Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente
9 de maio de 2020
Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.
Células-tronco cancerígenas estão implicadas em metástase recaída do câncer na resistência a medicamentos. Este protocolo fornece um método eficiente para investigar as funções dos genes-chave nas células-tronco do câncer. Usando um sistema de knockdown condicional e ensaio de formação de esfera adaptada, este método é facilmente adaptado para estudar funções in vitro e in vivo em genes associados à haste em diferentes tipos de células-tronco cancerosas.
Demonstrando o procedimento, estarão Yuting Li e Xiangyu Tan, assistentes de pesquisa do meu laboratório. Para gerar partículas de lentivírus, sementes quatro milhões de células de embalagem lentiviral 293T em uma placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, certificando-se de que as células são 50 a 80% confluentes no dia da transfecção.
Leve a temperatura média e ambiente reduzida e prepare os tubos A e B de acordo com as instruções do manuscrito. Adicione o conteúdo do tubo A ao tubo B.Misture bem e incuba o tubo por 15 minutos à temperatura ambiente para preparar complexos lipídicos-DNA. Remova cinco mililitros de meio do prato de cultura celular.
Em seguida, adicione cinco mililitros do complexo lipídio-DNA na cultura celular gota sábio e suavemente redemoinho o prato. Incubar o prato de cultura por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, remova cuidadosamente o meio de transfecção e substitua-o por 10 mililitros de DMEM pré-aquecidos complementados com 10% de FBS.
Incubar as células por mais 24 horas. Aproximadamente 48 horas após a transfecção, colhe 10 mililitros de lentivírus contendo supernacantes e filtra-os com um filtro de 0,45 micrômetros para remover detritos celulares. Todos os vasos de cultura celular, pontas, filtros e seringas podem conter lentivírus e devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte.
Transfira um supernatante esclarecido para um recipiente estéril. Adicione o concentrador Lenti-X e misture com a inversão suave. Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, centrifugar a amostra a 1500 vezes G por 45 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o supernasce, tomando cuidado para não perturbar a pelota na parte inferior. Suspenda suavemente a pelota em um mililitro de DMEM suplementado com 10% de FBS e armazene-a a menos 80 graus Celsius.
Semente 6 milhões de células-tronco de câncer gástrico ou GCSC's em uma placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS. Cultue as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, aspire o meio do prato e adicione as partículas lentivirais concentradas diluídas com quatro milímetros de meio DMEM completo, contendo reagente polibreno.
Devolva as células à incubadora por 18 horas. A polibrene deve ser testada em diferentes condições para determinar a concentração efetiva, que geralmente está na faixa de 2 a 10 miligramas por mililitro. Após 18 horas, substitua o meio por 10 mililitros de DMEM por 10% de FBS e devolva as células à incubadora por 24 horas.
Em seguida, aspire o supernaente com os detritos celulares e adicione DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 2,5 microgramas por mililitro de Puromicina. Incubar as células por mais 24 horas. Em seguida, mude o médio novamente para DMEM fresco complementado com 10% FBS e cinco microgramas por mililitro Puromicina.
Após outra incubação de 24 horas, enxágue os GCSCs aderentes duas vezes com cinco mililitros de DPBS sem cálcio e magnésio. Dissociar as células com um mililitro de solução de dissociação celular pré-aquecida e incuba-las por dois a três minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco mililitros de médio cultura completa GCSC pré-aquecida fresca à suspensão celular.
Distribua três mililitros desta suspensão em um tubo de centrífuga de 15 mililitros para criopreservação, e os outros três mililitros em outro tubo para indução com doxiciclina. Centrifugar ambos os tubos a 800 vezes G por cinco minutos. Em seguida, aspire o supernaente do tubo B e suspenda novamente as células em um mililitro de meio de cultura completa GCSC pré-aquecido fresco.
Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 100 milímetros com 10 mililitros de médio cultura completa GCSC pré-aquecido fresco e 2,5 microgramas por doxiciclina mililitro. Em seguida, incubar o prato por 48 horas. Use um contador celular automatizado para determinar a densidade de uma amostra de 10 microliter de células.
Em seguida, ajuste o volume com meio de cultura completa GCSC pré-aquecido para obter uma concentração de 20.000 células viáveis por mililitro. Dispense 100 microliters da suspensão celular em cada poço de uma nova placa de cultura de 96 bem-intencionados. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
A formação da esfera deve ocorrer dentro de três a dez dias. Imagem a formação da esfera tumoral a cada dois dias. Células-tronco de câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro.
Após seis dias, as células expandiram-se do fenótipo unicelular para grandes esferas. Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de RNA de grampo de cabelo curto contra clusterin foram clonadas no vetor Tet-GV307-RFP-Puro. As células transfeinadas com o vetor de expressão foram tratadas com doxiciclina por 48 horas.
Em seguida, a expressão de clusterin foi verificada pela mancha ocidental e quantificada por densitometria. A presença de doxiciclina e knockdown de clusterin em GCSCs inibiram a formação da esfera tumoral. Embora nenhuma inibição da formação da esfera tumoral tenha sido observada em células transduzidas com os controles de shRNA mexidos, indicando que a doxiciclina por si só não inibiu a formação da esfera tumoral.
Esses resultados sugerem que, após o silenciamento de clusterin, os GCSCs crescem lentamente e não conseguem formar esferas tumorais. Com base nesses dados, a clusterina desempenha um papel fundamental na promoção da atividade de autoconexão dos GCSCs, indicando que pode ser um alvo promissor para suprimir células-tronco cancerígenas em pacientes com câncer gástrico. As esferas tumorais devem ser estruturas redondas sólidas em células individuais ou agregadas, não devem ser consideradas esferas tumorais.
No entanto, algumas células-tronco cancerígenas podem não formar estruturas típicas da esfera tumoral. Este procedimento pode ser seguido com outros métodos para examinar células-tronco cancerígenas para potencial renovável in vitro. Por exemplo, a expressão de marcadores relacionados à haste pode ser estudada.
O protocolo pode ser estendido para estudar as funções dos genes críticos em células-tronco cancerosas, como a stemness sobre a sobrevivência.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um desenho experimental usando um sistema de silenciamento condicional e um ensaio de formação de esferas adaptado para estudar o efeito do clusterin na stemness de GCSCs derivadas de pacientes. Pode ser facilmente adaptado para estudos in vitro e in vivo de genes associados à stemness em vários tipos de células-tronco cancerígenas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Câncer
- Pesquisa em Células-Tronco
- Análise da Função Gênica
Fundamento
- As células-tronco cancerígenas (CSCs) contribuem para a recidiva e metástase do câncer.
- Compreender o papel de genes específicos nas CSCs é crucial para o desenvolvimento de terapias direcionadas.
- Este protocolo se concentra no gene clusterin e seu impacto na stemness.
- O método permite uma aplicação flexível em diferentes tipos de câncer.
Propósito do Estudo
- Investigar o papel do clusterin na stemness de GCSCs derivadas de pacientes.
- Fornecer um método confiável para estudar genes associados à stemness.
- Aprimorar a compreensão da biologia das CSCs e potenciais alvos terapêuticos.
Métodos Utilizados
- Sistema de silenciamento condicional para silenciamento gênico.
- Ensaio de formação de esferas adaptado para avaliar a stemness.
- Desenhos experimentais in vitro e in vivo.
- Uso de partículas lentivirais para entrega gênica.
Principais Resultados
- Demonstrou o procedimento para gerar partículas de lentivírus.
- Forneceu insights sobre os efeitos do clusterin em GCSCs.
- Mostrou a adaptabilidade do método para vários tipos de CSCs.
- Destacou a importância de estudar genes associados à stemness.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para estudar o papel do clusterin em células-tronco cancerígenas.
- Pode ser adaptado para diferentes tipos de células-tronco cancerígenas.
- Esta pesquisa pode levar a novas percepções sobre estratégias de tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
