Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado
30 de março de 2020
Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.
Este método é útil para detectar e co-localizar vários biomarcadores em uma única criosecção, incluindo marcadores que normalmente não são detectáveis em seções de parafina. Usando este método experimental de coloração, o tempo de coloração é significativamente reduzido e o método pode ser realizado em qualquer laboratório. Demonstrando este método será Dinesh Jaishankar.
Ele é um pós-doutor qualificado do laboratório, e também o Núcleo de Avaliação de Imunoterapia, Gerente de Instalações. Ao selecionar anticorpos para a análise, considere os conjuntos de filtros de excitação e emissão disponíveis no sistema de imagem semi-automatizado. E depois de testar várias combinações de anticorpos primários conjugados fluoróforos, prepare fluoroforos para serem usados para que você tenha uma sobreposição espectral mínima como sugerido na tabela.
Para coloração multiplex, prepare um coquetel de anticorpos com fluoroforos compatíveis em delírios ótimos predeterminados e adicione o coquetel às seções de tecido de interesse. Para coloração de marcador único, adicione o anticorpo conjugado primário apenas ao slide. Para todas as manchas, inclua um controle de lâmina não manchada que passa pelo mesmo procedimento de coloração sem a adição de um anticorpo conjugado primário.
Depois de uma incubação de uma hora à temperatura ambiente protegida da luz, lave os slides duas vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, manche os slides manchados de multiplex com DAPI por sete minutos à temperatura ambiente protegidos da luz, seguido por duas lavagens de cinco minutos em PBS. Para criar uma biblioteca espectral, defina o poder da lâmpada do sistema de imagem multiespectral para 100% e abra o software operacional do microscópio.
Selecione Editar protocolo e novo protocolo. Digite um nome de protocolo e selecione Fluorescência no modo de imagem. Em seguida, forneça um nome de estudo e carregue os slides manchados no palco.
Clique em Editar exposição e use as opções de foco automático e exposição automática para ajustar os tempos de exposição e adquirir instantâneos para os slides manchados únicos. Depois de fotografar os slides manchados, salve o protocolo. E no software de aprendizado de máquina sob a guia da Biblioteca Build, carregue cada imagem manchada.
Selecione o piso apropriado e clique em Extrair. O software extrairá automaticamente o sinal fluorescente selecionado no piso. Para salvar a cor extraída, clique em Salvar para armazenar.
Um novo grupo pode ser criado ou a cor extraída pode ser armazenada em um grupo existente. Para imagens multiespectrais, uma vez que a biblioteca espectral tenha sido criada e verificada, ajuste o foco e os tempos de exposição no slide manchado multiplex como demonstrado e abra slides digitalizados para criar uma nova tarefa. Forneça um ID de slides e selecione um protocolo.
Em tarefa, selecione a varredura completa de slides para realizar uma varredura de slides inteira no slide manchado multiplex. Em toda a imagem de varredura de slides, selecione regiões de interesse através da imagem. Essas regiões serão digitalizadas usando os tempos de exposição previamente definidos no slide multiplex a ser usado para descompração e análise espectral.
No software operacional do microscópio, selecione adquirir campos MSI sob tarefa e, em seguida, clique em Process Slide para adquirir regiões de interesse em uma ampliação de 20x. Uma vez adquiridas as regiões de interesse, no software de aprendizado de máquina, clique em Arquivo e Abra sob a guia de análise manual para carregar as imagens manchadas de multiplex. Selecione a fonte da biblioteca espectral e clique em Selecionar andares para escolher a biblioteca espectral previamente salva.
Clique em Arquivo e Abra para carregar a imagem não manchada. Em seguida, clique no ícone do marcador de tinta de autofluorescência e desenhe uma linha ou região no slide não manchado para identificar a autofluorescência dentro do tecido. Em seguida, na guia Editar marcadores e cores, atribua nomes para cada marcador e clique em Preparar tudo.
Depois de verificar a imagem espectralmente não misturada, no software de aprendizado de máquina, selecione as opções de membrana de citoplasma e marcador do painel. E usando o botão elipsia, selecione usar este sinal para encontrar, para configurar o marcador para detectar os núcleos, citoplasma ou membrana. quando um marcador citoplasmado ou membrana for escolhido, selecione Usar o sinal para auxiliar na opção de divisão nuclear.
O software detectará e criará automaticamente máscaras individuais para o núcleo, citoplasma e membrana. Use a visualização de patologia para um marcador específico e as opções de configuração no software para ajustar as máscaras e clique em Segment All para criar um mapa de segmentação celular. Após a segmentação celular, selecione os marcadores para fenótipo das células positivas.
Além disso, selecione pelo menos cinco células que não estão manchadas com o marcador escolhido para fenótipo das células negativas. Em seguida, clique em Treinar Classificador para treinar o software para detectar automaticamente todas as células manchadas com os marcadores selecionados dentro da imagem. Um mapa de fenótipo será criado.
Como essas imagens demonstram, anticorpos validados para citometria de fluxo poderiam ser usados para visualizar a coloração tecidual usando o filtro de cristal líquido no sistema de imagem semi-automatizado. Aqui pode-se observar uma imagem espectralmente demilada humana congelada que inclui rotulagem de células B e células proliferantes dentro do centro germinais folicular, e a região inter folicular de células T. A opção de visualização patológica permite a visualização do padrão de coloração individual para cada marcador dentro do tecido de interesse, sugerindo que o método de coloração multiplex e a imagem espectral funcionam em tecido congelado.
Como demonstrado em uma seção de tumor de camundongos congelados, imagens multiespectrais também podem ser usadas para visualizar tumores infiltrando células T, e outras linhagens de células mieloides, incluindo macrófagos associados ao tumor. Podem ser gerados mapas de segmentação celular e fenótipo, e o número de células manchadas para cada marcador analisado pelo software, demonstrando que o software pode ser usado para quantificação da coloração multiespectral em tecidos congelados. Para alguém novo 6para a técnica, é importante conhecer as características específicas de seus fluorochromes, e preparar slides de biblioteca de qualidade para descomprturar espectral com sobreposição espectral mínima.
Também é importante realizar titulação de anticorpos. Em nossa opinião, este método pode fornecer informações sobre a eficácia da imunoterapia para câncer e outras aplicações terapêuticas, especialmente quando o tempo é essencial.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método rápido de coloração para imagem multiespectral em tecidos congelados, permitindo a detecção e a co-localização de múltiplos biomarcadores em uma única crioseção. O método reduz significativamente o tempo de coloração e pode ser realizado em qualquer laboratório.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Imunologia
Contexto
- As seções tradicionais em parafina limitam a detecção de certos biomarcadores.
- As seções de tecido congelado proporcionam melhor preservação da integridade dos biomarcadores.
- A imagem multiespectral permite a análise simultânea de múltiplos marcadores.
- Métodos rápidos de coloração aumentam a eficiência laboratorial.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de coloração rápido e eficaz para tecidos congelados.
- Permitir a detecção de biomarcadores que normalmente são indetectáveis em cortes de parafina.
- Facilitar a utilização deste método em diversos ambientes laboratoriais.
Métodos Utilizados
- Seleção de anticorpos apropriados com base nos conjuntos de filtros de excitação e emissão.
- Teste de várias combinações de anticorpos primários conjugados a fluoróforos.
- Preparação de fluoróforos para minimizar a sobreposição espectral.
- Demonstração do método por um pós-doutorando experiente.
Resultados Principais
- O método permite a co-localização de múltiplos biomarcadores.
- O tempo de coloração é significativamente reduzido em comparação com métodos tradicionais.
- Pode ser realizado em qualquer ambiente laboratorial, aumentando a acessibilidade.
- Efetividade comprovada na detecção de marcadores normalmente indetectáveis.
Conclusões
- O método de coloração rápida é uma ferramenta valiosa para pesquisadores.
- Ele amplia as capacidades da imagem multiespectral em tecidos congelados.
- Essa abordagem pode levar a uma análise mais abrangente de biomarcadores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a detecção rápida e multiplexa de biomarcadores em cortes de tecidos congelados, superando uma limitação importante dos ensaios baseados em FFPE, nos quais certos biomarcadores são indetectáveis devido a artefatos de fixação ou incompatibilidade com anticorpos. Ao reduzir o tempo de coloração e aproveitar sistemas comerciais de imagem multiespectral, o método possibilita testes de hipóteses mais rápidos em programas de imunologia e oncologia de descoberta. A abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao permitir análises espaciais de co-localização de marcadores imunes e tumorais em modelos de tecidos clinicamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção simultânea de até seis marcadores em uma única crioseção, esclarecendo os padrões de coexpressão de antígenos.
- Valor Operacional: Reduz significativamente o tempo de coloração em comparação com métodos tradicionais, acelerando fluxos de trabalho de triagem precoce de biomarcadores.
- Valor Preditivo: Apoia a caracterização fenotípica de infiltrados imunes (por exemplo, células B, células T, macrófagos) em tecidos congelados de humanos e camundongos, auxiliando na desconsideração de riscos funcionais de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes ao gerar bibliotecas espectrais a partir de controles monocorados, garantindo sobreposição espectral mínima.
- Valor Operacional: Utiliza um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado para padronizar a aquisição e análise, melhorando a reprodutibilidade entre usuários e laboratórios.
- Escalabilidade: Permite avaliação confiável de compostos ao gerar mapas fenotípicos quantitativos por meio de segmentação celular e detecção de marcadores baseadas em aprendizado de máquina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Preserva a integridade de biomarcadores em tecidos congelados, oferecendo um sistema relevante para a detecção de doenças que permite identificar marcadores não acessíveis em cortes FFPE.
- Alinhamento com Modelos Pré-clínicos: Utilidade comprovada em cortes congelados de tumores de camundongo para visualizar linhagens de linfócitos T infiltrantes e mieloides, apoiando a redução de riscos mecanicistas em estudos de imunoterapia.
- Avanço com Ajuste de Risco: Permite a quantificação de células coradas por marcador, fornecendo dados para decisões de avançar/não avançar na priorização de alvos e triagem de portfólios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a validação pré-clínica, especialmente para imunoterapias nas quais o contexto espacial da expressão de biomarcadores é fundamental para o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a análise de co-localização de múltiplos biomarcadores na arquitetura intacta do tecido.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da criação padronizada de bibliotecas espectrais e digitalização de lâminas inteiras em aumento de 20x, garantindo resultados quantitativos reprodutíveis.
- Análises: Gera mapas de segmentação e mapas de fenótipos por meio de software de aprendizado de máquina, permitindo comparação objetiva de condições de coloração e populações celulares.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao preservar a antigenicidade em tecidos congelados, permitindo a detecção de marcadores perdidos no processamento em parafina.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de análise multiplexada de biomarcadores em diferentes projetos, reduzindo a dependência de protocolos de coloração de uso único.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da multiplexação espacial.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e a reprodutibilidade por meio de imagem semi-automatizada e separação espectral conduzida por software.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões rápidas de prosseguir ou interromper projetos e reduzir riscos biológicos em estágios avançados por meio da eliminação precoce de riscos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados quantitativos e com resolução espacial de biomarcadores obtidos de modelos de tecidos clinicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, seleção de anticorpos com base na compatibilidade de excitação/ emissão e geração de bibliotecas espectrais.
- Depende do acesso a um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado com filtro sintonizável de cristal líquido e software compatível de análise por aprendizado de máquina.
- Necessita padronização entre equipes de coquetéis de anticorpos, protocolos de diluição e controles de coloração para garantir resultados consistentes entre laboratórios.
- Requer adaptação dos painéis de fluoróforos para minimizar a sobreposição espectral, especialmente ao estender além de seis marcadores ou ao mudar tipos de tecidos.
- Limitação prática: o método é otimizado para tecidos congelados; o desempenho em cortes FFPE não é suportado e pode exigir revalidação devido às diferenças na acessibilidade de antígenos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Antibody and Fluorophore Selecting and Staining
1:52
Spectral Library Preparation
2:59
Multispectral Imaging
3:54
Spectral Unmixing
4:37
Analyzing Multispectral Images via Cell Segmentation and Phenotyping
5:52
Results: Representative Multispectral Imaging and Cell Quantification
7:07
Conclusion
