Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas
10 de março de 2020
O ensaio de inundação de mudas facilita a rápida triagem das adesões de tomate selvagem para a resistência à bactéria Pseudomonas seringae. Este ensaio, usado em conjunto com o ensaio de crescimento bacteriano de mudas, pode auxiliar na caracterização da resistência subjacente à bactéria, e pode ser usado para mapear populações para determinar a base genética da resistência.
Este protocolo de alto rendimento permite a triagem rápida de mudas de tomate desde adesões selvagens ao patógeno bacteriano Pseudomonas seringae. O ensaio de inundação de mudas minimiza o tempo de crescimento das plantas e as necessidades da câmara de crescimento, permite uma rápida rotatividade das plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados. Este ensaio é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para testar resistência em adesões selvagens e outras linhas com formações genéticas complexas.
O protocolo fornece instruções específicas para a innoculação de inundação de duas cepas de seringa Pseudomonas. No entanto, é versátil e pode ser modificado para detectar resistência do hospedeiro a outros patógenos bacterianos. Demonstrando o procedimento será Yana Hasan, especialista em pesquisa no meu laboratório.
Comece cultivando as mudas de tomate. Coloque as sementes de tomate em um tubo de microcentrífuga de 2,2 mililitros e adicione dois mililitros de solução de alvejante de 50%. Balance o tubo por 25 minutos e remova a solução de alvejante com uma pipeta.
Adicione dois mililitros de água ultra pura e lave as sementes invertendo o tubo cinco vezes. Aspire o líquido do tubo e repita a lavagem mais quatro vezes. Após a lavagem final, adicione dois mililitros de água ultra-pura e despeje as sementes em uma placa de Petri estéril.
Esterilizar fórceps batendo-os em etanol e depois usá-los para transferir cinco a sete sementes para uma placa de 100 por 25 mililitros com 0,5 XMS mais 0,8% de mídia ágar. Sele as bordas da placa com fita cirúrgica. Certifique-se de que as placas estão empilhadas e de frente para cima.
Estratifique as sementes esterilizadas a quatro graus Celsius no escuro por pelo menos três dias para sincronizar a germinação. Após três dias, oriente verticalmente as placas para que as raízes cresçam ao longo da superfície da placa e a linha de sementes seja orientada horizontalmente. Transfira as sementes para uma câmara de crescimento a 22 graus Celsius com um ciclo escuro de 16 horas e 8 horas.
Cresça as mudas por dez dias na câmara, momento em que elas normalmente exibirão totalmente emergidas e cotilledons expandidos e primeiras folhas verdadeiras emergentes. Listrar bactérias frescas em ágar KB apropriado com um palito de dente plano e estéril. Para PstT1, incubar a placa a 28 graus Celsius durante 48 horas antes de usar as bactérias no experimento de inundação.
Para preparar o inóculo, resususpense as bactérias em cloreto de magnésio estéril e dez milimônios a uma densidade óptica de 0,1. Em seguida, faça duas diluições seriais para obter uma concentração de trabalho com um OD600 de 0075. Também prepare uma diluição de um a dez copolímero surfactante organosilicone não iônico em dez cloreto de magnésio milililar.
Vórtice e adicione-o às bactérias, girando o tubo para misturar. Transfira as placas com as mudas de dez dias de idade da câmara de crescimento para o armário de biossegurança e remova a fita cirúrgica. Em seguida, transfira seis mililitros de inóculo para cada placa.
Empurre suavemente as mudas para o inóculo com uma ponta de pipeta e inicie um temporizador por três minutos. Segure uma placa em cada mão e incline a frente da placa para baixo para submergir os cotilledons e folhas das mudas. Swish o inóculo lado a lado cinco a sete vezes, em seguida, ponta as placas de volta para cobrir as raízes com o inóculo.
Incline as placas para baixo novamente e repita o ciclo por um total de três minutos. Despeje o inóculo das placas, coloque-os em uma superfície plana e despeje qualquer inóculo residual pela segunda vez. Enrole as placas e coloque-as de volta na câmara de crescimento.
As cultivares Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS foram inundadas com PSTDC3000 e fenotítipadas de sete a dez dias após inundações. As mudas moneymaker-PtoR carregam o aglomerado genético PtoPRF e foram resistentes ao PSTDC3000. Enquanto as mudas de Moneymaker-PtoS quase isogênicas, que não podem reconhecer os efeitos PSTDC3000 AVRPto ou AVRPto-B, morreram rapidamente, dentro de sete dias após inundações.
Mudas de dez dias foram inundadas com PstT1 e fenotítipadas pelo menos dez dias após inundações. Adesões suscetíveis estavam mortas, tinham meristems atópicos marrons e não tinham novo crescimento. Em contraste, as mudas resistentes apresentaram um alto nível de crescimento verde e sobreviveram à infecção com PstT1.
Ensaios de crescimento bacteriano foram realizados para confirmar quantitativamente a resistência ao PstT1 e ao Solanum NeoRici LA1329. Houve uma diferença de 1,7 log no crescimento bacteriano entre la1329 resistente e suscetível e uma diferença de 1,6 log entre la1329 resistente e Moneymaker-PtoS, que se correlacionava com os resultados fenotípicos. Ao realizar este ensaio, as coisas mais importantes a se lembrar são prestar muita atenção à técnica asséptica em todo o protocolo e garantir que todas as mudas na placa estejam completamente inundadas.
Certifique-se de autoclave tecido vegetal infectado e bactérias e descarte de materiais de acordo com as normas apropriadas.
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Visão Geral
O ensaio de inundação de plântulas permite a triagem rápida de acessos de tomateiro silvestre quanto à resistência à bactéria Pseudomonas syringae. Este protocolo de alto rendimento minimiza o tempo de crescimento das plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados de forma eficiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fitopatologia
- Genética
- Microbiologia
Contexto
- O ensaio de inundação de plântulas é projetado para triagem de plântulas de tomate.
- Pseudomonas syringae é um patógeno bacteriano significativo que afeta tomates.
- Este ensaio pode ser adaptado para outros patógenos bacterianos.
- Ele auxilia na identificação de resistência genética em acessos silvestres de tomate.
Objetivo do Estudo
- Realizar triagem de acessos de tomate silvestre quanto à resistência a Pseudomonas syringae.
- Caracterizar a base genética da resistência em populações de mapeamento.
- Fornecer um método de alto rendimento para testar grandes tamanhos de amostra.
Métodos Utilizados
- Inoculação por inundação de plântulas de tomate com cepas de Pseudomonas syringae.
- Avaliação do crescimento bacteriano em plântulas.
- Comparação dos níveis de resistência entre diferentes acessos.
- Utilização de condições de câmara de crescimento para otimizar o desenvolvimento das plantas.
Resultados Principais
- O ensaio identifica efetivamente acessos resistentes de tomate.
- Permite rápida rotatividade e teste de grandes tamanhos de amostra.
- Versatilidade comprovada na detecção de resistência a diversos patógenos bacterianos.
- Facilita análises genéticas adicionais de características de resistência.
Conclusões
- O ensaio de inundação de plântulas é uma ferramenta poderosa para triagem da resistência em tomateiro.
- Pode ser adaptado para aplicações mais amplas em patologia vegetal.
- Este método aumenta a eficiência da triagem de resistência na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação rápida de resistência a patógenos em sistemas vegetais apoia a validação inicial de alvos no descobrimento de agroquímicos e biopesticidas. O ensaio de inundação em plântulas permite a triagem fenotípica em alto rendimento de germoplasma silvestre, acelerando a descoberta de características de resistência com valor preditivo para pipelines de proteção de cultivos. Essa abordagem reduz o risco biológico ao validar funcionalmente mecanismos de resistência antes de ensaios de campo intensivos em recursos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar mecanismos de interação hospedeiro-patógeno para esclarecer vias de resistência em tomate.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de locos genéticos utilizando fenótipos discretos de sobrevivência ou métricas quantitativas de crescimento.
- Valor Preditivo: Apoia a priorização de candidatos à resistência mediante a correlação entre resultados fenotípicos e ensaios de crescimento bacteriano.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera fenótipos reprodutíveis de resistência em plântulas com 10 dias de idade, permitindo a avaliação em larga escala de germoplasma.
- Valor Operacional: Padroniza procedimentos de inoculação e alagamento para garantir exposição consistente ao patógeno entre as amostras.
- Escalabilidade: Reduz o tempo de crescimento e o espaço ocupado na câmara, permitindo alto rendimento e testagem de diversas acessões.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Relaciona fenótipos de resistência em plântulas com resultados relevantes de campo por meio da correlação com dados de proliferação bacteriana.
- Desvio Mecanístico de Riscos: Distingue a suscetibilidade induzida por efetores (por exemplo, reconhecimento de AvrPto) da resistência de amplo espectro utilizando linhagens quase-isogênicas.
- Continuidade Pré-clínica: Fornece uma triagem primária escalável que orienta o mapeamento genético e a validação de características em etapas subsequentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a triagem de germoplasma até a identificação de moléculas líderes, permitindo a detecção precoce de características de resistência antes do mapeamento genético ou da validação em campo.
- Biologia da Descoberta: Testa os efeitos do genótipo do hospedeiro sobre a sobrevivência do patógeno e o vigor da plântula após inoculação controlada por inundação.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos (medida de crescimento novo) e qualitativos (sobrevivência/morte) para pontuação da resistência.
- Análises: Permite a correlação entre resistência fenotípica e diferenças no crescimento bacteriano (por exemplo, redução de 1,6–1,7 log) para validar os resultados positivos.
- Pesquisa Translacional: Conecta ensaios com plântulas à validação de genes de resistência por meio de comparações entre linhagens quase-isogênicas.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a múltiplas linhagens de Pseudomonas syringae e outros patógenos bacterianos com modificações mínimas no protocolo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar fenótipos de resistência a contextos genéticos definidos (por exemplo, presença/ausência de Pto/Prf).
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade por meio da redução do ciclo de crescimento e da inoculação padronizada por alagamento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de características de resistência ao fornecer confirmação fenotípica e quantitativa precoce.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de acessos silvestres com base na intensidade comprovada da resistência e na facilidade de manipulação genética.
Considerações de Implementação
- Exige expertise em técnica asséptica, manipulação de patógenos e crescimento de plantas em condições controladas.
- Depende de cabine de segurança biológica, câmaras de crescimento com ciclos precisos de luz/temperatura e espectrofotometria para padronização do inóculo.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao momento da inundação, ciclos de inclinação e volume de inóculo para reprodutibilidade entre experimentos.
- A adaptação a novas cepas de patógenos requer otimização da OD600 bacteriana e da concentração de surfactante, mantendo-se a viabilidade das plântulas.
- A precisão da pontuação fenotípica depende de períodos consistentes de incubação pós-inundação e avaliação objetiva do novo crescimento verde.
