Name: Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo de infecção larval em zebrafish para Clostridioides difficile usando microinjeção e microgavagem. Este método permite estudar respostas imunes inatas a patógenos anaeróbios em tempo real.

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Somos gratos a Timo Fritsch por um excelente cuidado animal. Agradecemos aos membros dos laboratórios Köster e Steinert por apoio e discussões úteis. Agradecemos ao Dr. Dandan Han por ler o manuscrito. Reconhecemos com gratidão o financiamento do Estado Federal da Baixa Saxônia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Todo o trabalho animal descrito aqui foi realizado de acordo com as normas legais (DIRETIVA UE 2010/63, licença AZ 325.1.53/56.1-TUBS e licença AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparação de Agarose de Baixo Derretimento, Placa de Gel e Agulhas microinjeção/microgavage
<ol><li>Dissolver 0,08 g de agarose de baixo derretimento (Tabela de Materiais, agarose A2576) em 10 mL de 30% danieau médio (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) e 17,4 mM NaCl, armazenados à temperatura ambiente (RT) para obter uma solução de 0,8%. NOTA: Podem ser utilizadas concentrações mais altas ou menores de agarose. No entanto, o tempo necessário para solidificar varia para diferentes marcas de agarose, mesmo na mesma concentração.</li>
	<li>Prepare microinjeção e agulhas de microgavage a partir de capilares de vidro (Tabela de Materiais).<ol>
<li>Use um puxador de micropipette com as seguintes configurações (note que as unidades são específicas para o puller usado aqui; veja Tabela de Materiais): agulhas de microinjeção (pressão de ar = 500; calor = 400; pull = 125; velocidade = 75; tempo = 150); e agulhas de microgavage (pressão de ar = 500; calor = 400; puxar = 100; velocidade = 75; tempo = 150). Use uma ponta de microcarregador para carregar 3 μL de H2O sem nuclease na agulha puxada.</li>
		<li>Introduza a agulha no injetor e aperte-a corretamente. Ajuste a agulha em um ângulo adequado para injeção. Defina a pressão de injeção entre 600-900 hPa para agulha de microinjeção e 200-300 hPa para agulha de gavage.</li>
		<li>Coloque uma gota de óleo mineral no círculo preto do slide de calibração. Use fórceps finos para cortar a ponta da agulha. Injete uma gota no óleo mineral para medir o tamanho da gotícula.</li>
		<li>Para microinjeção, ajuste o tempo de injeção para obter uma gotícula com um diâmetro de 0,10 a 0,12 mm, o que equivale a um volume de 0,5 a 1,0 nL. Para microgavage, obtenha uma gotícula com diâmetro de 0,18 a 0,20 mm, o que equivale a um volume de 3-5 nL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma placa de 1,5 % de agarose com agarose (Tabela de Materiais, 8050) em uma placa petri de 10 cm em 30% do meio de Danieau usando um molde de plástico como molde de microgavage. Armazene a 4 °C para evitar a dessecação até que seja necessário. Aqueça-se a RT ou 28 °C antes do experimento.</li>
</ol>2. Preparação e Rotulagem de C. difficile e Esporos com Corante Fluorescente
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de 1 mM de um corante fluorescente (Tabela de Materiais). Como o tintura é vendido em 50 μg de aliquots de pó, adicione 69 μL de DMSO ao frasco para obter uma concentração de estoque de 1 mM.</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de 100 μM do corante fluorescente adicionando 2 μL de 1 mM solução de estoque a 18 μL de DMSO em um tubo de centrífuga, e misture bem.</li>
	<li>Cultura C. difficile (R20291, uma cepa ribótipo 027) inoculando 10 mL de meio líquido BHIS com duas a três colônias de uma placa em um capô anaeróbico sem tremer durante a noite. BHIS é BHI complementado com extrato de levedura de 0,5% (w/v) e 0,1% (v) L-cysteine. Dissolva 1 g de L-cysteine em 10 mL de ddH2O e esterilizar por filtração, em seguida, adicione ao meio autocelava para obter uma concentração final de 1 g/L. As placas são preparadas adicionando 15 g/L agar-agar ao meio antes da autovérquim. O culismo seletivo de C. difficile é feito utilizando placas de cromid C. difficile (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloração C. difficile com o corante fluorescente<ol>
<li>Harvest C. difficile em um OD600 de 1.0-1.2 e lave 1x com 1 mL de 1x PBS (5.000 x g por 3 min na RT). Resuspender em 1 mL de 1 x PBS.</li>
		<li>Adicione 3 μL de solução de trabalho do corante fluorescente em 1 mL de suspensão de bactérias. Incubar a amostra de 15 min na RT no escuro. Lave o C. difficile manchado uma vez com 1 mL PBS para remover corante residual e resuspender em 1x PBS para um OD600 de 1.0 (1.0 OD600 é aproximadamente equivalente a 108 cfu/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeção de C. difficile manchado em larvas de zebrafish
<ol><li>Anestesia 20-30 larvas de zebrafish em 5 dias após a fertilização (referida aqui como 5 dpf) com 0,02%-0,04% tricaine (pó de tricaina é dissolvido em água destilada duplamente e ajustada para pH = 7 com 1 M Tris-HCL solução) em 30% o médio de Danieau ~10 min antes Injeção. Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de Petri fresca de 10 cm e remova qualquer excesso de 30% do meio de Danieau.</li>
	<li>Coloque uma queda de 0,8% de baixo derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish para cobrir. Ajuste delicadamente as larvas em uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30-60 s para permitir que a agarose de baixo derretimento se solidifique. Adicione 30% do meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% de tricaine para cobrir a agarose.</li>
	<li>Prepare a solução de injeção. Adicione 1 μL de vermelho fenol de 0,5% na solução PBS em 9 μL do inóculo c. difficile manchado de tinta para visualizar o processo de injeção.</li>
	<li>Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um microcarregador. Coloque a agulha carregada em um micromanipulador e posicione-a um estereótipo.</li>
	<li>Ajuste a pressão de injeção entre 600-900 hPa. Defina o tempo de injeção para 0,1-0.3 s para obter 0,5-1.0 nL. Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de ~45°apontando para as larvas incorporadas.</li>
	<li>Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal perto do poro urogenital. Fure através da agarose, em seguida, o músculo com a ponta da agulha, em seguida, inseri-lo no lúmen intestinal e injetar 0,5-1.0 nL de C. difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e pegar as larvas devidamente injetadas para imagens confocais.</li>
</ol>4. Geração de Larvas gnotobióticas de zebrafish
<ol><li>Use o método de reprodução natural bem estabelecido para gerar embriões de zebrafish gnotobióticos, incluindo: fertilização in vitro, lavagem com meio contendo antibióticos (1 μg/mL amphoticina B, 10 μg/mL kanamycin, e 20 μg/mL ampicillin), lavagem com 0,1% wt/vol polisrolido-iodo (PVP-I) solução, e incubação dos embriões em um capuz de cultura celular12.</li>
	<li>Mantenha todas as larvas gnotobióticas de zebrafish condições gnotobióticas até 5 dpf ou pouco antes do gavage. Após o gavage, as larvas de zebrafish serão transferidas para uma incubadora padrão, mas com 30% de danieau estéril.</li>
</ol>5. Gavage de Larvas de Zebrafish
<ol><li>Calibrar a agulha do microgavage como descrito na etapa 1.2.</li>
	<li>Meça o diâmetro da ponta da agulha colocando a agulha em um slide de calibração com uma gota de óleo mineral. Certifique-se de que a ponta tem 30 a 40 μm de diâmetro, contundente e lisa. Descarte as agulhas afiadas ou ásperas. NOTA: Bordas afiadas de agulhas podem ser cegas por fogo rápido.</li>
	<li>Prepare a solução gavage como descrito na etapa 3.3.</li>
	<li>Carregue e coloque a agulha em um micromanipulador conforme descrito na etapa 3.4. Ajuste o micromanipulador para posicionar a agulha em um ângulo de 45°.</li>
	<li>Anestesiar as larvas de zebrafish referidas na etapa 3.1. Quando as larvas pararem de se mover, transfira-as para o sulco de um molde microgavage usando uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Coloque uma queda de 0,8% de baixo derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish para cobrir. Ajuste delicadamente as larvas com cabeças viradas para a direita em ângulos de 45° no sulco e caudas contra a parede do sulco. Certifique-se de que os ângulos das cabeças são aproximadamente os mesmos para que estejam alinhados com o ângulo das agulhas gavage. Coloque o molde de microgavage no gelo por 30-60 s, permitindo que a agarose de baixo derretimento se solidifique para estabilizar as posições das larvas.</li>
	<li>Ajuste a pressão de injeção entre 200-300 hPa. Ajuste o tempo de injeção para 0,1-0.3 s para obter um volume de injeção de 3-5 nL de C. difficile.
</li>
	<li>Opere delicadamente a agulha através da agarose e depois na boca de larvas de zebrafish, através do esôfago. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da lâmpada intestinal anterior, pressione o pedal de injeção para liberar a bactéria. Encha o lúmen do intestino com o volume entregue. Não deixe transbordar do esôfago ou cloaca. Retire suavemente a agulha da boca do zebrafish.</li>
	<li>Após o gavage, resgate as larvas infectadas de zebrafish da agarose com uma ponta flexível de microloader, primeiro cortando a agarose para longe, em seguida, levantando as larvas. Transfira essas larvas para o meio estéril de 30% de Danieau. Enxágüe as larvas em meio estéril duas vezes. Transfira as larvas para uma placa de Petri fresca de 10 cm. As larvas serão mantidas por até 11 dpf.</li>
</ol>6. Análise de microscopia confocal de larvas de zebrafish injetadas
<ol><li>Larvas de zebrafish anestesiadas referem-se à etapa 3.1. Faça um buraco no fundo de uma placa de Petri de 35 mm com um escorregador de vidro preso ao orifício, referido como a câmara de imagem. Transferir embriões para o fundo da câmara de imagem com uma quantidade adequada de 30% do meio de Danieau.</li>
	<li>Adicione 200-300 μL de 1% de agarose de derretimento baixa para cobrir as larvas anestesiadas. Uma vez que um microscópio confocal invertido é usado, coloque a região infectada das larvas contra o deslizamento de vidro o mais próximo possível.</li>
	<li>Deixe a agarose solidificar no gelo por 30-60 s. Submerge a agarose com 30% de Danieau contendo 0,02%-0,04% tricaine.</li>
	<li>Imagem das larvas com um microscópio de varredura a laser confocal (Tabela de Materiais).</li>
</ol>7. Dissecção de intestino zebrafish larval para recuperar viável C. difficile
<ol><li>Isolar os tratos gastrointestinais das larvas para analisar a carga bacteriana. Comece por eutanizar larvas de zebrafish com 0,4 % tricaine.</li>
	<li>Enxágüe o zebrafish brevemente com PBS 1x estéreis e transfira-os para uma placa de agarose fresca.</li>
	<li>Dissecação de zebrafish<ol>
<li>Insira uma agulha no tronco dorsal das larvas de zebrafish perto da cabeça para imobilizar o zebrafish. Remova a cabeça atrás das brânquias com uma lança.</li>
		<li>Insira a segunda agulha no meio do tronco dorsal. Insira a terceira agulha no abdômen do zebrafish e puxe o intestino para fora da cavidade corporal. NOTA: São necessários cuidados extremos para isolar o intestino intacto. Se for difícil fazê-lo, realize puxões adicionais para separar o resto do intestino dos órgãos internos restantes.</li>
		<li>Use uma agulha de microinjeção para transferir intestinos de 10 a 15 em um tubo de 1,5 mL contendo 200 μL estéreis de 1x PBS.</li>
		<li>Homogeneize os intestinos com um pilão para interromper o tecido e preparar homogeneiza. Certifique-se de que o pilão chegue ao fundo do tubo para interromper todos os intestinos completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar os homogeneizados em C. difficile meio contendo D-cicloserina e cefoxitina, com ou sem taurochola (TCA, um germinante de esporos c. difficile) em uma câmara anaeróbica.</li>
	<li>Incubar a placa anaerobicamente por 48 h a 37 °C.</li>
	<li>Use cultura bacteriana para rRNA-PCR 16S.<ol>
<li>Resuspender uma colônia em 50 μL de H2O e fervê-la a 95 °C por 15 min. Pelotas os detritos lised por centrífuga (14.000 rpm para 2 min na RT) e usar 2 μL do supernatant como modelo em 25 μL de reação PCR usando primers c. difficile-específico (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').</li>
		<li>Quando as bactérias da cultura líquida são utilizadas, colher 1 mL de cultura e lavar uma vez com 1 mL de PBS (14.000 rpm por 2 min na RT). Resuspender a pelota em 100 μL de H2Odd e tratar como feito acima. Para caracterizar ainda mais colônias bacterianas, raia em um BHIS ou palid-placa(Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos apresentados modificam e estendem uma abordagem existente para infectar larvas de zebrafish realizando injeção e microgavage10,14. Também demonstra uma abordagem para estudar patógenos anaeróbicos com larvas de zebrafish22. Além disso, o protocolo facilita a análise das respostas inatas das células imunes inatos no vivo sobre o CDI e após a colonização de C. difficile em zebrafish. O método é reprodutível e fácil de rea...

C. difficile é um bacilo produzido por esporos, anaeróbico e produtor de toxinas que é a principal causa de infecções graves no trato gastrointestinal1. Os sintomas típicos do CDI incluem diarreia, dor abdominal e colite pseudomembrannosa fatal, e às vezes pode levar à morte1,2. Evidências mostraram que as respostas imunes hospedeiras desempenham um papel crítico tanto na progressão quanto no resultado desta doença3. Além da resposta imune, a microbiota intestinal indígena é crucial para o início e a patogênese do CDI4. Na última década, tanto o número de casos quanto a taxa de mortalidade do DiEd aumentaram significativamente devido ao surgimento de uma cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos subjacentes e o papel da microbiota durante o CDI ajudarão a levar a novos desenvolvimentos terapêuticos e avanços, possibilitando um melhor controle desta epidemia.
Vários modelos animais, como o hamster e o rato, foram desenvolvidos para fornecer uma visão da defesa imunológica contra C. difficile7,8. No entanto, o papel das células imunes inatas ainda é mal compreendido, particularmente porque o comportamento inato das células imunes é derivado principalmente da análise histológica ou células cultivadas in vitro. Portanto, estabelecer um modelo transparente de zebrafish para revelar a resposta imune inata a C. difficile dentro de um organismo de vertebrado vivo facilitará tais estudos. As larvas de zebrafish têm um sistema imunológico inata funcional, mas não têm o sistema imunológico adaptativo até 4-6 semanas após a fertilização9. Essa característica única faz das larvas de zebrafish um excelente modelo para estudar a resposta isolada e a função das células imunes inatas no CDI.
Este relatório descreve novos métodos usando larvas de zebrafish para estudar as interações entre C. difficile e células imunes inatas, como macrófagos e neutrófilos. Primeiro, um protocolo de microinjeção localizado que inclui c. difficile inoculum e coloração é apresentado. Usando imagens de lapso de tempo confocal in vivo, a resposta de neutrófilos e macrófagos em relação ao local da infecção é registrada, e observa-se a fagocitose de bactérias por neutrófilos e macrófagos. No entanto, foi relatado que a injeção em si causa danos teciduais e leva ao recrutamento de leucócitos independentes das bactérias10. Portanto, um protocolo microgavage não invasivo para entregar C. difficile no intestino de larvas de zebrafish é posteriormente descrito. Estudos anteriores demonstraram que a microbiota gastrointestinal indígena protege um hospedeiro contra a colonização de C. difficile11. Portanto, larvas de zebrafish gnotobióticos também são usadas para predispor os zebrafish que estão infectados 12. Posteriormente, a dissecção intestinal é realizada para recuperar o difundido c. viável e validar a duração de sua presença em tratos intestinais de zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td>Agarose gelificante ultrabaixa</td></tr><tr><td>Bagrose de baixo ponto de fusão (LM)</td><td>Pronadisa</td><td>8050</td><td>É usado em placas de agarose</td></tr><tr><td>BacLight Red Bacterial Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35001</td><td>Corante fluorescente</td></tr><tr><td>Caldo de infusão cérebro-coração</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X916.1</td><td></td></tr><tr><td>Latão (tipo selvagem)</td><td></td><td></td><td>deficiente na síntese de melanina, usado para gerar linhas transgênicas estáveis</td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Vidro Capilar</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0019</td><td>Agulhas de injeção</td></tr><tr><td>Clostridioides difficile</td><td></td><td></td><td>R20291,, uma cepa de ribotipo 027, produção de TcdA+/TcdB+/CDT+</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A994</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de</td><td>código</td><td></td> aberto FIJI <td>Processamento de imagem</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de agulha horizontal</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Processamento de imagem</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P026</td><td></td></tr><tr><td>Micro injetor</td><td>eppendorf</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de microinjeção</td><td>Ferramentas científicas adaptáveis</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8149</td><td></td></tr><tr><td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>stable linhagem transgénica na qual os promotores de lyZ conduzem a expressão da proteína fluorescente EGFP em neutrófilos</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>stable linha transgênica em que o mpeg1.1 conduz a expressão da proteína fluorescente EGFP em macrófagos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um modelo de infecção de zebrafish larval para clostridioides difficile

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

A infecção por clostridioides difficile (CDI) é considerada uma das infecções gastrointestinais mais comuns associadas à saúde nos Estados Unidos. A resposta imune inata contra C. difficile foi descrita, mas os papéis exatos dos neutrófilos e macrófagos no CDI são menos compreendidos. No presente estudo, larvas de Danio rerio (zebrafish) são usadas para estabelecer um modelo de infecção por C. difficile para a imagem do comportamento e cooperação dessas células imunes inatas inatas inatas invivas. Para monitorar C. difficile, foi estabelecido um protocolo de rotulagem usando um corante fluorescente. Uma infecção localizada é alcançada pela microinjeção rotulada de C. difficile, que cresce ativamente no trato intestinal de zebrafish e imita o dano epitelial intestinal no CDI. No entanto, esse protocolo de infecção direta é invasivo e causa feridas microscópicas, que podem afetar os resultados experimentais. Assim, um protocolo microgavage mais não invasivo é descrito aqui. O método envolve a entrega de células C. difficile diretamente no intestino de larvas de zebrafish por intubação através da boca aberta. Este método de infecção imita de perto a rota de infecção natural de C. difficile.

C. difficile é estritamente anaeróbico, mas o cromosforo de proteínas fluorescentes geralmente requer oxigênio para amadurecer. Para superar esse problema, um corante fluorescente foi usado para manchar células c. difficile vivas que estavam crescendo ativamente (R20291, uma cepa ribótipo 027; Figura 1A). Usando o sistema Gal4/UAS, foram geradas linhas de zebrafish transgênicas estáveis para imagens vivas, nas quais os promotores mpeg1.1 ou lyZ...

Apresentado aqui é um método seguro e eficaz para infectar larvas de zebrafish com c. anaeróbico fluorescente rotulado por microinjeção e microgavage não invasivo.

Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Este método pode responder à pergunta-chave sobre o papel do sistema imunológico inato na infecção pelo Clostridium, como se e como os macrófagos reconhecem ou fagocitam esse patógeno. A principal vantagem deste método é que ele pode ser aplicado a muitas bactérias anaeróbicas diferentes, que o tempo de infecção pode ser manipulado, e que a administração oral representa a infecção humana normal muito mais próxima. Depois de cultivar, transfira um mililitro da cultura em um cuvette espectrômetro, e meça o OD600.Transfira a quantidade necessária para um tubo fresco de 1,5 mililitro, a fim de alcançar um OD final de 1 a 1,2 em um mililitro de volume final. Lave uma vez com um mililitro de 1X PBS, e centrífuga a 5.000 vezes g por três minutos em temperatura ambiente. Resuspend em um mililitro de 1X PBS.Adicione três microliters de solução de trabalho do corante fluorescente preparado na suspensão bacteriana de um mililitro. Incubar a amostra por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, lave o Clostridioides difficile manchado uma vez com 1X PBS para remover corante residual, e resuspend em um mililitro de 1X PBS para alcançar um OD600 de 1.0.Primeiro, coloque uma queda de 0,8% de baixa derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish em uma placa de Petri para cobrir. Ajuste suavemente as larvas para uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30 a 60 segundos para permitir que a agarose de baixo derretimento se solidifique.Adicione 30% o meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% tricaine para cobrir a agarose. Para preparar a solução de injeção, adicione um microliter de 0,5% de fenol vermelho na solução PBS em nove microliters do clostridioides difficile inoculum manchado de corante. Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um Microcarregador.Monte a agulha carregada em um micromanipulador, e posicione-a sob um microscópio estéreo. Ajuste a pressão de injeção entre 600 e 900 hectopascals. Defina o tempo de injeção para 0,1 a 0,3 segundos para obter nanolitadores de 0,5 a 1,0.Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de aproximadamente 45 graus, apontando para as larvas incorporadas. Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal, perto do poro urogenital. Perfure a agarose, depois o músculo com a ponta da agulha.Em seguida, insira-o no lúmen intestinal, e injete de 0,5 a 1,0 nanolitadores de Clostridioides difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e use uma ponta de Microloader flexível para pegar as larvas injetadas adequadamente para imagens confocal. Em uma placa de 1,5% de agarose com ranhuras, coloque uma queda de 0,8% de baixa derretimento nas larvas de zebrafish para cobrir.Ajuste suavemente as larvas com cabeças viradas para a vertical em ângulos de 45 graus na ranhura e caudas contra a parede da ranhura. Opere suavemente a agulha através da agarose, depois na boca de larvas de zebrafish, através do esôfago. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da lâmpada intestinal anterior, pressione o pedal de injeção para liberar 0,5 para um nanoliters da cultura das bactérias.Encha o lúmen do intestino. Não deixe transbordar do esôfago ou cloaca. Retire suavemente a agulha da boca do zebrafish.Após gavage, resgate as larvas de zebrafish infectadas da agarose com uma ponta de Microloader flexível cortando primeiro a agarose, depois levantando as larvas. Transfira essas larvas para o meio estéril de 30% de Danieau e enxágue duas vezes. Depois de anestesiar as larvas de zebrafish, adicione 200 a 300 microliters de 1% de baixa derretimento agarose para cobrir as larvas anestesiadas.Coloque a região infectada das larvas contra uma lâmina de vidro o mais próximo possível. Deixe a agarose solidificar no gelo por 30 a 60 segundos. Submergir a agarose em 30% médio de Danieau contendo 0,02% a 0,04%.Vá para a imagem das larvas com um microscópio de varredura a laser confocal. Depois de eutanásia das larvas de zebrafish infectadas, insira uma agulha no tronco dorsal de larvas de zebrafish perto da cabeça para imobilizar o zebrafish. Remova a cabeça atrás das brânquias com uma lanceta.Insira uma segunda agulha no meio do tronco dorsal. Insira uma terceira agulha no abdômen do zebrafish, e puxe o intestino para fora da cavidade corporal. Use uma agulha de microinjeção para transferir 10 a 15 intestinos para um tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microliters de PBS 1X estéreis.Homogeneize os intestinos com um pilão para interromper o tecido e preparar homogeneizadores. Certifique-se de que o pilão chegue ao fundo do tubo para interromper completamente todos os intestinos. Nos homogeneizadores, adicione clostridioides difficile meio de criação contendo D-cicloserina e cefoxitina, com ou sem taurocholate, e incubar em uma câmara anaeróbica.Neste estudo, tanto os neutrófilos quanto os macrófagos chegam aos locais de infecção. O exemplo de uma fagocitação de macrófago ativado duas bactérias mostra a clareira por fagocitose e digestão do clostridioides difuso rotulado. O microgavage para fornecer clostridioides rotulados de fluorescência difficile no lúmen intestinal das linhas de repórter macrófago e neutrófilo em cinco dias após a fertilização imita o caminho natural da infecção difficile clostridioides.No entanto, neutrófilos e macrófagos não mostraram migração óbvia para o trato gastrointestinal por até 12 horas após a microgavage. Enquanto isso, a fluorescência do clostridioides difficile rotulado desapareceu após cerca de cinco horas após a microgavage. Amostras intestinais 24 horas após a infecção foram dissecadas e mostraram crescimento bacteriano.Nenhuma bactéria cresceu no grupo controle. Posteriormente, as amostras incubadas só cresciam no meio contendo TCA, sugerindo que clostridioides totais difficile no intestino tinham formado esporos. 16S rDNA PCR identificou a bactéria cultivada como Clostridioides difficile, que produzem amplicons PCR específicos de tamanho previsível em torno de 800 pares de base.As culturas bacterianas cultivadas em uma placa CHROMID apareceram como colônias negras típicas, o que indicou ainda que as bactérias dos intestinos de zebrafish eram clostridioides difficile. Trabalhar com bactérias anaeróbicas requer que os passos aeróbicos sejam mantidos curtos porque isso influencia a biologia das bactérias, é claro. Células imunes inatas em zebrafish podem ser manipuladas.Por exemplo, eles podem decifrar o mecanismo das respostas das células imunes inatas à infecção. Nosso método indicou que o zebrafish pode ser uma ferramenta para estudar patógeno anaeróbico do intestino humano. Trabalhar com patógenos multi-resistentes requer que medidas de segurança apropriadas sejam tomadas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Fonte: Li, J. et al. Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a entrega baseada em microinjeção de Clostridioides difficile marcado com fluorescência no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra anestesiada. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação larval, injeção bacteriana e confirmação baseada em microscopia de fluorescência da localização bacteriana no intestino.

Entrega localizada de bactérias no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra usando microinjeção

Fonte: Li, J., et. al., Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o isolamento e a cultura da bactéria Clostridioides difficile do intestino de larvas de peixe-zebra. O intestino infectado é dissecado, homogeneizado e incubado em meio anaeróbico seletivo contendo antibióticos. Essas condições suprimem micróbios concorrentes e promovem o crescimento de células viáveis.

Isolamento e Cultura de Bactérias Clostridioides difficile do Intestino Larval de Peixe-Zebra

Fonte: Flores, E., et al. Utilizando o protozoário Paramecium caudatum como veículo para infecções alimentares em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de estabelecer um modelo de infecção intestinal bacteriana transmitida por alimentos em larvas de peixe-zebra, alimentando-as com paramecia infectada com E. coli fluorescente.

Modelagem de Infecção Intestinal em Larvas de Peixe-Zebra usando Bactérias Transmitidas por Alimentos

Fonte: Winston, J. A., et al. Modelo de camundongo tratado com cefoperazona da cepa clinicamente relevante de Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o procedimento para inocular camundongos pré-tratados com antibióticos com esporos de Clostridium difficile para estabelecer um modelo murino de infecção para estudar patogênese e respostas do hospedeiro.

Estabelecendo um modelo camundongo para infecção por Clostridium difficile

Fonte: Li, J., et al. Desenvolvimento de um modelo larval de infecção por peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o procedimento de microgavage, no qual uma larva de peixe-zebra anestesiada é imobilizada em agarose e injetada oralmente com uma bactéria patogênica usando uma agulha guiada por traçadores. O parto não invasivo imita infecção natural, permitindo a análise da replicação bacteriana, liberação de toxinas e danos epiteliais intestinais.

Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra usando microgavage

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Este protocolo descreve o modelo do rato cefoperazona de infecção por Clostridium difficile (CDI), utilizando uma estirpe clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Ênfase na monitorização clínica da doença, C. difficile enumeração bacteriana, a citotoxicidade de toxinas, e alterações histopatológicas em todo CDI em um modelo de rato estão detalhadas no protocolo.

tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

O presente estudo descreve um modelo de embrião de zebrafish para visualização in vivo e intravital análise de infecção biomaterial associada ao longo do tempo com base em microscopia de fluorescência. Este modelo é um sistema promissor complementando modelos animais mamíferos, tais como modelos de rato para o estudo in vivo de infecções associadas a biomaterial.

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Aprenda a desenvolver um modelo de infecção larval em zebrafish para Clostridioides difficile usando microinjeção e microgavagem. Este método permite estudar respostas imunes inatas a patógenos anaeróbios em tempo real.

Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile

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