Name: Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a usar microscopia intravital para visualizar em tempo real o desprendimento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Este método permite identificar distúrbios de permeabilidade e distinguir mecanismos para e transcelulares.

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A pesquisa que levou a esses resultados recebeu financiamento do Programa Pessoas (Ações Marie Curie) sob o acordo de subvenção DA REA nº 302170 do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013); o Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) da Universidade Erlangen-Nuremberg; o Centro de Pesquisa Colaborativa TRR241 e o Grupo de Pesquisa Clínica KFO257 do Conselho Alemão de Pesquisa (DFG); e o DFG.

O seguinte protocolo foi aprovado pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os camundongos foram alojados em condições específicas sem patógenos.
NOTA: A inibição da prenilação mediada por GGTase dentro dos IECs causa uma alteração severa da permeabilidade intestinal em camundongos Pggt1biΔIEC 24. Portanto, este modelo de mouse foi usado para demonstrar como o protocolo pode ser útil para estudar defeitos de barreira intestinal. No entanto, este protocolo poderia ser usado para o estudo de qualquer outra linha de mouse.
1. Preparação cirúrgica e coloração da mucosa intestinal do rato
NOTA: A preparação cirúrgica baseia-se nos protocolos descritos anteriormente25. Mantenha o rato anestesiado sob uma lâmpada vermelha durante a preparação cirúrgica, para evitar uma queda na temperatura corporal.
<ol><li>Anesthetize o rato por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazin (96 mg/kg de cetamina; e 12,8 mg/kg de xilazin. Verifique a anestesia verificando a falta de um reflexo das pálpebras.</li>
	<li>Aplique creme de proteção ocular usando um broto de algodão.</li>
	<li>Faça uma incisão (1 cm) na área ventral esquerda usando fórceps padrão e tesoura fina reta.</li>
	<li>Exteriorize um segmento do intestino (5-7 cm, aproximadamente).</li>
	<li>Abra o segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente por eletrocauterização no lado antimesenteric.</li>
	<li>Exponha a mucosa e enxágue em breve com solução salina para remover o conteúdo fecal. NOTA: Opcionalmente, aplique xilazin diretamente no intestino para evitar artefatos de movimento devido à peristalse.</li>
	<li>Manche a superfície da mucosa intestinal com acriflavina e dextran rhodamina-B (10 kDa).<ol>
<li>Aplique a solução acriflavina de 1 mg/mL (100 μL) por pipetação gota a gota na mucosa e incubar por 3 min. Lave a solução restante com PBS.</li>
		<li>Aplique a solução rhodamine-dextran de 2 mg/mL (100 μL) por pipetação gota a gota na mucosa e incubar por 3 min. Lave a solução restante com PBS. NOTA: Opcionalmente, remova o sangue da preparação usando algodão asséptico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o supino do rato anestesiado em um slide de cobertura montado em uma câmara enxaguada com solução salina pré-aquecida (37 °C). NOTA: O segmento intestinal aberto é então colocado superfície luminal para baixo, no slide da tampa.</li>
	<li>Coloque a preparação (rato anestesiado na câmara) no estágio do microscópio invertido.</li>
	<li>Cubra o animal com uma almofada isotérmica (aproximadamente 37 °C).</li>
	<li>Prossiga imediatamente para microscopia intravital. NOTA: Mantenha a preparação cirúrgica enxaguada com solução salina pré-aquecida para evitar a desidratação do tecido e morte celular.</li>
</ol>2. Microscopia intravital
NOTA: Realize a etapa 2.1 antes de iniciar a preparação cirúrgica, para evitar longos tempos de espera entre anestesia, cirurgia e aquisição de imagens. Se necessário, doses adicionais de anestésicos podem ser dadas a animais cirurgicamente preparados para mantê-los sob anestesia para os experimentos de imagem.
<ol><li>Configure o microscópio CLSM.<ol>
<li>Inicie o microscópio CLSM ligando a base do microscópio e a caixa do scanner. Ligue o computador pressionando o botão Iniciar.</li>
		<li>Inicie o software de aquisição de imagens (por exemplo, LAS X) clicando duas vezes no ícone. Selecione a configuração apropriada (Configuração: máquina; Microscópio: DMI6000) e clique em OK.<ol>
<li>Defina a Resolução apropriada. Ir para Configuração | Hardware | Resolução | Profundidade de pouco. Selecione 12.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vá para o menu Aquisição. Selecione xyzt para o modo de aquisição de imagens no menu suspenso. Selecione o objetivo no menu suspenso (20x ou 40x).</li>
		<li>Projete a configuração de aquisição sequencial. Clique em Seq. Adicione uma segunda sequência, clicando no botão adicionar (+). Selecione entre quadros.<ol>
<li>Configure sequência 1 (detecção de acriflavine; excitação de 416 nm; emissão de 514 nm). Ligue a caixa de laser visível. Ative o PMT1 (ON). Defina a janela de comprimento de onda de emissão (490-550 nm).</li>
			<li>Configure sequência 2 (detecção de rhodamineB-dextran; excitação de 570 nm; 590 nm, emissão). Ligue a caixa de laser visível. Ative o PMT2 (ON). Defina a janela de comprimento de onda de emissão (550-760).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ative os lasers correspondentes (488 e 552). Ir para Configuração | Lasers. Ative lasers de 488 e 552 nm (ligue).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a configuração para as características específicas do experimento atual.<ol>
<li>Ligue a fonte de luz (pressione a energia). Coloque a preparação (rato anestesiado na câmara) no estágio do microscópio e altere a posição xii até que o eixo de iluminação esteja focado na preparação do tecido.</li>
		<li>Selecione o campo de interesse usando a fonte de luz padrão e as oculares.<ol>
<li>Selecione o cubo de filtro (I3). Abra o obturador. Concentre-se na superfície da mucosa intestinal usando a macro e micro-roda. Procure por uma área onde vários villi possam ser visualizados dentro do campo de visão alterando a posição XY.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verifique se a coloração rhodamine-dextran também é visível nessa área. Altere o cubo do filtro (N2.1). Verifique a imagem através das oculares.</li>
		<li>Inicie a aquisição de imagens CLSM a partir do software. Otimize as configurações para as duas sequências.<ol>
<li>Selecione sequência 1. Ajuste a potência do laser, ganho e deslocamento para a Sequência 1.</li>
			<li>Selecione sequência 2. Ajuste a potência do laser, ganho e deslocamento para a Sequência 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Defina o intervalo de pilha z.<ol>
<li>Abra o menu de entrega de pilha Z. Concentre-se na superfície da mucosa usando o controle do eixo Z. Pressione Begin.</li>
			<li>Concentre-se no limite inferior onde o sinal ainda é detectável. Fim de prensa.</li>
			<li>Defina os números de pilhas z (10). Evite lapsos de tempo com mais de 2 minutos por dois pontos de tempo consecutivos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Defina as configurações de tempo. Vá para o menu Time. Clique em Minimizar. Selecione Adquirir até parar.</li>
		<li>Defina a média da linha. Selecione Seq 1. Selecione a linha Média 2. Selecione Seq 2. Selecione a linha Média 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquira imagens correspondentes.<ol>
<li>Selecione Formato (1024 x 1024) e Velocidade (400). Pressione Start.</li>
		<li>Pressione Stop após o tempo de aquisição de imagem desejado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salve o arquivo. Vá para o Projeto. Clique com o botão direito do mouse no arquivo correspondente. Pressione Salvar como.<ol>
<li>Nomeie o arquivo apropriadamente. Selecione a pasta adequada. Defesa de imprensa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanize o animal (luxação cervical) e colete tecidos para análise ulterior, se necessário.</li>
</ol>3. Análise de imagem: Determine a taxa de derramamento celular e o epitélio intestinal
<ol><li>Taxa de derramamento de células<ol>
<li>Inicie o software de aquisição de imagens.</li>
		<li>Vá para projetos abertos. Selecione o arquivo apropriado.</li>
		<li>Defina o tempo total de aquisição de imagens.<ol>
<li>Selecione a última pilha z completa. Selecione a última posição Z do ponto de tempo selecionado anteriormente. Leia a hora no canto inferior direito da tela (tempo total de aquisição de imagens).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selecione um villus.<ol>
<li>Selecione a posição apropriada da pilha Z (superfície do villus, mas profunda o suficiente para evitar a interferência com células já derramadas e outros componentes presentes no lúmen).</li>
			<li>Meça o comprimento da membrana basal. Selecione a ferramenta régua. Divida o villus em várias linhas para cobrir ou desenhar todo o perímetro villus. Adicione os diferentes valores (comprimento total da membrana basal). Exclua os segmentos da ferramenta Régua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conte o número de eventos ocorridos durante toda a duração da aquisição da imagem.<ol>
<li>Divida o villus em segmentos com um tamanho adequado. Analise a sequência de eventos/segmento deslizando a barra pelos diferentes pontos de tempo. Anote os eventos identificados de derramamento de células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcule o número de eventos de derramamento/tempo/comprimento da membrana basal, o que indica a taxa de derramamento de células. Conte até 5 villi/vídeo, e pelo menos dois vídeos/mouse. Calcule a média dessas 10 medidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vazamento<ol>
<li>Selecione um villus.</li>
		<li>Selecione a posição apropriada da pilha Z (superfície do villus, mas profunda o suficiente para evitar a interferência com células já derramadas e outros componentes presentes no lúmen). Conte o número total de células epiteliais/villus.</li>
		<li>Conte o número de pontos de vazamento (presença paracelular de rhodamine dextran. Este evento é transitório, o que pode ser confirmado verificando fotos anteriores e adquiridas.</li>
		<li>Calcule o número de vazamentos/número total de células epiteliais. Analise 10 villus/amostra/vídeo diferentes e calcule o número médio de vazamentos e células permeáveis/villus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn%27s+disease%3A+role+of+CARD15+3020insC+mutation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li>
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<li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li>
<li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li>
<li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li>
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<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li>
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<li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li>
<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li>
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<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
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</ol>

Embora tecnicamente desafiadora, a metodologia baseada em microscopia intravital representa uma abordagem experimental única para visualizar o processo celular altamente dinâmico em tempo real, como o desempenho de derramamento de células. Até agora, não há uma abordagem experimental alternativa para visualizar a extrusão celular in vivo. Acreditamos que este protocolo pode contribuir para a descrição de diversos processos celulares desempenhando um papel na manutenção da homeostase intestinal.
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O intestino é um órgão altamente especializado com uma função fortemente regulamentada que permite processos conflitantes, ou seja, nutrição e proteção contra substâncias luminais nocivas. Forro entre o corpo humano e o ambiente, o epitélio intestinal atua como uma barreira física e imunológica e contribui para a manutenção da homeostase mucosa no intestino1,,2. A perda de integridade epitelial e o aumento da permeabilidade da junção apertada é bem conhecido por estar associado à Doença Inflamatória Intestinal (DII)3,,4,,5,6. Alterações epiteliais são então consideradas como causas e amplificadores secundários para inflamação intestinal crônica no DII. Assim, uma melhor compreensão das alterações epiteliais precoces no intestino dos pacientes com IBD seria de imenso valor para o desenvolvimento de novas estratégias para restaurar a integridade epitelial para previsão confiável e posterior prevenção de recaídas do IBD.
O epitélio intestinal segue um processo de rotatividade complexo e bem regulado. A partir do fundo da cripta, as células epiteliais intestinais (IECs) terminantemente diferenciadas derivadas de células-tronco pluripotentes migram para cima para a ponta villus, onde células envelhecidas/danificadas são derramadas no lúmen7. O equilíbrio entre divisão e extrusão celular permite a manutenção dos números de células epiteliais intestinais, evitando a formação de lacunas e vazamentos, bem como o acúmulo de células epiteliais potencialmente levando a massas celulares e tumorigênese8,,9,,10. Apesar do papel fundamental do derramamento de células epiteliais na renovação fisiológica do epitélio intestinal, o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que conduzem a extrusão das células na ponta villus é limitado. Assim, há a necessidade de pesquisas básicas fornecendo uma descrição precisa da sequência de eventos moleculares envolvidos no derramamento de células epiteliais.
Interações complexas entre diferentes tipos de células dentro da mucosa intestinal são fundamentais para entender os mecanismos moleculares que regulam a rotatividade epitelial e a homeostase intestinal. Assim, estudos in vivo oferecem altas vantagens sobre abordagens in vitro e ex vivo nesse contexto. Além disso, as técnicas de imagem em tempo real permitem a descrição da sequência de eventos que controlam fenômenos específicos. Nesse contexto, o estudo de processos altamente dinâmicos exige o uso de técnicas otimizadas de alta resolução para a observação direta do tecido. As técnicas de imagem intravital aparecem como ferramentas únicas e adequadas para o estudo do derramamento de células epiteliais no intestino.
O termo "microscopia intravital" refere-se a abordagens experimentais que aproveitam técnicas de imagem de alta resolução (microscopia multifotícola ou confocal) para visualizar diretamente células e tecidos em seus ambientes nativos dentro de um animal vivo11. Permite a aquisição em tempo real de informações in vivo até a resolução unicelular, e implica vantagens claras sobre métodos estáticos ou de baixa resolução. A microscopia intravital fornece informações complementares e supera algumas limitações de técnicas clássicas e/ou high-end, como artefatos devido ao processamento de tecidos. Em contrapartida, a principal limitação da microscopia intravital é que o tecido deve ser diretamente exposto ao microscópio, que na maioria dos casos requer cirurgia. Embora abordagens sofisticadas preservem a vitalidade e minimizem o impacto do tecido imageado (câmaras de dobras cutâneas e janelas de imagem)12,13, na maioria dos casos é realizada uma simples incisão cutânea para a externalização do tecido (retalhos de pele)14. Na última década, essas abordagens contribuíram com evidências fundamentais sobre processos altamente dinâmicos, antes inescrutáveis. Traduzindo, a imagem em tempo real forneceu novas percepções biológicas sobre células-tronco e leucócitos15,bem como a disseminação do câncer e a formação de metástases13,16. No contexto clínico, a endomicroscopia é atualmente explorada como ferramenta diagnóstica de câncer17 e doenças gastrointestinais, como o IBD18,19; enquanto a microscopia confocal mosaico tornou-se uma ferramenta de patologia rápida durante a cirurgia20. Juntas, a microscopia intravital tem emergido recentemente como uma ferramenta valiosa e versátil para pesquisa biomédica e futura aplicação na clínica.
A microscopia intravital está aqui implementada para visualização em tempo real de vazamento epitelial intestinal e observação de eventos de derramamento de células epiteliais. O vazamento da permeabilidade intestinal pode ser identificado por outras técnicas in vivo não invasivas, como a quantificação da administração oral de rastreadores fluorescentes no soro21. No entanto, essa técnica não permite a observação direta do desempenho de derramamento nem a segregação entre permeabilidade para-e transcelular. A combinação de experimentos de rastreador padrão e microscopia intravital representa uma abordagem adequada para: i) identificar distúrbios na permeabilidade intestinal, e ii) segregar entre permeabilidade epitelial para e transcelular. Além do derramamento de células, a microscopia intravital em combinação com a rotulagem de fluorescência in vivo permite o estudo de outros mecanismos celulares e moleculares (por exemplo, redistribuição de junção apertada durante o derramamento de células usando camundongos repórteres fluorescentes22 ou interações entre IECs e outras células dentro da mucosa intestinal23).
O método aqui apresentado representa uma adaptação da microscopia intravital para permitir a observação em tempo real da mucosa intestinal, utilizando microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM). Portanto, usamos camundongos eliminatórios condicionais de GGTase (Geranylgeranyltransferase) em células epiteliais intestinais (IECs) em(camundongos Pggt1biΔIEC), uma vez que sofrem de uma doença intestinal grave e aumento da permeabilidade epitelial24. São descritas a preparação cirúrgica do camundongo e a coloração da mucosa intestinal, bem como as configurações adequadas utilizadas para aquisição de imagens e análise pós-aquisição. Este protocolo poderia permitir estudos futuros contribuindo para o conhecimento atual sobre dinâmica e cinética do derramamento de células epiteliais intestinais. Além disso, o protocolo poderia servir de base para várias adaptações para estudar outros fenômenos que ocorrem na superfície da mucosa intestinal, e até mesmo em outros tecidos.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de acriflavina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8251</td><td>1 mg / mL solução em</td></tr><tr><td>almofada isotérmica PBS Deltaphase</td><td>BrainTree</td><td>B-DP-PAD-Gemini</td><td></td></tr> <tr><td>Cautery System</td><td>BrainTree</td><td>B-GEM-5917-Ketamin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>WDT</td><td>9089.01.00</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td></td> <td>-</td></tr> <tr><td>microscópio LSM SP8</td><td>Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L182</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina B dextran</td><td>Invitrogen</td><td>D1824</td><td>10,000 kDa MW; solução de 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Fórceps padrão (Dumont SS)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203-23-Tesoura</td><td></td></tr> <tr><td>fina reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10-Tamoxifeno</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td>50 mg/mL in etanol</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td>1320422</td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

A microscopia intravital do intestino usando imagens confocal permite a observação em tempo real do derramamento de células epiteliais e vazamento de barreira em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal de camundongos anestesiados é topicamente manchada com coloração inespecífica (acriflavine) e um rastreador fluorescente (dextran rhodamine-B), montado em uma placa salina lavada e diretamente imageado usando um microscópio confocal. Esta técnica pode complementar outras técnicas não invasivas para identificar vazamento de permeabilidade intestinal, como a passagem transmucosal de rastreadores administrados oralmente. Além disso, a abordagem aqui apresentada permite a observação direta dos eventos de derramamento de células em tempo real. Em combinação com camundongos repórteres fluorescentes apropriados, esta abordagem é adequada para lançar luz em mecanismos celulares e moleculares que controlam a extrusão de células epiteliais intestinais, bem como para outros processos biológicos. Nas últimas décadas, estudos interessantes utilizando microscopia intravital contribuíram para o conhecimento sobre permeabilidade endotelial, homing intestinal de células imunes, comunicação imuno-epitelial e invasão de componentes luminosos, entre outros. Juntos, o protocolo aqui apresentado não só ajudaria a aumentar a compreensão dos mecanismos que controlam a extrusão de células epiteliais, mas também poderia ser a base para o desenvolvimento de outras abordagens a serem utilizadas como instrumentos para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos, mesmo em outros tecidos. Entre as limitações técnicas, as propriedades ópticas do tecido específico, bem como a configuração selecionada da tecnologia de imagem e microscópio, por sua vez, determinariam a distância de trabalho de imagem e a resolução de imagens adquiridas.

O protocolo aqui apresentado descreve uma abordagem baseada em microscopia intravital para visualizar o vazamento epitelial intestinal e observar o desempenho de derramamento de células no intestino em tempo real. Resumidamente, os camundongos são anestesiados e submetidos à preparação cirúrgica a fim de expor a superfície da mucosa do intestino delgado. Os IECs são então manchados através da aplicação tópica de acriflavina; enquanto a rhodamina luminal B-dextran é usada como rastreadores...

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Utilizando microscopia intravital, este protocolo permite a visualização em tempo real do tecido intestinal até uma resolução unicelular e o estudo de processos altamente dinâmicos, como o derramamento de células. Em combinação com os experimentos de rastreador padrão, este protocolo permite a identificação de ambos os distúrbios de permeabilidade intestinal in vivo e a distinção entre permeabilidade para e transcelular. Este protocolo poderia ser usado como base para o desenvolvimento de abordagens adicionais de microscopia intravital para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos de interesses dentro de vários tecidos.A demonstração visual desse método é essencial para compreender as etapas de preparação cirúrgica e posicionar o animal vivo de forma a facilitar a aquisição de imagens na superfície mucosa intestinal. Antes de iniciar o procedimento, ligue a caixa base e o scanner de um microscópio de varredura a laser confocal e pressione comece a ligar o computador. Inicie o software de aquisição de imagens e selecione a configuração apropriada.Para definir a resolução de imagem apropriada, selecione configuração, hardware, resolução, profundidade de bits e 12. No menu de aquisição, selecione XYZT para o modo de aquisição de imagens e defina o objetivo para 20 ou 40X. Para configurar a configuração de aquisição sequencial, clique em procurar e adicionar e selecionar entre quadros.Para configurar a sequência um, ligue a caixa de laser visível. Coloque o tubo fotomultiplier um para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Para configurar a sequência dois, ligue a caixa de laser visível.Ajuste o tubo fotomultiplier dois para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Em seguida, ative os lasers apropriados. Após confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, use um broto de algodão para aplicar pomada aos olhos do rato anestesiado e fazer uma incisão de um centímetro na região do ventrículo esquerdo do abdômen.Use fórceps para exteriorizar um segmento de três a cinco centímetros do intestino. Faça duas pequenas incisões na parte superior e inferior do segmento intestinal e introduza uma micropipette de vidro no lúmen intestinal. Em seguida, use a eletrocauterização para abrir o segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente ao longo do lado anti-mesentérico e expor a mucosa.Enxágüe o tecido brevemente com solução salina para remover o conteúdo fecal. Para coloração da superfície da mucosa intestinal, aplique 100 microliters de um miligrama por mililitro de solução acriflavina em gotículas na superfície mucosa exposta e permita que a mancha se desenvolva por três minutos antes de lavar a solução restante com PBS. Em seguida, aplique 100 microliters de uma solução de dextran de rhodamina dextran de dois mililitros em gotículas na mucosa para incubação de três minutos antes de lavar com PBS.Em seguida, coloque o supino do rato anestesiado em um slide de cobertura montado na câmara enxaguada com 37 graus Celsius salino, ajustando a posição, se necessário, e coloque a preparação no estágio do microscópio invertido. Imediatamente após colocar o mouse no palco, ligue a fonte de luz e ajuste a posição XY até que o eixo de iluminação esteja focado na preparação do tecido. Para selecionar o campo de visão, selecione o cubo de filtro apropriado.Abra o obturador e use as macro e micro rodas para se concentrar na superfície da mucosa intestinal. Ajuste a posição XY para localizar uma área na qual vários villi podem ser visualizados dentro do campo de visão e alterar o cubo do filtro para verificar se a coloração do dextran de rhodamina também é visível nessa área. Quando uma área de interesse for identificada, inicie a aquisição da imagem e selecione a sequência uma para ajustar a potência do laser, ganho e deslocamento para a sequência um.Em seguida, selecione a sequência dois e ajuste a potência do laser, ganhe e compense para a sequência dois. Para definir a faixa de pilha Z, abra o menu de entrega da pilha Z. Use o controle de acesso Z para se concentrar na superfície da mucosa e clique em começar.Concentre-se no limite inferior de onde o sinal ainda é detectável e clique no final. Defina os números de pilhas Z, evitando lapsos de tempo por mais de dois minutos por dois pontos de tempo consecutivos e abra o menu de tempo para selecionar minimizar e adquirir até parar. Para definir a média da linha, selecione procurar um, linha média dois, buscar dois e linha média dois.Em seguida, para adquirir imagens, defina o formato para 1024 x 1024 pixels e a velocidade para 400 e clique em iniciar. Camundongos condicionais deficientes epiteliais específicos das células epiteliais desenvolveram patologia intestinal grave, como demonstrado pelo aumento do escore de dano histológico do intestino delgado e aumento da permeabilidade epitelial intestinal também pode ser detectado através de rastreador em experimentos in vivo usando FITC-dextran administrado oralmente. Eventos de derramamento de células poderiam ser identificados como células que saem da monocamada epitelial para o lúmen, levando a lacunas temporárias no teto do epitélio que são finalmente fechadas pelo contato entre as células vizinhas, um chamado efeito zíper.Essas lacunas são observadas tanto no controle quanto em camundongos deficientes GGTase, embora a frequência desse fenômeno seja maior neste último. Curiosamente, outras células também parecem captar o Dextran. Esses chamados eventos celulares permeáveis também ocorrem principalmente em camundongos eliminatórios condicional.A imunossuagem de proteínas de interesse relacionadas ao citoesqueleto e a junção apertada pode ser realizada para identificar alvos específicos que contribuem para possíveis interrupções epiteliais de permeabilidade determinadas através de microscopia intravital. Este método pode ser utilizado para a análise de outros fenômenos na superfície da mucosa intestinal, como vazamento endotelial ou comunicação epitelial imune no contexto da infecção intestinal.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Os tratamentos actuais de doenças inflamatórias do intestino (IBD) destinam-se a atenuar os sintomas da doença, mas pode causar efeitos laterais graves. Assim, estratégias alternativas estão a ser investigados em modelos de colite em animais. Aqui, vamos explicar como os efeitos benéficos da dieta suplementos em sinais clínicos IBD são analisados ​​de tal modelo de colite.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.

Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Aprenda a usar microscopia intravital para visualizar em tempo real o desprendimento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Este método permite identificar distúrbios de permeabilidade e distinguir mecanismos para e transcelulares.

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Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

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