Correção de alta precisão de mudanças cromáticas 3D na Era da Super-Resolução Imagem Biológica Usando Chromagnon
16 de junho de 2020
A correção de mudanças cromáticas em imagens de microscopia de fluorescência multicolorida (3D) é crucial para análises quantitativas de dados. Este protocolo é desenvolvido para medir e corrigir mudanças cromáticas em amostras biológicas através da aquisição de imagens de referência adequadas e processamento com o software de código aberto, Chromagnon.
As imagens de microscopia de coral de marsh contêm Shift Cromática em três dimensões. Isso prejudica a análise de colocalização de imagens de alta resolução. É geralmente difícil remover o Turno Cromático originado de uma amostra biológica em si, nosso método pode corrigir mudanças cromáticas em uma amostra biológica usando imagens de referência adquiridas separadamente.
Demonstrando o procedimento será Takako Koujin um técnico do meu grupo. Comece semeando 2,5 vezes 10 para as quintas células curandadas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e cultivando-as em uma incubadora de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação substitua o meio por dois mililitros de 3,7% de formaldeído em PBS e misture suavemente.
Conserte as vendas por 15 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma rotativa. Lave as células três vezes com dois mililitros de PBS por cinco a dez minutos. Permeabiliza-os com dois mililitros de ponto 1% tentem os próximos 100 em PBS enquanto giram e repetem as lavagens com PBS.
Em seguida, colori as células usando um protocolo padrão de coloração de anticorpos, conforme descrito no manuscrito do texto. Para obter uma imagem de referência de referência crosstalk para microscopia widefield, adicione dois mililitros de ponto cinco microgramas por mililitro Dappy para permanecer no DNA. Deixe as células na plataforma rotativa por 30 minutos.
Em seguida, substitua a solução por 100 microliters de meio de montagem para obter uma imagem de referência de referência de calibração biológica para qualquer tipo de microscopia, incluindo microscopia confocal e super resolução. Conserte as células como descrito anteriormente, e prepare a solução de estoque de um corante fluorescente conjugado em 1,5 mililitros de metanol. Adicione a faloideina na PBS a uma diluição de 1 a 100 para o piso Alexa 405 um a 1000 para alexa piso 488 e um a 200 para alexa piso 594.
Adicione um mililitro da solução às células e incuba-as por 30 minutos enquanto gira. Lave as células três a cinco vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, substitua o PBS por 100 microliters de meio de montagem.
Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia widefield coloque a amostra alvo no microscópio no software de imagem, abra a janela de teste de design e execute, defina a etapa Z apropriada e selecione os canais azul, verde e vermelho. Na guia Executar, adicione o nome do arquivo da imagem e comece a imagem. Para adquirir imagens de referência crosstalk para medir shifts cromáticos na amostra selecione a luz de excitação apenas para Dappy e certifique-se de usar exatamente a mesma posição de estágio e altura Z como para a amostra de destino.
Alternativamente, usar uma imagem de campo brilhante como um local de referência para a amostra de destino no microscópio de campo largo e adquirir uma imagem de fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos. Em seguida, adquira imagens de campo brilhante do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos na mesma posição do palco e usando a mesma altura Z. Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia de super resolução, como o 3D Sim coloque a amostra alvo no microscópio e adquira uma imagem sim fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos.
Então reconstrua a imagem super resolvida. Em seguida, coloque a mancha de amostra com phalloidina multicolorida em um microscópio sim 3D. E adquirir múltiplas imagens sim fluorescência como as imagens de referência de calibração biológica em posições de estágio de ponto, em seguida, reconstruir as imagens super resolvidas.
Use um navegador web para baixar a mais nova versão binária do Chromagnon. Extrair o programa e colocar o arquivo executável em um local conveniente. Arraste e solte os arquivos de referência do campo direito crosstalk ou referências de calibração biológica à caixa de referência ou clique em arquivos de referência para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos.
Se o programa pedir para instalar um Java Development Kit, pressione Sim e navegue até a página baixada. Em seguida, baixe e instale o JDK para o Sistema Operacional conforme instruído. Arraste e solte os arquivos de destino da coloração de anticorpos na caixa de destino.
Escolha um formato de imagem de saída e especifique o sufixo para o nome do arquivo de saída. Para imagens de referência crosstalk com alta relação sinal/ruído. Escolha a projeção na lista de escolha do alinhamento local e use um tamanho mínimo de janela de 60.
Para obter várias imagens de referência de calibração biológica, verifique a opção de referências médias e não escolha nenhuma para alinhar local, clique em executar todas as medidas para iniciar as medições. Para garantir que a medição tenha sido realizada corretamente, arraste e solte as imagens de referência na caixa de referência e na caixa de destino. Em seguida, execute o programa e verifique se as imagens estão perfeitamente sobrepostas.
A correção de turno cromático em microscopia de campo largo pode ser realizada usando uma imagem de referência de crosstalk. Esta imagem foi obtida com um microscópio widefield equipado com uma única câmera. A emissão de fluorescência de Dappy foi usada como referência para corrigir os canais azul, verde e vermelho.
Após o alinhamento com Chromagnon, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. Quando o parâmetro de alinhamento foi aplicado à imagem alvo por Chromagnon, o DNA e a ponte de anáfase, que é vista incorretamente fora do envelope nuclear antes do alinhamento aparece como esperado dentro do envelope. A correção de turno cromático de uma imagem sim 3D pode ser realizada usando uma imagem de referência de calibração biológica.
Três imagens sim 3D de células HeLa manchadas com faloides conjugadas a corantes azuis, verdes e vermelhos foram averígadas e o Deslocamento Cromático foi medido por Chromagnon. Após o alinhamento, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. O parâmetro de alinhamento foi aplicado a uma imagem de destino.
A visualização XZ mostra a posição incorreta do canal ao longo do Z e ligeiramente ao longo das direções X, que foi corrigida após o alinhamento. Para melhor desempenho é importante obter imagens de referência nas mesmas condições e no tempo como imagens de destino.
Visão Geral
Este estudo aborda o problema de desvios cromáticos em imagens de microscopia de fluorescência multicolorida. O protocolo desenvolvido permite a correção precisa desses desvios em amostras biológicas, garantindo análises quantitativas de dados mais confiáveis.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Microscopia
- Imagem de Fluorescência
- Análise de Dados
Contexto
- Desvios cromáticos podem interferir na análise de colocalização de imagens de microscopia de alta resolução.
- Esses desvios podem surgir dos próprios amostras biológicos, dificultando sua correção.
- O protocolo utiliza imagens de referência adquiridas para aumentar a precisão no processamento de imagens.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um protocolo utilizando o software Chromagnon
- Sistema biológico: células HeLa
- Técnicas: microscopia de fluorescência, protocolos de coloração, processamento de imagens
Resultados Principais
- Demonstrou correção bem-sucedida do deslocamento cromático utilizando imagens de referência.
- Conseguiu o alinhamento adequado das imagens após a correção.
- Validou a abordagem por meio de comparações entre imagens processadas e originais.
Conclusões
- O estudo demonstra efetivamente um método para corrigir desvios cromáticos em microscopia.
- Este trabalho tem implicações significativas para a melhoria da precisão na pesquisa de imagem biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem multicolor precisa é essencial para a análise quantitativa e a colocalização confiável na validação de alvos terapêuticos e na triagem fenotípica. Desvios cromáticos originados em amostras biológicas podem comprometer a integridade dos dados, levando a interpretações mecanicistas incorretas. O Chromagnon permite a correção do desvio cromático em 3D diretamente em sistemas biologicamente relevantes, aumentando a confiança preditiva nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao garantir o alinhamento espacial preciso de sinais multicoloridos em ensaios celulares.
- Valor Operacional: Reduz resultados falsos negativos e falsos positivos de colocalização que poderiam induzir a erros em estudos de interação com alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a desmistificação mecanicista ao minimizar artefatos técnicos na análise de vias e no mapeamento de interações proteicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas de imagem biológica validados para triagem de alto conteúdo, corrigindo o desalinhamento de canais que afeta a precisão dos resultados.
- Valor Operacional: Padroniza as saídas de imagem de fluorescência entre poços e placas, aumentando a reprodutibilidade do ensaio e a confiabilidade do fator Z.
- Escalabilidade: Permite o reuso de imagens de referência em diferentes lotes experimentais, possibilitando desempenho consistente em plataformas automatizadas de imagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a fidelidade da imagem do descobrimento à validação pré-clínica, corrigindo desvios cromáticos dependentes da profundidade em modelos tridimensionais.
- Alinhamento de Biomarcadores: Garante a precisão da colocalização para avaliação translacional de biomarcadores em tecidos fixados ou sistemas de organoides.
- Avanço Ajustado ao Risco: Reduz falsos positivos biológicos em estudos mecanicistas, apoiando decisões de prosseguir ou não com base em dados de imagem robustos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até estudos mecanicistas pré-clínicos, onde a imagem multicolorida precisa orienta a identificação de compostos promissores e a redução de riscos da via.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir análises precisas de colocalização de complexos proteicos e eventos de sinalização em células fixadas.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de canais de fluorescência corrigidos, assegurando leituras fenotípicas confiáveis induzidas por compostos.
- Análises: Fornece medidas espaciais quantitativas que permitem às equipes comparar condições de tratamento com alta precisão posicional.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao possibilitar imagens consistentes em sistemas biológicos tridimensionais, como esferoides ou seções de tecido.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma ferramenta de calibração reutilizável em diversos projetos, reduzindo esforços redundantes de validação em núcleos compartilhados de imagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da eliminação de artefatos cromáticos em dados de colocalização.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade de imagens multicoloridas entre usuários, locais e pontos temporais.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar ou interromper projetos mais precisas, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados decorrentes de suposições mecanicistas incorretas.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base em hipóteses mecanicistas sólidas e validadas por imagem.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e software de processamento de imagens.
- Exige acesso a microscópios de campo amplo ou de super-resolução capazes de aquisição multicanal.
- Exige protocolos padronizados de aquisição de imagens de referência para garantir a precisão da correção.
- Requer adaptação da coloração de referência (por exemplo, DAPI, faloidina) entre diferentes linhagens celulares ou tipos de tecidos.
- O desempenho depende da correspondência entre as condições das amostras de referência e alvo, incluindo fixação, permeabilização e profundidade de imagem.
