a por mais uma hora a 37 graus Celsius. Após a última incubação, adicione 50 microliters de solução stop a cada poço, toque suavemente na placa e leia a absorvência em 450 nanômetros com um espectotógrafo.
Estime a proteína total dos extratos renais bovinos e suínos com um ensaio BSA padrão e use esta estimativa para normalizar os resultados de LH e VEGF-A-ELISA. Os níveis médios e medianos de LH e VEGF foram calculados tanto para animais quanto para os sexos. Após verificar a normalidade dos dados, foram utilizados modelos de regressão linear para examinar a relação entre LH e VEGF.
Foi encontrado um forte e significativo preditor de VEGF nos rins bovinos e suínos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de provar áreas idênticas em cada tecido. Um procedimento semelhante pode ser usado para extrair qualquer tipo de tecido.
Lembre-se de normalizar analitos por extrato total de proteína de qualquer tecido que você usa.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra a correlação entre o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o hormônio luteinizante (LH) em extratos renais de mamíferos, utilizando um método padronizado. O estudo utiliza extratos corticais renais de vacas e porcos para aprimorar o entendimento da fisiologia renal e das interações proteicas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Fisiologia renal
- Análise de fatores de crescimento
- Técnicas de normalização de proteínas
Antecedentes
- A associação do VEGF com outras proteínas tem sido desafiadora em estudos anteriores.
- A importância do uso de tecido renal fresco para resultados precisos.
- O aprimoramento dos métodos permite uma melhor reprodutibilidade em ensaios biológicos.
Métodos Utilizados
- Utilização de extratos de rim de vaca e de porco para ensaios proteicos
- ELISA para quantificação dos níveis de LH e VEGF
- Análise de regressão linear com loop para verificação da relação
Resultados Principais
- Observou-se correlação significativa entre LH e VEGF em rins de bovinos e suínos.
- A normalização dos resultados de ELISA pelo teor total de proteína foi crucial para a precisão.
- O método pode ser aplicável para analisar outros analitos em extratos renais.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método confiável para correlacionar fatores de crescimento importantes na biologia renal.
- Os resultados têm implicações para pesquisas futuras sobre angiogênese de órgãos e interações hormonais relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Estabelecer uma relação quantitativa e linear entre o hormônio luteinizante (LH) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em extratos do córtex renal aborda um desafio fundamental na validação de alvos em vias de angiogênese renal. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas ao permitir a medição robusta e reprodutível de interações entre hormônios e fatores de crescimento em modelos mamíferos de ordem superior. O protocolo favorece a continuidade translacional da biologia da descoberta até a pesquisa pré-clínica, aproveitando tecidos bovinos e suínos de fácil acesso.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite investigar a ligação mecanicista entre LH e VEGF no tecido renal.
- Apoia a desmistificação biológica mediante a quantificação da modulação de VEGF induzida por hormônios.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias relacionadas à angiogênese em modelos renais.
- Oferece um arcabouço reprodutível para testes de hipóteses em fisiologia renal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara extratos corticais renais validados para ensaios quantitativos posteriores.
- Padroniza a normalização dos níveis de analitos por proteína total para garantir a reprodutibilidade do ensaio.
- Permite a quantificação confiável de LH e VEGF por ELISA para fluxos de trabalho de triagem.
- Apóia a escalabilidade e a adaptação de ensaios entre espécies utilizando fontes de tecido abundantes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com sistemas relevantes para doenças por meio da modelagem da regulação do VEGF em mamíferos de ordem superior.
- Proporciona continuidade para estudos translacionais de biomarcadores na angiogênese renal.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco, apoiando saídas quantitativas e reprodutíveis.
- Reduz os riscos associados a pressupostos mecanicistas antes da seleção de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se à continuidade entre descoberta e pré-clínica ao permitir testes hipotéticos quantitativos, padronização de ensaios e alinhamento de modelos translacionais para pesquisas sobre angiogênese renal.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses mecanicistas das interações LH-VEGF em extratos do córtex renal.
- Triagem: Fornece resultados de ELISA reprodutíveis e normalizados para análise comparativa entre amostras e espécies.
- Análises: Oferece medições quantitativas de variáveis dependentes e resultados de regressão linear para análise estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas científicas a modelos pré-clínicos utilizando tecidos de mamíferos fisiologicamente relevantes.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo escalonável e adaptável para estudos mais amplos de correlação de analitos na fisiologia renal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de angiogênese renal.
- Valor Operacional: Padroniza o processamento de tecidos, a normalização de analitos e os fluxos de trabalho de ELISA para garantir reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e a triagem de portfólios ao fornecer dados robustos e quantitativos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e vias renais para desenvolvimento adicional.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, homogeneização e execução de ensaios de ELISA.
- Necessita de acesso a rins frescos de bovinos ou suínos e a instrumentação analítica para quantificação de proteínas e leitura de ELISA.
- Exige normalização rigorosa e consistência na amostragem para garantir comparabilidade entre amostras.
- Adaptável a outros tipos de tecidos e analitos com modificações apropriadas do protocolo.
- Depende da obtenção imediata dos tecidos e da manutenção da cadeia fria para preservar a integridade das amostras.
