Efeito das formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica das células epiteliais da córnea humana após exposição à dessecação
2 de maio de 2020
O objetivo deste protocolo é avaliar se diferentes formulações artificiais podem proteger as células epiteliais da córnea humana da dessecação usando um modelo in vitro. Após a exposição a formulações artificiais de lágrimas e proficação, as células epiteliais da córnea humana são avaliadas para a atividade metabólica.
O objetivo deste protocolo é avaliar em um modelo in vitro se as formulações de lágrimas artificiais podem proteger as células epiteliais da córnea humana da dessecação. Este método pode ser usado para ajudar a identificar formulações de olho seco que podem ajudar na proteção ocular para indivíduos com sintomas de olho seco. Este ensaio utiliza uma medida muito sensível de detecção da atividade metabólica das células epiteliais da córnea.
Como resultado, pequenas alterações na saúde das células da córnea devido à dessecação podem ser detectadas. Demonstrando o procedimento hoje estarão Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran e Adeline Suko. Comece cultivando células epiteliais da córnea humana imortalizadas em frascos revestidos de colágeno com 20 mililitros de DMEM/F12 contendo 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio a cada dois ou três dias.
Quando as células estiverem quase confluentes, remova o meio de cultura celular e adicione quatro a seis mililitros de meio de dissociação celular a cada frasco. Incube as células a 37 graus Celsius até que se desprendam, verificando-as periodicamente ao microscópio. Adicione dois a seis mililitros de DMEM/F12 com 10% de FBS a cada frasco e transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Centrifugue as células a 450 a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em meio pré-aquecido. Determine a concentração celular com um hemocitômetro e calcule o volume que contém 100.000 células.
Adicione mídia a cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno I de 48 poços, juntamente com o volume calculado de células, certificando-se de que o volume final em cada poço seja de 0,5 mililitros. Em seguida, incube as células por 24 horas. Para o procedimento de controle, remova os meios de cultura dos poços e trate imediatamente as células com 150 microlitros de uma formulação de teste ou solução de controle de meios.
Em seguida, incube as células por 30 minutos. Remova a solução de teste das células e adicione 0,5 mililitros de solução de corante metabólico a 10%. Incube as células por mais quatro horas.
Após a incubação, remova 100 microlitros de solução de corante de cada poço e transfira-o para uma placa de 96 poços. Use um leitor de placas para medir a fluorescência de cada poço, ajustando a excitação para 540 nanômetros e a emissão para 590 nanômetros. Para realizar o procedimento de recuperação, incube as células com as soluções de teste ou controles conforme descrito anteriormente.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de mídia DMEM/F12 a cada poço. Incube as células por 18 horas. Em seguida, remova a mídia e teste a atividade metabólica.
Para realizar o procedimento de controle, remova os meios de cultura das células na placa de 48 poços e trate-os imediatamente com a formulação de teste ou solução de controle de meios. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após a incubação, remova as soluções de teste das células e coloque-as em uma câmara de 37 graus Celsius e 45% de umidade por cinco minutos para dessecar.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de corante metabólico a 10% e incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, transfira 100 microlitros da solução de corante metabólico de cada poço para uma placa de 96 poços e meça a fluorescência. Para realizar o procedimento de recuperação, repita o protocolo descrito anteriormente e inclua uma incubação de 18 horas com meio DMEM/F12 após a etapa de dessecação.
Em seguida, realize a análise estatística dos dados conforme descrito no manuscrito do texto. Três formulações de olho seco foram comparadas quanto ao seu efeito na viabilidade das células epiteliais da córnea humana. As soluções um e dois tiveram um efeito significativo na atividade metabólica das células antes da dessecação.
As células expostas à solução um mostraram uma queda adicional na atividade metabólica celular após uma recuperação de 18 horas, o que significa que foram inicialmente lesionadas e a lesão não foi reparada. Em comparação, a solução três teve apenas um efeito leve na atividade metabólica das células epiteliais. Ao comparar a capacidade dessas formulações de olho seco contendo lipídios de proteger as células, verificou-se que as soluções um e dois não protegiam as células do estresse por dessecação.
A solução três, no entanto, ofereceu alguma proteção. Ao semear as células em placas revestidas de colágeno, certifique-se de que a suspensão celular contenha células uniformemente misturadas para que cada poço seja semeado com números de células iguais. A solução três demonstrou melhora estatisticamente significativa na viabilidade celular e proteção contra o estresse de dessecação em relação aos outros dois produtos contendo lipídios.
É possível que o óleo mineral com fosfolipídios, juntamente com o HP-guar e o propilenoglicol, permita que a solução três forneça proteção de hidratação às células da córnea e reduza a evaporação sob dessecação.
Visão Geral
Este estudo avalia os efeitos protetores de diferentes formulações de lágrimas artificiais sobre células epiteliais corneanas humanas submetidas à dessecação em um modelo in vitro. A atividade metabólica das células é avaliada para determinar a eficácia dessas formulações na prevenção de lesões celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- A síndrome do olho seco é uma condição ocular comum que pode levar ao desconforto e à deficiência visual.
- Lágrimas artificiais são utilizadas para aliviar os sintomas e proteger as células corneais.
- Compreender os mecanismos protetores dessas formulações é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos eficazes.
- Este estudo foca na atividade metabólica das células epiteliais da córnea como medida da saúde celular.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a eficácia de várias formulações de lágrimas artificiais na proteção das células epiteliais corneanas contra dessecação.
- Identificar formulações que melhorem a viabilidade celular e a atividade metabólica após a dessecação.
- Fornecer subsídios para a formulação de tratamentos para olho seco.
Métodos Utilizados
- Células epiteliais corneanas humanas imortalizadas foram cultivadas em meio DMEM/F12.
- As células foram tratadas com diferentes formulações de lágrimas artificiais e submetidas à dessecação.
- A atividade metabólica foi avaliada utilizando um corante metabólico e medição de fluorescência.
- Uma análise estatística foi realizada para comparar os efeitos das formulações na viabilidade celular.
Resultados Principais
- As formulações um e dois reduziram significativamente a atividade metabólica antes da dessecação.
- A solução três demonstrou uma melhoria estatisticamente significativa na viabilidade celular após a dessecação.
- Apenas a solução três proporcionou proteção contra o estresse de dessecação.
- O óleo mineral com fosfolipídios na solução três pode melhorar a hidratação e reduzir a evaporação.
Conclusões
- Nem todas as formulações de lágrimas artificiais protegem efetivamente as células epiteliais da córnea da dessecação.
- A solução três é uma candidata promissora para melhorar a proteção ocular em condições de olho seco.
- São necessárias mais pesquisas para explorar os mecanismos por trás dos efeitos protetores dessas formulações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio in vitro fornece um método quantitativo e reprodutível para avaliar formulações de lágrimas artificiais quanto à sua capacidade de manter a atividade metabólica das células epiteliais da córnea sob estresse por dessecação. Ele permite a redução de riscos em estágios iniciais de candidatos a tratamentos para olho seco, associando a composição da formulação à proteção celular funcional, apoiando decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento pré-clínico. A abordagem está alinhada aos fluxos de trabalho de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios na descoberta de terapêuticos oculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de efeitos específicos da formulação sobre a viabilidade celular e proteção contra dessecação.
- Valor Operacional: Utiliza a leitura sensível de um corante metabólico (alamarBlue) para detectar pequenas alterações na saúde das células epiteliais da córnea.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara modelos validados de células epiteliais corneais humanas para triagem de formulações posteriores.
- Valor Operacional: Padroniza as condições de exposição e dessecação (incubação de 30 min, 5 min a 37°C, 45% de UR) para obter resultados quantitativos reprodutíveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças utilizando células epiteliais corneanas humanas expostas ao estresse evaporativo.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar formulações que preservam a atividade metabólica após a dessecação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, auxiliando na identificação de compostos líderes ao priorizar formulações que demonstram tanto a manutenção da viabilidade celular quanto a proteção contra dessecação antes de avançar para modelos in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre formulações contendo lipídios na atividade metabólica de células epiteliais corneanas sob estresse por dessecação.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio do semeio padronizado de células, tratamento e medição da atividade metabólica baseada em fluorescência.
- Análises: Gera leituras quantitativas de fluorescência (excitação em 540 nm, emissão em 590 nm), permitindo comparações entre formulações e controles.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica utilizando um modelo celular humano relevante para a fisiopatologia do olho seco evaporativo.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de múltiplas formulações de lágrimas artificiais sob condições definidas de dessecação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na eficácia da formulação ao associar a atividade metabólica à proteção celular contra lesões induzidas pela dessecação.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de densidade celular definida, tempos de incubação e controles ambientais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao identificar formulações que não protegem as células (por exemplo, soluções um e dois) em comparação com aquelas que oferecem proteção significativa (solução três).
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos ao tratamento da síndrome do olho seco com base em melhorias estatisticamente significativas na viabilidade celular após a dessecação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células epiteliais corneanas humanas imortalizadas e técnica asséptica.
- Depende de placas de cultura revestidas com colágeno I, hemocitômetro para contagem celular e leitor de placas com capacidade de detecção de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes quanto às condições da câmara de dessecação (37°C, 45% UR) e ao tempo de incubação com o corante metabólico.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros tipos celulares da superfície ocular ou a modelos alternativos de estresse.
- As limitações práticas incluem o pré-incubação de 30 minutos e a janela de dessecação de 5 minutos, que podem não replicar completamente as condições crônicas de olho seco.
