Name: Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a identificar interações receptor-ligante na superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma. Este método permite descobertas imparciais com importantes implicações terapêuticas para pesquisa.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa wellcome trust número 206194 concedida à GJW. Agradecemos à instalação do Núcleo de Citometria: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson e Christopher Hall por ajuda com a FACS.

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Os autores não têm nada a revelar.

Uma estratégia de triagem baseada em CRISPR para identificar genes codificando componentes celulares envolvidos no reconhecimento celular é descrita. Uma abordagem semelhante usando a ativação do CRISPR também fornece uma alternativa genética para identificar receptores diretamente interagindo de proteínas recombinantes sem a necessidade de gerar grandes bibliotecas proteicas26. No entanto, uma grande vantagem dessa abordagem é que ela é aplicável às interações mediadas por moléculas superficiais nativamente exibidas na célula e não depende da superexpressão dos receptores, o que pode influenciar a avidez vinculante do receptor. Ao contrário de outros métodos, portanto, essa técnica não faz suposições sobre a natureza bioquímica ou biologia celular dos receptores e oferece uma oportunidade de estudar interações mediadas por proteínas que normalmente são difíceis de estudar usando abordagens bioquímicas, como proteínas muito grandes, ou aquelas que atravessam a membrana várias vezes ou formam complexos com outras proteínas, e moléculas diferentes de proteínas como glicanos, glicólipídios e fosfolipídios. Dada a natureza em escala genoma do método, essa abordagem também tem a vantagem de não apenas identificar o receptor, mas também componentes celulares adicionais que são necessários para o evento de ligação, fornecendo assim insights sobre a biologia celular do receptor.
Uma das principais limitações deste método ao usá-lo para identificar o receptor de uma proteína órfã é o requisito inicial para identificar primeiro uma linha celular que se liga à proteína. Isso nem sempre é fácil e identificar uma linha celular que exibe um fenótipo de ligação que também é permissivo às telas genéticas pode ser o passo que limita o tempo para a implantação deste ensaio. Algumas linhas celulares tendem a se ligar a mais proteínas do que outras. Isso é especialmente relevante para proteínas que ligam HS, porque essas proteínas tendem a se ligar a qualquer linha celular que exiba cadeias laterais de HS, independentemente do contexto de ligação nativa. Além disso, observamos que a regulação dos sindecanos (ou seja, proteoglycans que contêm HS) nas linhas celulares leva ao aumento da vinculação das proteínas de ligação de SH26. Isso pode ser um fator a ser levado em consideração ao selecionar a linha celular para triagem. No entanto, também é importante notar que a ligação aditiva do HS não interfere na vinculação a um receptor específico. Isso significa que, se a vinculação for observada, é possível que seja mediada unicamente pelo SS porque a vinculação mediada pelo HS neste ensaio é aditiva e não codependente19. Nesse cenário, a abordagem de bloqueio de heparina descrita pode identificar tais comportamentos sem ter a necessidade de realizar uma tela genética completa.
Um recurso útil para a escolha de linhas celulares é o Cell Model Passport, que contém informações genômicas, transcriômicas e condições de cultura para ~1.000 linhas de células cancerígenas27. Dependendo do contexto biológico, as células podem ser escolhidas com base em seus perfis de expressão. Para auxiliar na seleção de linhas celulares, agrupamos ~1.000 linhas celulares no Cell Model Passport de acordo com a expressão de ~1.500 glicoproteínas de superfície de células humanas pré-anotadas28 (Figura Suplementar 2; informações de cluster para cada linha celular juntamente com condições de crescimento são fornecidas na Tabela Suplementar 2). Ao testar a ligação de uma proteína com função desconhecida, é útil selecionar um painel de linhas celulares representativas de cada cluster para aumentar a chance de cobrir uma ampla gama de receptores. Dada a escolha, recomenda-se escolher linhas celulares fáceis de cultivar e fáceis de transduzir. Como essas linhas celulares serão usadas na triagem em escala de genoma, é preferível que elas possam ser cultivadas facilmente em grandes quantidades e sejam permissivas à transdução lentiviral, pois é o método mais comumente disponível para a entrega de sgRNA para triagem genética baseada em CRISPR nas etapas posteriores.
Geralmente, as seleções de fenótipo são realizadas em um único tipo. No entanto, isso é determinado pelo brilho da população celular manchada em comparação com o controle. Rodadas iterativas de seleções poderiam ser adotadas para cenários em que a relação sinal-ruído do fenótipo desejado é baixa, ou quando o objetivo da tela é identificar mutantes que têm fenótipos fortes. Ao usar uma abordagem de seleção iterativa para telas baseadas em FACS, é importante considerar que o processo de classificação pode causar morte celular, principalmente devido à força do classificador. Assim, nem todas as células coletadas serão representadas na próxima rodada de triagem.
A complexidade da biblioteca é um fator muito importante na realização de telas genéticas bem sucedidas, especialmente para telas de seleção negativas, pois a extensão do esgotamento nelas só pode ser determinada comparando resultados com o que estava presente na biblioteca inicial. Para telas de seleção negativas, é comum manter bibliotecas de 500-1.000 x de complexidade. Telas de seleção positivas, no entanto, são mais robustas para tamanhos de biblioteca, porque nessas telas apenas um pequeno número de mutantes são esperados para ser selecionado para um fenótipo específico. Portanto, na tela de seleção positiva descrita aqui, o tamanho da biblioteca pode ser reduzido para 50-100x de complexidade sem comprometer a qualidade da tela. Além disso, nessas telas também é possível usar uma biblioteca de controle para uma determinada linha celular em um determinado dia como um "controle geral" para todas as amostras classificadas no dia para aquela linha celular dada. Isso reduzirá o número de bibliotecas de controle que precisam ser produzidas e sequenciadas.
Outra consideração importante para o uso dessa abordagem são as limitações das telas de perda de função na identificação de genes essenciais para o crescimento celular in vitro. O tempo das telas é crucial nesse sentido, pois quanto mais tempo as células mutantes são mantidas na cultura, maior a probabilidade de que células com mutações em genes essenciais se tornem inviáveis e não sejam mais representadas na biblioteca mutante. As recentes telas genéticas realizadas como parte da iniciativa Project Score em mais de 300 linhas celulares mostram que múltiplos genes na secreção de proteínas anotadas pelo KEGG e na via de glicossylação N-glicossylation são frequentemente identificados como essenciais para uma série de linhas celulares (Figura Suplementar 3)29. Isso pode ser levado em consideração ao projetar telas se o efeito dos genes necessários para a proliferação e viabilidade deve ser investigado no contexto do processo de reconhecimento celular. Neste caso, a realização de telas em um ponto de tempo antecipado (por exemplo, dia 9 pós-tradução) seria geralmente apropriada. No entanto, se a abordagem for usada para identificar alguns alvos com efeitos de tamanho forte em vez de vias celulares gerais, pode ser apropriado executar telas em um ponto de tempo posterior (por exemplo, dia 15-16 pós-tradução).
Os resultados da triagem são muito robustos; em oito telas de ligação de proteína recombinantes realizadas no passado, o receptor de superfície celular foi o principal atingido em cada caso19. Ao utilizar essa abordagem para identificar o parceiro de interação, deve-se, portanto, esperar que o receptor e os fatores que contribuem para sua apresentação na superfície sejam identificados com alta confiança estatística. Uma vez que a tela é realizada e um hit é validado usando um único nocaute de gRNA, outros acompanhamentos podem ser realizados usando métodos bioquímicos existentes, como AVEXIS4 e ligação satural direta de proteínas purificadas usando ressonância de plasmon superficial. A abordagem aqui descrita é aplicável para todas as proteínas para as quais é possível gerar uma sonda de ligação recombinante solúvel.
Em resumo, esta é uma abordagem de nocaute CRISPR em escala de genoma para identificar interações mediadas por proteínas da superfície celular. Este método é geralmente aplicável para identificar vias celulares necessárias para o reconhecimento da superfície celular em uma ampla gama de diferentes contextos biológicos, incluindo entre as células próprias de um organismo (por exemplo, reconhecimento neural e imunológico), bem como entre células hospedeiras e proteínas patógenas. Este método fornece uma alternativa genética às abordagens bioquímicas projetadas para identificação de receptores, e por não exigir quaisquer suposições prévias sobre a natureza bioquímica ou biologia celular dos receptores, tem grande potencial para fazer descobertas completamente inesperadas.

Interações extracelulares por proteínas receptoras de superfície celular direcionam processos biológicos importantes, como organização tecidual, reconhecimento de patógenos hospedeiros e regulação imunológica. Investigar essas interações é de interesse para a comunidade biomédica mais ampla, pois os receptores de membrana são alvos acionáveis de terapêuticas sistematicamente entregues, como anticorpos monoclonais. Apesar de sua importância, estudar essas interações continua sendo tecnicamente desafiador. Isso ocorre principalmente porque os receptores embutidos em membrana são anfípaticos, tornando-os difíceis de isolar das membranas biológicas para manipulação bioquímica, e suas interações são tipificadas pelas fracas afinidades de interação (KDs na faixa μM-mM)1. Consequentemente, muitos métodos comumente utilizados são inadequados para detectar essa classe de interações proteicas1,,2.
Uma série de métodos foi desenvolvida para investigar especificamente interações receptor-ligantes extracelulares que levam em consideração suas propriedades bioquímicas únicas3. Algumas dessas abordagens envolvem expressar todo o ectodomínio de um receptor como uma proteína recombinante solúvel em sistemas baseados em mamíferos ou células de insetos para garantir que essas proteínas contenham modificações pós-transicionais que são estruturalmente importantes, como glicanos e ligações de dissulfeto. Para superar a ligação de baixa afinidade, os ectodomínios são muitas vezes oligomerizados para aumentar sua avidalidade vinculante. Os ectodomínios de proteína ávida têm sido usados com sucesso como sondas de ligação para identificar parceiros de interação em telas diretas de interação proteína-proteína recombinante4,,5,,6,7. Embora métodos amplamente bem sucedidos e recombinantes à base de proteínas requerem que a ectodomina de um receptor de membrana seja produzida como uma proteína solúvel. Portanto, ele só é geralmente aplicável a proteínas que contêm uma região extracelular contígua (por exemplo, tipo de passe único I, tipo II ou ancorado em GPI) e não é geralmente adequado para complexos receptores e proteínas de membrana que abrangem a membrana várias vezes.
Técnicas de clonagem de expressão nas quais uma biblioteca de DNAs complementares (cDNAs) é transfeita em células e testada para um fenótipo de ganho de vinculação também foram usadas para identificar interações proteicas extracelulares8. A disponibilidade de grandes coleções de plasmídeos clonados e sequenciados de expressão cDNA nos últimos anos facilitou métodos nos quais linhas celulares que superexpressam cDNAs codificando receptores de superfície celular são rastreados para a ligação de proteínas recombinantes para identificar interações9,,10. As abordagens baseadas em cDNA, ao contrário dos métodos recombinantes à base de proteínas, oferecem a possibilidade de identificar interações no contexto da membrana plasmática. No entanto, o sucesso do uso de construções de expressão cDNA depende da capacidade das células de superexpressar a proteína na forma corretamente dobrada, mas isso muitas vezes requer fatores acessórios celulares, como transportadores, acompanhantes e montagem oligomerica correta. Transfetar um único cDNA pode, portanto, não ser suficiente para alcançar a expressão da superfície celular.
As técnicas de triagem que utilizam construções cDNA ou sondas de proteína recombinante são intensivas em recursos e requerem grandes coleções de bibliotecas de proteínas cDNA ou recombinante. Métodos específicos projetados baseados em espectrometria de massa foram utilizados recentemente para identificar interações extracelulares que não requerem a montagem de grandes bibliotecas. No entanto, essas técnicas requerem manipulação química da superfície celular, que pode alterar a natureza bioquímica das moléculas presentes na superfície das células e atualmente são aplicáveis apenas para interações mediadas pelas proteínas glicosiladas11,12. A maioria dos métodos disponíveis atualmente também se concentra fortemente nas interações entre proteínas, ignorando em grande parte a contribuição do microambiente da membrana, incluindo moléculas como glicanos, lipídios e colesterol.
O desenvolvimento recente de segmentação biallelelica altamente eficiente usando abordagens baseadas em CRISPR permitiu bibliotecas em escala de genoma de células sem genes definidos em uma única piscina que podem ser rastreadas de forma sistemática e imparcial para identificar componentes celulares envolvidos em diferentes contextos, incluindo dissecação de processos de sinalização celular, identificação de perturbações que conferem resistência a drogas, toxinas e patógenos, e determinação da especificidade dos anticorpos13,,14,,15,16. Aqui, descrevemos um ensaio de triagem de células eliminatórias baseadas em CRISPR em escala genoma que fornece uma alternativa às abordagens bioquímicas atuais para identificar interações receptor-ligantes extracelulares. Essa abordagem de identificar interações mediadas por receptores de membrana por telas genéticas é particularmente adequada para pesquisadores que têm um interesse focado em ligantes individuais, pois evita a necessidade de compilar grandes bibliotecas de CDNAs ou proteínas recombinantes.
Este ensaio consiste em três passos principais: 1) Sondas de ligação de proteína recombinantes altamente ávidas que consistem nas regiões extracelulares de um receptor de interesse são produzidas e usadas em ensaios de ligação baseados em citometria de fluxo baseados em fluorescência; 2) Os ensaios de ligação são utilizados para identificar uma linha celular que expresse o parceiro de interação da sonda de proteína recombinante; 3) Uma versão expressadora cas9 da linha celular que interage com a proteína de interesse é produzida e uma tela de nocaute baseada em GENOMA CRISPR/Cas9 é realizada(Figura 1). Nesta tela genética, a ligação de uma proteína recombinante às linhas celulares é usada como um fenótipo mensurável no qual as células dentro da biblioteca de nocautes que perderam a capacidade de ligar a sonda são classificadas usando a classificação celular ativada baseada em fluorescência (FACS) e os genes que causaram a perda do fenótipo de ligação identificado pelo sequenciamento. Em princípio, os genes que codificam o receptor responsável pela ligação da ávida sonda e os necessários para sua exibição de superfície celular são identificados.
O primeiro passo deste protocolo envolve a produção de ávidas sondas proteicas recombinantes representando a ectodomina dos receptores ligados à membrana. Esses receptores são conhecidos por frequentemente manter suas funções de ligação extracelular quando seus ectodomínios são expressos como uma proteína solúvel recombinante1. Para uma proteína de interesse, proteínas recombinantes solúveis podem ser produzidas em qualquer sistema adequado de expressão de proteína eucariótica em qualquer formato, desde que possa ser oligomerizada para maior avideidade de ligação, e contém tags que podem ser usadas em ensaios de ligação baseados em fluorescência baseadas em citometria de fluxo (por exemplo, bandeira-tag, biotin-tag). Protocolos detalhados para a produção de ectodomínios solúveis de receptores de membrana utilizando o sistema de expressão proteica HEK293, bem como diferentes técnicas de multimerização e construtos de expressão proteica para a produção de proteínas pentaméricas e proteínas monoméricas foram previamente descritos1,,17. O protocolo aqui descreverá os passos para a geração de sondas ávidas fluorescentes a partir de proteínas biotinilatas monoméricas, conjugando-as a streptavidin conjugadas a um fluorocromo (por exemplo, ficoerthrina ou PE), que pode ser usado diretamente em ensaios de ligação baseados em células e tem a vantagem de não exigir um anticorpo secundário para detecção. Protocolos gerais para a realização de telas em escala de genoma já foram descritos20,,21, portanto, o protocolo se concentra principalmente nas especificidades da realização de telas de ligação de proteína recombinante baseadas em citometria de fluxo usando o sistema de triagem de nocaute CRISPR/Cas9 usando a biblioteca Humana V1 ("Yusa")18.

<table><tbody><tr><td>Sangue da Blasticidina</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr> da <tr><td>fosfatase alcalina do Anti-rato</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>& Kit Maxi de DNA de Cultura de Células</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit de Sangue e Tecido</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Ímã Lateral</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T embalagem células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX com reagente PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP classificador de células</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA contas de agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 anticorpo</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 colunas de dessalinização</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno com 5 mL de volume de leito</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, PCR Grau</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina Gibco</td><td></td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start Alta Fidelidade 2&vezes; Kit de purificação Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células Sony</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grânulos Sony SPRI (grânulos Agencourt AMPure XP)</td> <td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Placas de microtítulo revestidas com estreptavidina</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas crispr/cas9 em escala de genoma

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

A comunicação intercelular mediada por interações diretas entre receptores de superfície celular incorporados por membrana é crucial para o desenvolvimento normal e o funcionamento de organismos multicelulares. A detecção dessas interações permanece tecnicamente desafiadora, no entanto. Este manuscrito descreve uma abordagem sistemática de triagem genética de destruição em escala de genoma CRISPR/Cas9 que revela vias celulares necessárias para eventos específicos de reconhecimento da superfície celular. Este ensaio utiliza proteínas recombinantes produzidas em um sistema de expressão de proteínas mamíferas como sondas ávidas de ligação para identificar parceiros de interação em uma tela genética baseada em células. Este método pode ser usado para identificar os genes necessários para interações de superfície celular detectadas por sondas de ligação recombinantes correspondentes aos ectodomínios de receptores incorporados por membrana. É importante ressaltar que, dada a natureza em escala de genoma dessa abordagem, ele também tem a vantagem de não apenas identificar o receptor direto, mas também os componentes celulares necessários para a apresentação do receptor na superfície celular, fornecendo assim insights valiosos sobre a biologia do receptor.

Este manuscrito descreve uma abordagem de triagem baseada em células em escala de genoma para identificar interações receptor-ligantes extracelulares.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

A detecção de interações de superfície celular usando abordagens bioquímicas disponíveis atualmente ainda representa desafios técnicos. Este protocolo fornece uma alternativa genética usando a abordagem de triagem celular em escala de genoma para identificar as interações de ligantes receptores na superfície celular. Ao contrário da maioria dos outros métodos existentes, este método não faz suposições sobre a biologia dos receptores.Ele oferece oportunidades para identificar as interações mediadas por uma ampla gama de moléculas de superfície celular. Moléculas de superfície celular são diretamente acessíveis a drogas como anticorpos monoclonais. Portanto, a identificação de interações mediadas por essas moléculas pode ter implicações terapêuticas importantes.Este método é geralmente aplicável aos pesquisadores interessados em explorar os processos de sinalização e reconhecimento celular está em uma ampla gama de contextos biológicos, incluindo interações neurais e imunológicas, bem como interações de patógenos hospedeiros. O protocolo requer uma máquina de classificação de células de alto rendimento e máquinas de sequenciamento de próxima geração. Certifique-se de que essas instalações estão disponíveis antes de iniciar o protocolo.Comece fazendo oito diluições seriais das amostras de proteína biotinilada em uma placa de 96 poços garantindo que o volume final de cada diluição seja de pelo menos 200 microliters e que um controle somente de tags esteja incluído. Faça uma placa duplicada das amostras removendo 100 microliters de cada poço e transferindo-a para uma nova placa de 96 poços. Inclua um controle de proteína somente para etiquetas que será usado como uma sonda de controle em todos os ensaios de vinculação.Adicione 100 microliters de 0,1 micrograma por mililitro streptavidin-PE aos poços em uma das placas, e 100 microliters de tampão de diluição aos poços da outra placa. Incubar a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, bloqueie os poços da placa codificada streptavidin com o tampão de diluição por 15 minutos.Depois de lavar a placa, certifique-se de que está seca. Em seguida, transfira o volume total da amostra de ambas as placas para poços individuais da placa codificada streptavidin e incuba-a por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, lave a placa três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem.Adicione 100 microliters de camundongos anti-rato Cd4d3+4 IgG e incubar a placa por mais uma hora. Repita as lavagens. Adicione 100 microlitadores de um conjugado de fosfates alcalino anti-rato e deixe a placa em temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, lave os poços três vezes com tampão de lavagem e uma vez com tampão de diluição. Prepare o fosfato p-nitrofenil a um miligrama por mililitro no tampão de etanol de corante e adicione 100 microliters a cada poço. Após uma incubação de 15 minutos, meça que a absorvância tenha cada poço em 405 nanômetros.Use a diluição mínima na qual não há sinal na placa como fator de diluição adequado para criar tetramers. Incubar streptavidin-PE e a diluição proteica biotinilada apropriada por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, armazene proteínas conjugadas em um tubo protegido por luz a quatro graus Celsius até que use mais.Gire os tubos cônicos com as amostras tratadas e de controle a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o supernasal e congele um dos tubos a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Suspenda a pelota no outro tubo em 10 mililitros de PBS com 1%BSA e reserve 100 microliters de células como um controle negativo em uma placa de 96 poços.Em seguida, adicione a proteína recombinante pré-conjugada à suspensão celular no tubo cônico e na placa de 96 poços. Realize a coloração celular por pelo menos uma hora a quatro graus Celsius em um rotor de bancada com rotação suave. Em seguida, pelota as células a 200 vezes G por cinco minutos e remova o supernante.Depois de lavar as células duas vezes, suspenda-as em cinco mililitros de PBS. Coe as células através de um coador de 30 micrômetros para remover aglomerados celulares. Então analise-os com um sodor fluxo.Use a amostra de controle negativo para portar células negativas BFP e PE. Em seguida, classifique a amostra e colete 500.000 a 1 milhão de células bfp positivas e pe negativas em um tubo de centrifugação de 1,5 mililitro. A gaiola dolorida dependerá da ligação das células à proteína, mas normalmente de uma a 5% das amostras negativas de PE são coletadas.Agora deixe as células classificadas centrifugando por 500 vezes G por cinco minutos, em seguida, remova cuidadosamente o supernasce. A pelota pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por até seis meses. Use a função de contagem de magia para mapear sequências da população não classificada e classificada para a biblioteca de referência, o que produzirá um arquivo de contagem bruta.Execute a função de teste da magia usando contagens brutas da amostra de controle não classificada como controle e as contagens da amostra classificada como tratamento. Abra o arquivo de resumo genético gerado e classifique a coluna de classificação de pausa em ordem ascendente. Em seguida, identifique os hits com uma taxa de descoberta falsa inferior ao ponto 0,05.O receptor é geralmente classificado com muita frequência na primeira posição. Finalmente use R ou um software equivalente para traçar a pontuação robusta do algoritmo de classificação para seleção positiva. As telas de knockdown em escala de genoma para a identificação do parceiro de ligação das células TNFSF9 e P falciparum ou H5 humanas de TNFSF9 e P falciparum Rh5 foram realizadas nas células NCI-SNU-1 e HEC-293, respectivamente.O comportamento de ligação de Rh5 foi afetado tanto pelo sulfato heparan quanto pelo receptor conhecido BSG, enquanto o TN-FRSF-9 não perdeu a vinculação ao seu receptor conhecido TN-FSF-9. Após a pré-incubação com heparina solúvel. A distribuição da GNA na biblioteca mutante de controle revelou que a complexidade da biblioteca foi mantida ao longo do experimento.A qualidade técnica das telas foi avaliada examinando a distribuição das alterações observadas do G-RNA visando um conjunto de referência de genes não essenciais, em comparação com a distribuição para um conjunto de referência de genes essenciais. Além disso, o enriquecimento do nível da via revelou que as vias essenciais esperadas foram identificadas e significativamente enriquecidas na população de abandono. Ao comparar a amostra de controle com a biblioteca plasmida original.O algoritmo de classificação robusto ou pontuação RRA fornece uma medida da qual os G-RNA são consistentemente classificados acima do esperado. Na tela para TNFRSF9, o topo foi O TNFSF9, que é um parceiro de ligação conhecido. Além disso, também foram identificados vários genes relacionados à via TP53.No caso do RH5, além do receptor conhecido, e do gene necessário para a produção de mordaças sulfaduradas, o gene SLC16A1 também foi identificado. A abordagem de triagem é geralmente muito robusta e o receptor interagindo diretamente deve ser altamente classificado na lista de genes enriquecidos nesta ordem de população. É crucial validar os hits obtidos na tela.Se a interação for mediada por proteínas, abordagens bioquímicas projetadas para estudar interações binárias de proteínas proteicas, por exemplo, poderiam ser usadas para estudos de validação posteriores. Devido à natureza imparcial da escala do genoma dessa abordagem, prevemos que ela ajudará a explorar as interações mediadas por moléculas celulares difíceis de estudar, como lipídios, proteínas de membrana multipass e glicanos. Também pode revelar novos caminhos necessários para o tráfico de receptores e biologia.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Este protocolo descreve as etapas necessárias para projetar e executar a segmentação multiplexada de realçadores com a proteína de fusão desativação CASCUDO-SID4X-dCas9, também conhecido como interferência de realçador (Enhancer-i). Este protocolo permite a identificação de potenciadores que regulam a expressão gênica e facilita a dissecação das relações entre potenciadores de regulação de um gene alvo comum.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar CRISPR-Cas9 para alcançar uma maior especificidade sem perda de atividade no alvo. Usamos uma abordagem de evolução dirigida chamada Sniper-tela para encontrar um mutante Cas9 com as características desejadas. Franco-atirador-Cas9 é compatível com truncado RNAs single-guia e entrega em um formato ribonucleoprotein, conhecidas estratégias para atingir maiores especificidades.

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

O artigo descreve um protocolo para a aplicação de um modelo in vitro de exaustão para completar uma triagem de nocaute CRISPR em todo o genoma em células T receptoras de antígeno quimérico de doadores saudáveis.

Realizando uma triagem nocaute CRISPR em todo o genoma in vitro em células T receptoras de antígeno quimérico

Aqui, apresentamos um protocolo que integra a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que são cruciais para a capacidade proliferativa anormal de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras.

Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

Uma abordagem meticulosa e estruturada é dada para selecionar genes resistentes e sensíveis de radiação por meio da aplicação de um método de triagem CRISPR / Cas9 em todo o genoma. Este protocolo também tem o potencial de servir como uma estrutura versátil para outros empreendimentos de pesquisa que investigam os mecanismos de resistência a drogas químicas administradas clinicamente.

Tela CRISPR em todo o genoma para revelar genes radiossensíveis e radiorresistentes

Desenvolvemos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primárias. Ao reduzir a transferência de gDNA por meio da digestão enzimática e da redução do de sgRNA, essa abordagem minimiza artefatos de PCR, garantindo a detecção precisa de sgRNA e a identificação robusta de alvos genéticos funcionais.

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

Aprenda a identificar interações receptor-ligante na superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma. Este método permite descobertas imparciais com importantes implicações terapêuticas para pesquisa.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

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