Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

A detecção de interações de superfície celular usando abordagens bioquímicas disponíveis atualmente ainda representa desafios técnicos. Este protocolo fornece uma alternativa genética usando a abordagem de triagem celular em escala de genoma para identificar as interações de ligantes receptores na superfície celular. Ao contrário da maioria dos outros métodos existentes, este método não faz suposições sobre a biologia dos receptores.

Ele oferece oportunidades para identificar as interações mediadas por uma ampla gama de moléculas de superfície celular. Moléculas de superfície celular são diretamente acessíveis a drogas como anticorpos monoclonais. Portanto, a identificação de interações mediadas por essas moléculas pode ter implicações terapêuticas importantes.

Este método é geralmente aplicável aos pesquisadores interessados em explorar os processos de sinalização e reconhecimento celular está em uma ampla gama de contextos biológicos, incluindo interações neurais e imunológicas, bem como interações de patógenos hospedeiros. O protocolo requer uma máquina de classificação de células de alto rendimento e máquinas de sequenciamento de próxima geração. Certifique-se de que essas instalações estão disponíveis antes de iniciar o protocolo.

Comece fazendo oito diluições seriais das amostras de proteína biotinilada em uma placa de 96 poços garantindo que o volume final de cada diluição seja de pelo menos 200 microliters e que um controle somente de tags esteja incluído. Faça uma placa duplicada das amostras removendo 100 microliters de cada poço e transferindo-a para uma nova placa de 96 poços. Inclua um controle de proteína somente para etiquetas que será usado como uma sonda de controle em todos os ensaios de vinculação.

Adicione 100 microliters de 0,1 micrograma por mililitro streptavidin-PE aos poços em uma das placas, e 100 microliters de tampão de diluição aos poços da outra placa. Incubar a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, bloqueie os poços da placa codificada streptavidin com o tampão de diluição por 15 minutos.

Depois de lavar a placa, certifique-se de que está seca. Em seguida, transfira o volume total da amostra de ambas as placas para poços individuais da placa codificada streptavidin e incuba-a por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, lave a placa três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem.

Adicione 100 microliters de camundongos anti-rato Cd4d3+4 IgG e incubar a placa por mais uma hora. Repita as lavagens. Adicione 100 microlitadores de um conjugado de fosfates alcalino anti-rato e deixe a placa em temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, lave os poços três vezes com tampão de lavagem e uma vez com tampão de diluição. Prepare o fosfato p-nitrofenil a um miligrama por mililitro no tampão de etanol de corante e adicione 100 microliters a cada poço. Após uma incubação de 15 minutos, meça que a absorvância tenha cada poço em 405 nanômetros.

Use a diluição mínima na qual não há sinal na placa como fator de diluição adequado para criar tetramers. Incubar streptavidin-PE e a diluição proteica biotinilada apropriada por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, armazene proteínas conjugadas em um tubo protegido por luz a quatro graus Celsius até que use mais.

Gire os tubos cônicos com as amostras tratadas e de controle a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o supernasal e congele um dos tubos a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Suspenda a pelota no outro tubo em 10 mililitros de PBS com 1%BSA e reserve 100 microliters de células como um controle negativo em uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione a proteína recombinante pré-conjugada à suspensão celular no tubo cônico e na placa de 96 poços. Realize a coloração celular por pelo menos uma hora a quatro graus Celsius em um rotor de bancada com rotação suave. Em seguida, pelota as células a 200 vezes G por cinco minutos e remova o supernante.

Depois de lavar as células duas vezes, suspenda-as em cinco mililitros de PBS. Coe as células através de um coador de 30 micrômetros para remover aglomerados celulares. Então analise-os com um sodor fluxo.

Use a amostra de controle negativo para portar células negativas BFP e PE. Em seguida, classifique a amostra e colete 500.000 a 1 milhão de células bfp positivas e pe negativas em um tubo de centrifugação de 1,5 mililitro. A gaiola dolorida dependerá da ligação das células à proteína, mas normalmente de uma a 5% das amostras negativas de PE são coletadas.

Agora deixe as células classificadas centrifugando por 500 vezes G por cinco minutos, em seguida, remova cuidadosamente o supernasce. A pelota pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por até seis meses. Use a função de contagem de magia para mapear sequências da população não classificada e classificada para a biblioteca de referência, o que produzirá um arquivo de contagem bruta.

Execute a função de teste da magia usando contagens brutas da amostra de controle não classificada como controle e as contagens da amostra classificada como tratamento. Abra o arquivo de resumo genético gerado e classifique a coluna de classificação de pausa em ordem ascendente. Em seguida, identifique os hits com uma taxa de descoberta falsa inferior ao ponto 0,05.

O receptor é geralmente classificado com muita frequência na primeira posição. Finalmente use R ou um software equivalente para traçar a pontuação robusta do algoritmo de classificação para seleção positiva. As telas de knockdown em escala de genoma para a identificação do parceiro de ligação das células TNFSF9 e P falciparum ou H5 humanas de TNFSF9 e P falciparum Rh5 foram realizadas nas células NCI-SNU-1 e HEC-293, respectivamente.

O comportamento de ligação de Rh5 foi afetado tanto pelo sulfato heparan quanto pelo receptor conhecido BSG, enquanto o TN-FRSF-9 não perdeu a vinculação ao seu receptor conhecido TN-FSF-9. Após a pré-incubação com heparina solúvel. A distribuição da GNA na biblioteca mutante de controle revelou que a complexidade da biblioteca foi mantida ao longo do experimento.

A qualidade técnica das telas foi avaliada examinando a distribuição das alterações observadas do G-RNA visando um conjunto de referência de genes não essenciais, em comparação com a distribuição para um conjunto de referência de genes essenciais. Além disso, o enriquecimento do nível da via revelou que as vias essenciais esperadas foram identificadas e significativamente enriquecidas na população de abandono. Ao comparar a amostra de controle com a biblioteca plasmida original.

O algoritmo de classificação robusto ou pontuação RRA fornece uma medida da qual os G-RNA são consistentemente classificados acima do esperado. Na tela para TNFRSF9, o topo foi O TNFSF9, que é um parceiro de ligação conhecido. Além disso, também foram identificados vários genes relacionados à via TP53.

No caso do RH5, além do receptor conhecido, e do gene necessário para a produção de mordaças sulfaduradas, o gene SLC16A1 também foi identificado. A abordagem de triagem é geralmente muito robusta e o receptor interagindo diretamente deve ser altamente classificado na lista de genes enriquecidos nesta ordem de população. É crucial validar os hits obtidos na tela.

Se a interação for mediada por proteínas, abordagens bioquímicas projetadas para estudar interações binárias de proteínas proteicas, por exemplo, poderiam ser usadas para estudos de validação posteriores. Devido à natureza imparcial da escala do genoma dessa abordagem, prevemos que ela ajudará a explorar as interações mediadas por moléculas celulares difíceis de estudar, como lipídios, proteínas de membrana multipass e glicanos. Também pode revelar novos caminhos necessários para o tráfico de receptores e biologia.