Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais
3 de dezembro de 2020
Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.
Utilizando microscopia intravital, este protocolo permite a visualização em tempo real do tecido intestinal até uma resolução unicelular e o estudo de processos altamente dinâmicos, como o derramamento de células. Em combinação com os experimentos de rastreador padrão, este protocolo permite a identificação de ambos os distúrbios de permeabilidade intestinal in vivo e a distinção entre permeabilidade para e transcelular. Este protocolo poderia ser usado como base para o desenvolvimento de abordagens adicionais de microscopia intravital para visualizar outros processos celulares altamente dinâmicos de interesses dentro de vários tecidos.
A demonstração visual desse método é essencial para compreender as etapas de preparação cirúrgica e posicionar o animal vivo de forma a facilitar a aquisição de imagens na superfície mucosa intestinal. Antes de iniciar o procedimento, ligue a caixa base e o scanner de um microscópio de varredura a laser confocal e pressione comece a ligar o computador. Inicie o software de aquisição de imagens e selecione a configuração apropriada.
Para definir a resolução de imagem apropriada, selecione configuração, hardware, resolução, profundidade de bits e 12. No menu de aquisição, selecione XYZT para o modo de aquisição de imagens e defina o objetivo para 20 ou 40X. Para configurar a configuração de aquisição sequencial, clique em procurar e adicionar e selecionar entre quadros.
Para configurar a sequência um, ligue a caixa de laser visível. Coloque o tubo fotomultiplier um para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Para configurar a sequência dois, ligue a caixa de laser visível.
Ajuste o tubo fotomultiplier dois para cima e defina o comprimento de onda de emissão. Em seguida, ative os lasers apropriados. Após confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, use um broto de algodão para aplicar pomada aos olhos do rato anestesiado e fazer uma incisão de um centímetro na região do ventrículo esquerdo do abdômen.
Use fórceps para exteriorizar um segmento de três a cinco centímetros do intestino. Faça duas pequenas incisões na parte superior e inferior do segmento intestinal e introduza uma micropipette de vidro no lúmen intestinal. Em seguida, use a eletrocauterização para abrir o segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente ao longo do lado anti-mesentérico e expor a mucosa.
Enxágüe o tecido brevemente com solução salina para remover o conteúdo fecal. Para coloração da superfície da mucosa intestinal, aplique 100 microliters de um miligrama por mililitro de solução acriflavina em gotículas na superfície mucosa exposta e permita que a mancha se desenvolva por três minutos antes de lavar a solução restante com PBS. Em seguida, aplique 100 microliters de uma solução de dextran de rhodamina dextran de dois mililitros em gotículas na mucosa para incubação de três minutos antes de lavar com PBS.
Em seguida, coloque o supino do rato anestesiado em um slide de cobertura montado na câmara enxaguada com 37 graus Celsius salino, ajustando a posição, se necessário, e coloque a preparação no estágio do microscópio invertido. Imediatamente após colocar o mouse no palco, ligue a fonte de luz e ajuste a posição XY até que o eixo de iluminação esteja focado na preparação do tecido. Para selecionar o campo de visão, selecione o cubo de filtro apropriado.
Abra o obturador e use as macro e micro rodas para se concentrar na superfície da mucosa intestinal. Ajuste a posição XY para localizar uma área na qual vários villi podem ser visualizados dentro do campo de visão e alterar o cubo do filtro para verificar se a coloração do dextran de rhodamina também é visível nessa área. Quando uma área de interesse for identificada, inicie a aquisição da imagem e selecione a sequência uma para ajustar a potência do laser, ganho e deslocamento para a sequência um.
Em seguida, selecione a sequência dois e ajuste a potência do laser, ganhe e compense para a sequência dois. Para definir a faixa de pilha Z, abra o menu de entrega da pilha Z. Use o controle de acesso Z para se concentrar na superfície da mucosa e clique em começar.
Concentre-se no limite inferior de onde o sinal ainda é detectável e clique no final. Defina os números de pilhas Z, evitando lapsos de tempo por mais de dois minutos por dois pontos de tempo consecutivos e abra o menu de tempo para selecionar minimizar e adquirir até parar. Para definir a média da linha, selecione procurar um, linha média dois, buscar dois e linha média dois.
Em seguida, para adquirir imagens, defina o formato para 1024 x 1024 pixels e a velocidade para 400 e clique em iniciar. Camundongos condicionais deficientes epiteliais específicos das células epiteliais desenvolveram patologia intestinal grave, como demonstrado pelo aumento do escore de dano histológico do intestino delgado e aumento da permeabilidade epitelial intestinal também pode ser detectado através de rastreador em experimentos in vivo usando FITC-dextran administrado oralmente. Eventos de derramamento de células poderiam ser identificados como células que saem da monocamada epitelial para o lúmen, levando a lacunas temporárias no teto do epitélio que são finalmente fechadas pelo contato entre as células vizinhas, um chamado efeito zíper.
Essas lacunas são observadas tanto no controle quanto em camundongos deficientes GGTase, embora a frequência desse fenômeno seja maior neste último. Curiosamente, outras células também parecem captar o Dextran. Esses chamados eventos celulares permeáveis também ocorrem principalmente em camundongos eliminatórios condicional.
A imunossuagem de proteínas de interesse relacionadas ao citoesqueleto e a junção apertada pode ser realizada para identificar alvos específicos que contribuem para possíveis interrupções epiteliais de permeabilidade determinadas através de microscopia intravital. Este método pode ser utilizado para a análise de outros fenômenos na superfície da mucosa intestinal, como vazamento endotelial ou comunicação epitelial imune no contexto da infecção intestinal.
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Visão Geral
Este protocolo utiliza microscopia intravital para visualizar em tempo real a eliminação de células epiteliais intestinais em animais vivos. O método permite a obtenção de imagens da mucosa intestinal com resolução em nível de única célula, facilitando o estudo de processos celulares dinâmicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Técnicas de Microscopia
Contexto
- A microscopia intravital fornece informações sobre a dinâmica de tecidos vivos.
- O entendimento da permeabilidade intestinal é crucial para diversos estudos biológicos.
- A descamação celular é um processo significativo na saúde e doença intestinais.
- A imagem em tempo real aprimora o estudo dos comportamentos celulares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a descamação de células epiteliais intestinais in vivo.
- Identificar distúrbios na permeabilidade da barreira intestinal.
- Distinguir entre mecanismos de permeabilidade paracelular e transcelular.
Métodos Utilizados
- Microscopia intravital para imagem em tempo real.
- Coloração tópica da mucosa intestinal com acriflavina e dextrana-rhodamina B.
- Microscopia confocal para obter resolução em nível de célula única.
- Experimentos padrão com traçadores para avaliar a permeabilidade.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da descamação celular em tecido intestinal vivo.
- Identificação de processos dinâmicos que afetam a permeabilidade intestinal.
- Demonstração da aplicabilidade do método a outros tecidos.
- Compreensão aprimorada da preparação cirúrgica para imageamento.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica intestinal.
- A imagem em tempo real pode levar a novas descobertas sobre processos celulares.
- Este método pode inspirar pesquisas adicionais em diversos contextos biológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia intravitai permite a visualização em tempo real da dinâmica do epitélio intestinal, proporcionando observação direta da função de barreira e da eliminação celular in vivo. Esta abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas na validação de alvos gastrointestinais ao associar perturbações moleculares a resultados funcionais de permeabilidade. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer dados quantitativos e com resolução espacial sobre a integridade epitelial e os processos de reparação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas correlacionando intervenções genéticas ou farmacológicas com eventos em tempo real de descamação epitelial e vazamento da barreira.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da visualização direta de distúrbios na permeabilidade intestinal em sistemas vivos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir entre mecanismos de permeabilidade paracelular e transcelular, contribuindo para avaliação de risco baseada em mecanismos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo fenótipos basais de descamação e permeabilidade em modelos relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de imagem quantitativa do fluxo de traçadores e eventos de extrusão celular.
- Valor da Plataforma: Destaca prontidão para triagem e escalabilidade ao permitir o monitoramento longitudinal de processos intestinais dinâmicos em preparações anestesiadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças e o alinhamento translacional de biomarcadores, conectando observações intravitais a escores histológicos de dano e ensaios de permeabilidade baseados em traçadores.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo a avaliação longitudinal da reparação epitelial e da restauração da barreira.
- Avanço Ajustado ao Risco: Foca no valor preditivo de desalavancagem de riscos, identificando eventos celulares permeáveis e a reconstituição mediada por zíper como leituras funcionais da resiliência epitelial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, apoiando o aprimoramento iterativo de alvos gastrointestinais com base em resultados funcionais da barreira.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia a testagem de hipóteses, a elucidação de vias ou a redução de riscos biológicos ao permitir a correlação em tempo real de modificações moleculares com a descamação epitelial e a função de barreira.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade ou as saídas quantitativas quando apoiadas pelo artigo por meio da administração padronizada de traçadores e da imagem confocal do fluxo de dextrano através da mucosa intestinal.
- Análises: Destaca medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições, incluindo aquisição de Z-stacks, média de linhas e imagens com lapso de tempo da frequência de descamação e formação de lacunas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método à continuidade pré-clínica ou ao alinhamento com biomarcadores somente quando a fonte o apoia, vinculando eventos de descamação intravitais a danos histológicos aumentados e à permeabilidade ao FITC-dextrano em modelos de knockout condicional.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, enfatizando sua aplicabilidade a outros processos celulares altamente dinâmicos em diversos tecidos além da mucosa intestinal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar mais precisas, eficiência de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica obrigatória em microscopia intravital, preparação cirúrgica e imagem confocal.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo microscópio confocal de varredura a laser, objetivas apropriadas (20X/40X) e capacidades de aquisição sequencial.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de coloração (acriflavina e dextrano de rodamina-B), configuração de pilhas Z e parâmetros de lapso de tempo.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo linhagens transgênicas com repórteres e modelos de "knockout" condicional para análise específica de tipo celular.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: as propriedades ópticas do tecido, a tecnologia de imagem e a configuração do microscópio determinam a distância de trabalho e a resolução.
