Name: Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a visualizar receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência. Este protocolo validado auxilia pesquisadores a estudar o papel do estrogênio na inflamação colônica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O trabalho foi publicado graças ao apoio financeiro das autoridades da Universidade de Lodz: Vice-Reitor de Pesquisa Científica, Vice-Reitor de Cooperação Nacional e Internacional e Reitor da Faculdade de Biologia e Proteção Ambiental. Damian Jacenik foi apoiado por subsídios (2017/24/T/NZ5/00045 e 2015/17/N/NZ5/00336) do National Science Centre, Polônia.

Os estudos em animais foram realizados com o consentimento do Comitê Deética Local (28/ŁB29/2016) em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 de Setembro de 2010, e recomendações institucionais.
1. Modelo de murina induzida pelo TNBS da doença de Crohn
NOTA: Este protocolo utiliza camundongos machos BALB/C pesando 25-28 g. Os animais estão alojados a uma temperatura constante (22-24 °C) e, umidade relativa de 55 ± 5%, e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso livre a pelotas de chow padrão e água da torneira ad libitum.
<ol><li>Coloque o mouse na câmara de indução e feche bem a tampa. Anestesiar o mouse brevemente com isoflurano (25% O2 com taxa de fluxo O2 a 1,5-2 L/min). NOTA: A taxa respiratória deve permanecer rítmica e mais lenta do que o normal e não deve mudar em resposta a um estímulo nocivo.</li>
	<li>Instill 4 mg de TNBS em 0,1 mL de 30% de etanol em 0,9% NaCl ou 0,1 mL de 30% de etanol em 0,9% NaCl como controle veicular no cólon distal através de um cateter. NOTA: O cateter deve ser cuidadosamente introduzido aproximadamente 3 cm no ânus.</li>
	<li>Monitore o camundongo diariamente do segundo ao oitavo dia para parâmetros clínicos, incluindo peso corporal, sangramento retal, consistência das fezes e mortalidade.</li>
	<li>No oitavo dia, eutanize o rato por luxação cervical.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg"> Figura 1: Linha do tempo para o modelo de murina induzido por TNBS da doença de Crohn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Separação e avaliação macroscópica do cólon
NOTA: Um dia antes da separação do cólon, diluir 100 μL de antibiótico em 1 mL de salino tampão fosfato (PBS) e sair a 4 °C durante a noite.
<ol><li>Limpe a pele sobre o abdômen usando 75% de etanol e gaze estéril.</li>
	<li>Corte a parede abdominal do osso do peito ao ânus usando tesouras e pinças estéreis.</li>
	<li>Corte o cólon o mais próximo possível do ânus e do ceco.</li>
	<li>Coloque o cólon na placa de Petri. Corte o cólon junto do ânus até a extremidade do ceco. Limpe e lave o cólon 2-4 vezes em solução de antibiótico-PBS frio.</li>
	<li>Realizar avaliação macroscópica usando uma pinça de acordo com a Tabela 1. NOTA: Adesão ao tecido* e eritema/hemorragia#,sangue fecal# e diarreia# estão sujeitos à avaliação visual. * A adesão tecidual avalia utilizando uma escala de três pontos (0: cólon sem adesão tecidual, 1: cólon com adesão moderada do tecido, 2: cólon com extensa adesão tecidual); #baseado na ausência (0) ou presença (1) de eritema/hemorragia, sangue fecal e diarreia.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adesão*</td>
			<td>Eritema/ hemorragia#</td>
			<td>Sangue fecal#</td>
			<td>Diarréia</td>
			<td>Comprimento da úlcera</td>
			<td>Espessura do cólon</td>
			<td>Comprimento do cólon</td>
		</tr>
<tr>
<td>pontos (0 – 2)</td>
			<td>pontos (0 – 1)</td>
			<td>pontos (0 – 1)</td>
			<td>pontos (0 – 1)</td>
			<td>cm/pontos</td>
			<td>mm/pontos</td>
			<td>cm/pontos</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 – ausente</td>
			<td>0 – ausente</td>
			<td>0 – ausente</td>
			<td>0 – ausente</td>
			<td rowspan="3">0,5 cm = 0,5 ponto</td>
			<td rowspan="3">
n mm = n pontos</td>
			<td>0 – &lt;10% menor que o controle</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – moderado</td>
			<td>1 – presente</td>
			<td>1 – presente</td>
			<td>0,5 – fezes leves/soltas</td>
			<td>1 – de 10 a 20% menor que o controle</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 – presente</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 – presente</td>
			<td>2 – mais de 20% mais curto que o controle</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Pontuação macroscópica do intestino de camundongos com modelo induzido por TNBS da doença de Crohn.
<ol start="6"><li>Converta o comprimento da úlcera em centímetros para uma escala de ponto, ou seja, cada 0,5 cm de úlcera é contado como 0,5 ponto. Converta a espessura do cólon em milímetros em uma escala de pontos, ou seja, cada n mm corresponde a n pontos.</li>
	<li>Converta o comprimento do cólon em centímetros em uma escala de três pontos. O comprimento do cólon obtido de cada rato com a doença de Crohn induzida pelo TNBS é avaliado em relação ao comprimento médio do cólon para o grupo controle (0: &lt;10% menor que o controle, 1: de 10 a 20% menor que o controle, 2: mais de 20% mais curto que o controle).</li>
	<li>Calcular o escore macroscópico total de acordo com a equação: Escore macroscópico total = adesão (pontos) + eritema/hemorragia (pontos) + sangue fecal (pontos) + diarreia (pontos) + comprimento da úlcera (pontos) + espessura do cólon (pontos) + comprimento do cólon (pontos).</li>
</ol>3. Preparação da amostra de cólon
<ol><li>Corte o cólon em fragmentos de 1-2 cm e coloque cada um na esponja em um histológico devidamente rotulado. NOTA: Esponjas para histológicas evitam a dobra do cólon durante a desidratação e a incubação na parafina líquida.</li>
	<li>Coloque o fragmento do cólon em 4% de formaldeído e incubar por pelo menos 24 h a 4 °C.</li>
	<li>Preparar e programar o processador de tecidos para 1h de incubação em 50%, 70%, 90%, 95%, 100% etanol, xileno/100% etanol (1:1; v/v), e xileno apenas, bem como para pelo menos 3h de incubação em parafina líquida. NOTA: A desidratação deve ser realizada no aumento das concentrações de etanol e xileno, mas a concentração de etanol pode ser modificada. A mistura de xileno/etanol é recomendada, mas não necessária.</li>
	<li>Transfira o fragmento do cólon para uma caixa histológica e coloque no processador de tecido pré-programado.</li>
	<li>Execute o processador de tecido.</li>
	<li>Após os passos de incubação, coloque o fragmento de cólon em um molde metálico para que as duas extremidades do cólon estejam em posição vertical e preencha um terço do molde com parafina líquida.</li>
	<li>Coloque o molde na área de resfriamento (-5 °C) por alguns segundos e, em seguida, mova o molde para a área de aquecimento (70 °C). Coloque na parte inferior da caixa histológica e cubra todo o fragmento de cólon com parafina líquida.</li>
	<li>Deixe o molde metálico com o fragmento de cólon na parafina por alguns minutos na área de resfriamento. Retire o molde metálico do bloco de parafina e incuba por pelo menos 24 h a 4 °C.</li>
	<li>Remova o excesso de parafina do bloco e insira-o em um microtome rotativo totalmente automatizado. NOTA: O bloco de parafina pode ser armazenado a -20 °C por alguns minutos antes desta etapa.</li>
	<li>Corte o fragmento do cólon em seções de 5 μm.</li>
	<li>Transfira a seção do cólon para um banho de água pré-aquecido a 40 °C.</li>
	<li>Use a lâmina de vidro etiquetada para remover a seção de cólon do banho de água. NOTA: As seções de cólon flutuam sobre a água. Coloque a lâmina de vidro etiquetada na água a seção do cólon e retire cuidadosamente a lâmina de vidro.</li>
	<li>Deixe a lâmina de vidro por 24 h em temperatura ambiente. Para armazenamento a longo prazo, mantenha a lâmina de vidro a 4 °C após 24 h de incubação à temperatura ambiente.</li>
</ol>4. Imunohistoquímica com coloração de imunofluorescência
NOTA: Não permita que a seção do cólon seque em nenhuma etapa durante o procedimento.
<ol><li>Remova a parafina incubando o deslizamento de vidro em xileno por 5 min. Repita este passo três vezes.</li>
	<li>Coloque a lâmina de vidro em xileno/100% etanol (1:1; v/v) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.</li>
	<li>Reidratar a seção de cólon em uma série de concentrações de etanol decrescentes, ou seja, 70%, 50%, 30% e 10% etanol por 5 min. Repita cada passo três vezes.</li>
	<li>Enxágüe a lâmina de vidro em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Tampão de recuperação de antígeno pré-aquecimento (citrato de sódio de 10 mM; 0,05% Tween 20, pH 6.0) a 95-98 °C e aqueça a lâmina de vidro em solução de recuperação de antígeno fervente por 10 min. NOTA: A etapa de recuperação de antígenos é opcional, mas recomendada. A solução de desmascaramento deve ser otimizada dependendo do anticorpo usado no experimento.</li>
	<li>Desenhe um círculo ao redor da seção de cólon usando uma caneta hidrofóbica. NOTA: Esta etapa é opcional, mas recomendada. A caneta hidrofóbica evita o desperdício de reagentes mantendo o líquido agrupado em um pequeno volume dentro marcado pelo círculo.</li>
	<li>Incubar a seção em 3% de solução de água de peroxidase de hidrogênio por 10 min.</li>
	<li>Lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) por 5 min.</li>
	<li>Incubar na solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) por 1h à temperatura ambiente. NOTA: Na solução de bloqueio, o soro normal deve ser da mesma espécie do anticorpo secundário. Nos estágios em que a incubação é necessária, coloque o deslizamento de vidro em uma câmara de umidade para evitar evaporação excessiva.</li>
	<li>Remova a solução de bloqueio e adicione 20-50 μL de anticorpo primário contra ERα, ERβ ou GPER diluído em albumina de soro bovino de 1% com 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. NOTA: As diluições recomendadas dos anticorpos primários são mostradas na Tabela 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tipo de anticorpo</td>
			<td>Anticorpo contra</td>
			<td>Clonalidade</td>
			<td>Espécies hospedeiras</td>
			<td>Reatividade de espécies</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">Primária</td>
			<td rowspan="4">ERα</td>
			<td rowspan="4">Polyclonal</td>
			<td rowspan="4">Coelho</td>
			<td>Humano</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tartaruga</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capivara</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">ERβ</td>
			<td rowspan="6">Polyclonal</td>
			<td rowspan="6">Coelho</td>
			<td>Humano</td>
		</tr>
<tr>
<td>Macaco</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ovelhas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porco</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">GPER</td>
			<td rowspan="3">Polyclonal</td>
			<td rowspan="3">Coelho</td>
			<td>Humano</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundário</td>
			<td>DyLight 650</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Cabra</td>
			<td>Coelho</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Características dos anticorpos.
<ol start="11"><li>Incubar com anticorpo primário durante a noite a 4 °C na escuridão.</li>
	<li>Remova a solução de anticorpos e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.</li>
	<li>Adicione 20-50 μL de anticorpo secundário DyLight 650 diluído em albumina de soro bovino de 1% (contendo 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubar com anticorpo secundário conjugado com tintura por 1 h à temperatura ambiente na escuridão. NOTA: A diluição recomendada do anticorpo secundário é mostrada na Tabela 2.</li>
	<li>Remova a solução de anticorpos e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.</li>
	<li>Adicione 2% de DiOC6(3) diluído em 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e incubar por 10 min à temperatura ambiente na escuridão.</li>
	<li>Remova a solução e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.</li>
	<li>Adicione algumas gotas de líquido à base de glicerol com DAPI diretamente na seção do cólon e cubra cuidadosamente com um slide de cobertura. Incubar a seção de cólon por pelo menos 24 h a 4 °C. NOTA: Evite bolhas de ar ao cobrir o tecido com a lâmina da tampa.</li>
	<li>Analise a seção de cólon microscópio confocal com objetivos de 20x ou 63x e imersão em óleo usando software dedicado. NOTA: A Tabela 3 lista características dos fluorocromos utilizados neste estudo.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Tipo fluorochome</td>
			<td colspan="2">Comprimento de onda (nm)</td>
			<td rowspan="2">Tintura</td>
		</tr>
<tr>
<td>Excitação</td>
			<td>Emissão</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>Azul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DioC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>Verde</td>
		</tr>
<tr>
<td>DyLight 650</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>Vermelho</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Características dos fluorocromos.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Existem inúmeros modelos animais para o exame de fisiopatologia do IBD, incluindo modelos genéticos, imunológicos ou espontâneos, bem como modelos quimicamente induzidos15. Entre os vários tipos de modelos animais de colite, modelos quimicamente induzidos, como o modelo induzido pelo TNBS descrito neste protocolo, são relativamente baratos e fáceis de obter. O modelo de murina induzida pelo TNBS tem vários sintomas clínicos relacionados à base patológica do CD. Animais com colite induzida são cara...

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória intestinal (DII) manifestada como inflamação crônica do intestino. A etiologia do CD é pouco compreendida, mas existem alguns fatores importantes que parecem ser responsáveis pelo desenvolvimento do CD, incluindo a microbiota intestinal, e fatores genéticos e ambientais, como dieta ou estresse1. Para uma melhor compreensão da patogênese da doença de Crohn, vários modelos de inflamação intestinal têm sido utilizados2,3,4,5,6,7. Neste artigo, apresentamos resultados obtidos a partir de um modelo de murina induzida por 2,4,6-trinitrobbenzeno (TNBS) do modelo de CD.
Foi documentado que os estrogênios são capazes de modular a inflamação intestinal crônica8,,9,10,11,12. A atividade biológica dos estrogênios é mediada por receptores cognatos, entre os quais estão receptores de estrogênio nuclear (ERs), ou seja, ERα (gene ESR1) e ERβ (gene ESR2),bem como receptor esgota do g acoplado à proteína, ou seja, GPER (gene GPER1),referido como ER13,14. Existem vários métodos para determinar o nível dos receptores de estrogênio, mas apenas alguns podem ser usados para visualizá-los no intestino.
A imunohistoquímica (IHC) é um método amplamente utilizado em estudos clínicos e básicos para a detecção de certos antígenos em células ou tecidos com anticorpos florocromos conjugados. O IHC parece ser um importante método na visualização da estrutura tecidual, bem como na identificação e localização de proteínas específicas, o que pode ser crucial para a compreensão do desenvolvimento da colite. Aqui, apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no intestino usando imunofluorescência.

<table><tbody><tr><td>Animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C camundongos</td><td>Universidade de Lodz</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de papelão</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo rotativo totalmente automatizado - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Incorporação de Parafina Aquecida - EG1150 H</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Caixa histológica</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Balança de laboratório</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>LAS X software</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Molde metálico</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura estéril</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pinça estéril</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Processador de tecidos - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzeno sulfônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 anticorpo secundário</td><td>Abcam</td><td>ab96886</td><td></td></tr><tr><td>ER &alfa; anticorpo primário</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER &beta; anticorpo primário</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Avantor Performance Materials Polônia</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Avantor Performance Materials Polônia</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>GPER anticorpo primário</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Avantor Performance Materials Polônia</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase</td><td>de hidrogênio Avantor Performance Materials Polônia</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano (forano)</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petrie</td><td>Nest Scientific</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (antibiótico)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant com DAPI (líquido à base de glicerol com DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Chempur</td><td>WE / 231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Avantor Performance Materials Polônia</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Avantor Performance Materials Polônia</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Avantor Performance Materiais Polônia</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de crohn induzida pelo tnbs usando imunofluorescência

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

A doença de Crohn é o tipo mais diagnosticado de doença inflamatória intestinal. A inflamação crônica que se desenvolve no intestino leva à desordem da peristalse e aos danos da mucosa intestinal e parece estar associada a um risco aumentado de transformação neoplásica do cólon. O acúmulo de evidências indica que os estrogênios e receptores de estrogênio afetam não apenas tecidos sensíveis a hormônios, mas também outros tecidos não diretamente relacionados a estrogênios, como os pulmões ou cólon. Aqui, descrevemos o protocolo para a bem sucedida coloração de imunofluorescência de receptores de estrogênio no cólon obtido susceptência de um modelo murina da doença de Crohn induzida pelo TNBS. Um protocolo detalhado para a indução da doença de Crohn em camundongos e preparação do intestino é fornecido, bem como um procedimento imunohistoquímico passo a passo usando seções de intestino parafina fixado formalina. Os métodos descritos não só são úteis para a detecção de receptores de estrogênio e a investigação de sinalização de estrogênio in vivo, mas também podem ser aplicados para outras proteínas que podem estar envolvidas no desenvolvimento de colite.

Características macroscópicas de cólons em camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS Imagens representativas de cólons retirados do controle e camundongos tratados com TNBS são mostradas na Figura 2. Em camundongos com um modelo induzido por TNBS da doença de Crohn, o comprimento do cólon é reduzido enquanto a largura do cólon é aumentada.
<img alt="Figure 2" class="xfig...

O protocolo apresenta um modelo completo de murina induzida por TNBS da doença de Crohn e métodos para visualização de receptores de estrogênio por imunohistoquímica usando imunofluorescência de seções de cólon fixas de formalina embutidas em parafina.

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Evidências crescentes sugerem o impacto da sinalização de estrogênio na parte colonia da fisiologia, a imunohistoquímica é uma técnica promissora para identificar receptores de estrogênio no cólon e eles evoluem para colite. Apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no cólon, utilizando imunofluorescência. Juntamente com a Dra.Coloque o cólon em uma placa de petri. Corte o cólon em fragmentos de um a dois centímetros. Coloque cada fragmento em uma esponja em um histológico apropriadamente rotulado.Coloque um contendo um fragmento de cólon em 4% de paraformaldeído. Incubar por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Prepare e programe o processador de tecidos para uma hora de incubação em 50%70%90%95% e 100% etanol, xileno 100% etanol e apenas xileno, bem como por pelo menos três horas de incubação em parafina líquida.Transfira o fragmento do cólon para uma caixa histológica. Coloque a caixa no processador de tecido pré-programado e execute o processador. Após a incubação no processador de tecido, remova o cólon da caixa histológica e coloque o fragmento do cólon em um molde de metal, de tal forma que as duas extremidades do cólon estejam em uma posição vertical.Encha um terço do molde com parafina líquida. Coloque o molde na área de resfriamento a menos cinco graus celsius por alguns segundos e, em seguida, mova o molde para a área de aquecimento a 70 graus celsius. Em seguida, coloque o molde na parte inferior da caixa histológica e cubra todo o fragmento de cólon com parafina líquida.Coloque o molde metálico contendo o fragmento do cólon e a parafina na área de resfriamento por alguns minutos. Em seguida, remova o molde de metal do bloco de cólon e parafina. Incubar o bloco de cólon e parafina por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius.Após a incubação, remova o excesso de parafina do bloco. Insira o bloco de cólon e parafina em um microtoma rotativo totalmente automatizado. Corte o fragmento do cólon em cinco seções de micrômetros.Transfira uma seção de cólon para um banho de água, pré-aquecido a 40 graus celsius. Use o slide de vidro rotulado para remover a seção do cólon do banho de água e incubar o escorregador de vidro à temperatura ambiente por 24 horas. Primeiro, remova a parafina incubando o deslizamento de vidro no xileno por cinco minutos.Repita este passo três vezes. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro em uma mistura de xileno e 100% etanol por cinco minutos. Repita este passo três vezes.Use uma série de concentrações de etanol diminuindo para reidratar a seção do cólon. Mergulhe o deslizamento no etanol por cinco minutos. Repita três vezes em cada concentração antes de prosseguir para a próxima concentração.Enxágüe o deslizamento de vidro em água corrente por cinco minutos. Reaqueça o tampão de recuperação de antígeno a 95 a 98 graus celsius. Em seguida, aqueça o deslizamento de vidro na solução de recuperação de antígeno fervente por 10 minutos.Para evitar desperdícios de reagentes, use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da seção de cólon. Em seguida, incubar o slide por 10 minutos em uma solução de 3% de peroxidase de hidrogênio e água. Lave o slide na solução de lavagem por cinco minutos.Em seguida, incubar o slide na solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente. Remova a solução de bloqueio e adicione 20 a 50 microliters de anticorpo primário contra E-R alfa, E-R beta ou G-P-E-R diluídos. Incubar o anticorpo primário durante a noite a quatro graus celsius na escuridão.Remova a solução de anticorpos. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Em seguida, adicione anticorpo secundário diluído.Incubar o slide com anticorpo secundário conjugado com corante por uma hora à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução de anticorpos secundários do slide. Lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez.Adicione fluorocromo diluído para visualização de membrana e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Remova a solução e lave o slide três vezes na solução de lavagem por cinco minutos cada vez. Adicione algumas gotas de DAPI líquido à base de glicerol, um fluorocromo para visualização de núcleos celulares, diretamente na seção de cólon.Cubra-o cuidadosamente com um slide de cobertura. Incubar a seção de cólon por pelo menos 24 horas a quatro graus celsius. Analise a seção de cólon sob um microscópio confocal com objetivos de 20x ou 63x e imersão em óleo.A especificidade dos anticorpos utilizados no estudo foi validada utilizando células MCF-7. Os anticorpos do receptor de estrogênio permitiram a detecção dos receptores nucleares de estrogênio E-R alfa e E-R beta, bem como o receptor de estrogênio ligado à membrana G-P-E-R. Também foi realizado um controle negativo no qual as células MCF-7 foram manchadas apenas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo e líquido à base de glicerol com DAPI.Um forte sinal citoplasmado de E-R alfa foi encontrado nas seções de cólon obtidas a partir de ratos de controle e de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS. No entanto, apenas os cólons obtidos a partir de camundongos de controle tinham E-R alfa localizado no citoplasma de células de cálice. A microscopia confocal também revelou a localização citoplasmática do beta E-R nas seções de cólon tanto do controle quanto dos camundongos tratados com TNBS.Da mesma forma, a localização citoplasmática do G-P-E-R foi documentada nas seções de cólon obtidas a partir de camundongos de controle e camundongos tratados com TNBS. O posicionamento correto do cólon no molde é essencial para gerar a seção transversal correta. Fluorocromo deve ser selecionado por seu próprio espectro de excitação e emissão.Este método também pode ser aplicado a outras proteínas que possam estar envolvidas no desenvolvimento de colites. A detecção de imunohistoquímica por imunofluorescência pode ser estendida para manchar outras proteínas no status de direção proteína-proteína.

visualization-estrogen-receptors-colons-mice-with-tnbs-induced-crohn

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra a avaliação da colite induzida por produtos químicos por meio de coloração imuno-histoquímica do tecido do cólon de camundongos. Em uma seção de tecido corado, a presença de um grande número de células imunorresponsivas no tecido danificado representa a infiltração de células imunes durante a colite.

Avaliação da colite induzida por produtos químicos por meio da análise imuno-histoquímica de seções de tecido do cólon

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a infiltração de macrófagos intestinais em um modelo murino de colite usando tomografia mediada por fluorescência (FMT). Ao induzir colite em um camundongo via sulfato de sódio dextrano (DSS), o animal é injetado com anticorpos que reconhecem o marcador de glicoproteína F4 / 80 em macrófagos infiltrados no cólon. O mouse é então fotografado em um dispositivo FMT, onde os sinais de fluorescência e refletância são reconstruídos em uma imagem...

Usando tomografia mediada por fluorescência para avaliar a inflamação intestinal murina

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

A identificação precisa e localização de células epiteliais ao longo da mucosa intestinal são essenciais para definir diferentes linhagens celulares. imagiologia adequado dos tecidos intestinais é crucial para a identificação de padrões de expressão de proteínas com uma resolução máxima. Este estudo visa delinear os métodos ótimos e as condições de processamento do mouse tecidos intestinais.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Neste modelo de colite dirigida por antígeno, as células T OT-II CD4+ que expressam uma proteína fluorescente vermelha foram transferidas adotivamente para camundongos RAG-/- que expressam uma proteína fluorescente verde em fagócitos mononucleares (MPs). Os hospedeiros foram desafiados com Escherichia coli (E.coli) expressando a proteína ovalbumina (OVA) fundida a uma proteína fluorescente ciano (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Neste estudo, nós descrevemos um procedimento detalhado da fibrose intestinal TNBS-negociada, que exibe a patofisiologia comparável à fibrose de Crohn. Nós igualmente discutimos esta aproximação à luz do rapamicina facilitamos efeitos inibitórios na fibrose intestinal.

Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Aprenda a visualizar receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência. Este protocolo validado auxilia pesquisadores a estudar o papel do estrogênio na inflamação colônica.

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

Explorar mais vídeos