Name: Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a usar um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicólise e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma de camundongo. Este método permite monitorar o metabolismo energético em tempo real.

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Os autores desejam reconhecer o apoio do Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu no Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Os espermatozóides são coletados de 8-16 semanas de idade CD-1 ratos machos. Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Weill Cornell Medicine.
1. Dia antes do ensaio
<ol><li>
Preparação do cartucho do sensor e do calibrador extracelular do analisador do fluxo
	<ol>
<li>Para hidratar o cartucho do sensor, retire o cartucho do sensor do Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular XFe96 e coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de serviço público.</li>
		<li>Preencha um reservatório de solução com 25 mL de H2O com destilação dupla usando uma pipeta multicanal, adicione 200 μL de H2O a cada poço da placa de serviço público. Coloque o cartucho de sensor de volta para a placa de serviço público e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO2. NOTA: Cartucho precisa ser hidratado por pelo menos 4 h.</li>
		<li>Aliquot 25 mL do calibrador de analisador de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mL e incuba-lo durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de microplacas revestidas de
	<ol>
<li>Dissolva 2,5 mg de em 5 mL de H2O de destilação dupla para preparar um estoque de 0,5 mg/mL (w/v).</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, preencha cada poço de uma placa de fluxo extracelular de 96 poços com 50 μL da solução 0,5 mg/mL Con A. Deixe a tampa aberta e deixe a placa secar durante a noite à temperatura ambiente. NOTA: Várias placas podem ser revestidas de uma só vez e armazenadas a 4 °C por até quatro semanas até que estejam prontas para uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do amortecedor do esperma
	<ol>
<li>Prepare 250 mL de buffer de fluxo extracelular TYH com baixo HEPES contendo 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2,1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4,5,6 mM glicose e 1 mM HEPES. Aqueça o buffer a 37 °C e ajuste o pH para 7,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dia do ensaio
<ol><li>Preparação para calibração de cartuchos
	<ol>
<li>Substitua o H2O na placa de serviço público com 200 μL de calibrante XF por poço e incubar por pelo menos 1 h em uma incubadora não-CO2 37 °C. NOTA: Em vez de calibrante, estéril filtrado PBS, pH 7.4 pode ser usado.</li>
		<li>Aqueça 50 mL de tampão TYH a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerando um modelo de onda para o analisador de fluxo extracelular
	<ol>
<li>Ligue o analisador de fluxo extracelular e permita que a temperatura se estabilize para 37 °C.</li>
		<li>Abra o software de onda e projete um novo modelo abrindo um modelo em branco (ver Arquivo Suplementar 1,modelo de onda).</li>
		<li>Abra a guia de definições do Grupo. Definir a mídia de ensaio como TYH; pH 7.4 e tipo de célula como esperma toque de rato, deixar estratégias de injeção e pré-tratamentos em branco. Criar diferentes grupos para cada condição de ensaio; neste exemplo, existem 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) e 3-Isobutyl-1-metilxanthine (IBMX) para induzir a capacitação, 2-deoxiglucose (2-DG) como inibidor de glicolíse, antimicina A (antA) e rotenone (rot) como inibidor do complexo III e complexo I da cadeia de transporte de elétrons. NOTA: Para explicar a variabilidade entre poços, pelo menos 7-8 poços por condição devem ser medidos em paralelo.</li>
		<li>Abra a aba do mapa placa e defina o mapa da placa, atribuindo grupos para poços específicos. NOTA: Os quatro poços de canto (A1, A12, H1, H12) serão preenchidos com tampão TYH (sem esperma) e mais tarde serão usados para subtração de fundo.</li>
		<li>Abra a aba Protocol, adicione 4 ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e eite os detalhes de medição(Figura 2, Tabela 1). Destaque medida após injeção e não destacar o equilíbrio.</li>
		<li>Salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e defina o local de economia para o arquivo de resultados.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de compostos para carregar em cartucho de sensor
	<ol>
<li>Prepare 2 mL de 50 mM db-cAMP dissolvendo 9,8 mg de composto no buffer TYH e adicione o IBMX a uma concentração final de 5 mM. NOTA: IBMX tem a tendência precipitar depois de ser diluído no buffer TYH. Os precipitados podem ser dissolvidos por vórtice e incubação da solução TYH/db-cAMP/IBMX em um bloco de calor de 37 °C por 5 min.</li>
		<li>Prepare 1 mL de 500 mM 2-DG dissolvendo 82,1 mg de composto no tampão TYH.</li>
		<li>Prepare 1 mL de 5 μM de AntA/Rot diluindo ambas as drogas no buffer TYH. NOTA: Os compostos são diluídos 10 vezes por injeção no cartucho de analisador de fluxo extracelular; portanto, certifique-se de que as soluções de injeção são 10x mais concentradas.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento do esperma do rato
	<ol>
<li>Anestesie 3 camundongos machos entre 8 e 16 semanas por isoflurano e sacrificar os ratos por deslocamento cervical após nenhuma resposta ao dedo do dedo do dedo do sexo foi detectado. Retire os epididimides cauda e vasa deferentia.</li>
		<li>Coloque cada cauda em 500 μL de tampão TYH pré-aquecido em 24 bem placa, imobilizar o cauda para o fundo da placa usando um par de fórceps e abra o tecido, fazendo 5-7 pequenas incisões com tesoura de penas.</li>
		<li>Transfira a placa imediatamente em uma incubadora não-CO2 37 °C e deixe o esperma dispersar por 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregamento do cartucho do sensor
	<ol>
<li>Dois guias de carregamento portuário para o porto A e D e porto B e C são fornecidos no kit Extracellular Flux. Para carregar uma porta específica, retire a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carregamento da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Ao injetar, use as pontas dos dedos da mão não injetando para manter o guia de carregamento do porto no lugar e inserir as pontas da pipeta verticalmente nos buracos de guia de carregamento do porto.</li>
		<li>Porto A: Usando uma pipeta multicanal, injete 20 μL do buffer TYH em cada coluna.</li>
		<li>Porto B: Injetar 22 μL de buffer TYH na coluna 1-4, injetar 22 μL de 500 mM 2-DG na coluna 5-8, e 25 μL de 5 μM AntA/Rot na coluna 9-12.</li>
		<li>Port C: Injetar 25 μL de buffer TYH em cada coluna com números ímpares, injetar 25 μL de 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX em cada coluna com números pares.</li>
		<li>Coloque o cartucho de sensor com a placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração leva de 10 a 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de placas de esperma
	<ol>
<li>Dissolva 45 mg de BSA em 15 mL de tampão TYH (3 mg/mL w/v) e prepare três alíquotas de 3 mL BSA/TYH solução cada um em 5 mL tubos de centrífuga.</li>
		<li>Combine dois poços de esperma cada um em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, conte o esperma usando um hematocitometro e diluir o esperma a uma concentração de 2 x 107 esperma/mL. NOTA: Use pontas da pipeta do corte para pipetting o esperma para evitar danificar as pilhas.</li>
		<li>Centrífuga o esperma para 3 min em 700 x g, remover o supernatant e adicionar 1 mL de tyh buffer. Repita a etapa centrífuga, retire o supernatant, e transfira cada alíquota da suspensão do esperma em um tubo de centrífuga de 5 mL com 3 mL de BSA/TYH.</li>
		<li>Coloque 180 μL de tampão TYH em cada poço de canto (A1, A12, H1, H12) de uma placa revestida de. Coloque 180 μL de suspensão de esperma em cada poço vazio da placa revestida de (1,2 x 106 espermatozóides/poço).</li>
		<li>Centrífuga a placa de esperma em 250 x g para 1 min, gire a placa por 180°, e centrífuga outra vez em 250 x g para 1 min (a taxa de travagem a mais baixa 1).</li>
		<li>Retire a placa de calibração do analisador de fluxo extracelular e adicione o prato de esperma. Continue o ensaio.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração e análise de dados
	<ol>
<li>Depois de terminar o ensaio, remover o cartucho, abrir o arquivo de resultados, clique na guia Export e exportar a execução concluída como um arquivo Prism GraphPad(Arquivo Suplementar 2:Dados de exemplo primário usado para a Figura 3).</li>
		<li>Duplicar o arquivo ECAR e OCR clicando na nova guia e, em seguida, a família duplicada ... guia (Figura 3A).</li>
		<li>Excluir as primeiras 7 linhas de dados(Figura 3B).</li>
		<li>Normalizar para o ponto de dados antes da injeção de cAMP/IBMX por linha de base subtraindo a linha 1. Clique na aba Analisar e, em seguida, na lista de matemática remove de linha de base e coluna. Destaque a linha selecionada (s): Primeira Linha, Cálculo: Relação:Valor/Linhade Base e Subcolunas: Ignore a Subcoluna. Clique OK (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
<li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection%3A+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li>
<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A perda de capacitação do esperma na ausência de certos substratos metabólicos ou enzimas metabólicas críticas revelou o metabolismo energético como um fator chave que suporta a fertilização bem sucedida. Um interruptor metabólico durante a ativação celular é um conceito bem estabelecido em outros tipos de células, no entanto, estamos apenas começando a entender como o esperma adapta seu metabolismo à crescente demanda de energia durante a capacitação. Usando um analisador de fluxo extracelular, desenvolvemos uma ferrame...

A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células1,2,3,4,5.
Os espermatozóides são células motil altamente especializadas; cuja tarefa é entregar o genoma paterno ao ócito. O esperma que sae do intervalo reprodutivo masculino após a ejaculação é ainda funcional imaturo e não pode fertilizar o oócito porque são incapazes de penetrar as vestes dos oócitos. O esperma adquire a competência da fecundação enquanto transitam através do intervalo reprodutivo fêmea em um processo da maturação sabido como a capacitação6,7. Esperma ou esperma recém-ejaculado dissecado do epididímos cauda podem ser capacitados in vitro por incubação em meios de capacitação definido contendo Ca2+,bicarbonato (HCO3-) ou um analógico de axigônta permeável celular (por exemplo, dibutyryl-cAMP), um aceitador de colesterol (por exemplo, albumina de soro bovina, BSA) e uma fonte de energia (por exemplo, glicose). Durante a capacitação, o esperma modifica seu padrão de motilidade em uma batida flagelar assimétrica, representando um modo de natação chamado hiperativação8,9,e eles se tornam competentes para se submeter à reação acrosome7, onde enzimas proteolíticas são liberados que digerem os vestments dos oócitos. Estes processos requerem energia, e semelhante sasmáticas, espermatozóides geram ATP e outros compostos de alta energia através da glicolíse, bem como ciclo de TCA mitocondrial e fosforilação oxidativa (oxphos)10. Enquanto vários estudos demonstram que a glicolyse é necessária e suficiente para suportar a capacitação deespermatozóides 11,12,13,14, a contribuição do oxphos é menos clara. Ao contrário de outros tipos de células onde a glicolíse é fisicamente acoplado ao ciclo tca, espermatozóides são altamente compartimentados e são pensados para manter esses processos em compartimentos flagelar separados: o midpiece concentra a maquinaria mitocondrial, enquanto as enzimas-chave da glicolíse parecem ser restritas à peça principal15,16. Esta compartimentação resulta em um debate em curso sobre se o piruvato produzido na peça principal por glicolíse pode suportar oxphos mitocondrial no meio, e se ATP produzido por oxphos no midpiece seria capaz de difundir suficientemente rapidamente ao longo do comprimento do flagellum para suportar as necessidades energéticas em partesdistaisda peça principal 17,18,19. Há também o apoio de um papel para o oxphos na capacitação de espermatozóides. Não só o oxphos é mais favorável do que a glicolíse, gerando 16 vezes mais ATP do que a glicolíse, mas o volume médio e o conteúdo mitocondrial estão diretamente correlacionados com a aptidão reprodutiva em espécies de mamíferos que apresentam maiores graus de competição entre os machos para os companheiros20. Abordar essas questões requer métodos para examinar as contribuições relativas de glicolíse e oxphos durante a capacitação do esperma.
Tourmente et al. aplicaram um analisador de fluxo extracelular de 24 poços para comparar o metabolismo energético de espécies de camundongos intimamente relacionadas com parâmetros de desempenho deesperma21significativamente diferentes. Em vez de relatar os valores basal de ECAR e de OCR do esperma non-capacitated, aqui, nós adaptamos seu método usando um analisador extracelular do fluxo de 96 poços para monitorar mudanças no metabolismo de energia durante a capacitação do esperma do rato no tempo real. Desenvolvemos um método que permite monitorar simultaneamente a glicolíse e o oxphos em tempo real em espermatozóides com flagela batendo em até doze condições experimentais diferentes, medindo o fluxo de oxigênio (O2)e prótons (H+) (Figura 1A). Devido à quebra de piruvato para lactato durante a glicolíse e a produção de CO2 através do ciclo TCA, espermatozóides não capacitados e capacitados extrude H+ nos meios de ensaio que são detectados pelo analisador de fluxo extracelular via H+fluorofosfos sensíveis imobilizados para a ponta da sonda de um cartucho de sensor. Em paralelo, o consumo de O2 por fosforilação oxidativa é detectado via O2-fluorofóbicos sensíveis imobilizados até a mesma ponta da sonda (Figura 1B). A detecção eficaz do H+ liberado e consumiu O2 requer um amortecedor de esperma modificado com baixa capacidade de tampão sem bicarbonato ou fenol vermelho. Assim, para induzir a capacitação na ausência de bicarbonato, adotamos o uso de um analógico de cAMP permeável celular injetado juntamente com o inibidor de PDE de ampla gama IBMX22. Três portos de injeção independentes adicionais permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores, o que facilita a detecção em tempo real de alterações na taxa de respiração celular e glicolíse devido à manipulação experimental.

<table><tbody><tr><td><reagentes>fortes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-desoxi-D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; preparar uma solução-mãe a 500 mM em DMSO (111,1 mg/ml) e conservar em alíquotas pequenas</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Anta; preparar uma solução-mãe a 5 mM em DMSO (2,7 mg/ml) e conservar em pequenas alíquotas:</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Concanacalina A, Lectina de Arachis hypogaea (amendoim)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>1169567761</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutiriladenosina 3',5'-monofosfato cíclico sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; preparar uma solução de estoque de 5 mM em DMSO (2mg/ml) e armazenar em pequenas alíquotas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-Cloreto de</td></tr> <tr><td>sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Equipment e materiais</pipeta de canal forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 12 canais 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, incubadora não-CO2</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cetrífugo de 5 mL</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga com adaptador de placa</td> Kit de dissecação <td>IEC FL40R</td><td></td>da <td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td></td><td>World Precision</td><td>Instruments MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase invertida com objetiva de 40X</td><td>Reservatórios de solução Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool, 25 ml, dividido</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de solução OctaPool, 25 mL, dividido</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Também vendido como XFe96 FluxPak mini (102601-100) com 6 cartuchos em vez de 18</td></tr></tbody></table>.

usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

O esperma mamífero adquire a capacidade da fecundação no intervalo reprodutivo fêmea em um processo conhecido como a capacitação. Os processos associados à capacitação requerem energia. Ainda há um debate em curso sobre as fontes que geram o ATP que alimenta a motilidade progressiva do esperma, a capacitação, a hiperativação, e a reação acrógrada. Aqui, descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular como uma ferramenta para analisar as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma do rato. Usando h+- e O2- fluoroforres sensíveis, este método permite monitorar a glicolíse e a fosforilação oxidativa em tempo real em espermatozóides não capacitados versus capacitados. Usar este ensaio na presença de diferentes substratos energéticos e/ou ativadores farmacológicos e/ou inibidores pode fornecer insights importantes sobre a contribuição de diferentes vias metabólicas e a interseção entre sinalização de cascatas e metabolismo durante a capacitação do esperma.

Este método usa um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças em tempo real na taxa de glicolíse e oxphos durante a capacitação de espermatozóides do mouse. A figura 4 mostra um experimento exemplar em que o esperma foi capacitado na presença de glicose como o único substrato de energia e 2-DG e antimicina e rotenone como moduladores farmacológicos. O substrato de energia no amortecedor TYH do analisador de fluxo extracelular e os moduladores fa...

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Este protocolo pode ser usado para aplicar um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma. Desenvolvemos este protocolo para comparar mudanças na glicólise e fosforilação oxidativa em tempo real entre espermatozoides não capacitados e capacitados. Na véspera do ensaio, remova o cartucho do sensor de um kit de ensaio de fluxo extracelular e coloque o cartucho de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade.Encha um reservatório de solução com 25 mililitros de água dupla destilada e adicione 200 microliters de água a cada poço da placa de utilidade, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius. Em seguida, alíquota de 25 mililitros de calibrador de análise de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque o tubo na incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius.Para preparar micro placas revestidas, dissolva 2,5 miligramas de em cinco mililitros de água dupla destilada e use uma pipeta multicanal para encher cada poço de uma placa de 96 poços de fluxo extracelular com 50 microliters da solução, em seguida, deixe a tampa aberta para deixar a placa secar durante a noite. Para preparar o tampão de esperma, aqueça 250 mililitros de tampão TYH analisador de fluxo extracelular a 37 graus Celsius e ajuste o pH para 7,4. No dia do ensaio, substitua a água em cada poço da placa de utilidade por 200 microliters de calibrante XF por poço e coloque a placa de volta na incubadora de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.Para gerar um modelo de onda, ligue o analisador de fluxo extracelular. Enquanto a temperatura está estabilizando para 37 graus Celsius, abra o software de onda e abra um modelo em branco. Sob a guia de definições de grupo, defina o meio de ensaio como TYH e o tipo celular como espermatozoide de rato, deixando as estratégias de injeção e os pré-tratamentos em branco.Crie diferentes grupos para cada condição de ensaio e abra o mapa da placa para atribuir cada grupo a poços específicos. Sob a guia do protocolo, desaqueça o equilíbrio, adicione cada um dos quatro ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e edite os detalhes da medição para que a medida após a injeção seja destacada, em seguida, salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e salve os resultados. Antes de colher o esperma, pré-aqueceu 50 mililitros de tampão TYH a 37 graus Celsius.Após a colheita de caudas de camundongos machos adultos, coloque cada cauda em 500 microliters do tampão TYH pré-aquecido em poços individuais de uma placa de 24 poços. Use fórceps para imobilizar cada cauda individualmente na parte inferior de cada poço e rapidamente fazer cinco a sete pequenas incisões em cada tecido usando tesoura de penas. Quando todas as caudas tiverem sido incisadas, coloque imediatamente a placa na incubadora de dióxido de carbono para permitir que o esperma se disperse por 15 minutos.Para carregar o cartucho do sensor, remova a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carga da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Segurando o guia de carregamento da porta no lugar, insira as pontas da pipeta verticalmente nos orifícios guia de carregamento da porta A e injete 20 microliters de tampão TYH em cada coluna. Para a porta B, injete 22 microliters de tampão TYH nas colunas um a quatro, 22 microlitadores de 500 milmolares 2-desoxiglucose nas colunas cinco a oito, e 25 microlitadores de cinco antimicina micromolar A rotenone nas colunas nove a 12.Para a porta C, injete 25 microliters de tampão TYH em cada coluna com números ímpares e 25 microliters de 10 milimilitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX em cada coluna com números pares, em seguida, coloque o cartucho do sensor com uma placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração levará de 10 a 15 minutos. Para preparar as placas de esperma, adicione três mililitros de três miligramas por mililitro de soro bovino em tampão TYH para cada um dos três tubos de centrífugas de cinco mililitros.Em seguida, poça dois poços de esperma em cada um dos três tubos de centrífugas de 1,5 mililitro. Após a contagem, dilui o esperma em duas vezes 10 para os sete espermatozoides por concentração mililitro por amostra em TYH fresco complementado com albumina de soro bovino. Sedimente o esperma por centrifugação e resuspense as pelotas de esperma em um mililitro de tampão TYH.Centrifugar o esperma novamente e remover os supernacantes tomando cuidado para não perturbar as pelotas. Transfira cada suspensão de esperma em um dos tubos de centrífugas preparados de cinco mililitros e adicione 180 microliters de tampão TYH em cada poço de canto de uma placa revestida. Adicione 180 microliters de esperma em cada poço vazio da placa revestida e centrifugar a placa duas vezes girando a placa 180 graus entre centrífugas, em seguida, coloque a placa de calibração com a placa de esperma e continue o ensaio.Neste experimento representativo, os espermatozoides foram capacitados na presença de glicose como o único substrato energético e 2-desoxicose e antimicina e rotenona como os moduladores farmacológicos. A seta indica indução da capacitação. Na presença de glicose, a capacitação foi acompanhada por um aumento de sete vezes na taxa de acidificação extracelular que é inibida pelo bloqueio da glicolise com 2-desoxicosglucose.O esperma capacitado demonstrou um aumento de 20 vezes na taxa de consumo de oxigênio em comparação com espermatozoides não capacitados demonstrando que o esperma do camundongo melhora tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa para suportar a crescente demanda de energia durante a capacitação. O aumento da taxa de acidificação extracelular durante a capacitação do esperma não é afetado pelos inibidores de fosforilação oxidativa antimicina A e rotenona indicando que a mudança nesta taxa é impulsionada principalmente pela liberação de hidrogênio da glicólise. O aumento da taxa de consumo de oxigênio, no entanto, é bloqueado pela antimicina A e rotenona, bem como por 2-desoxicosglucose revelando que o aumento do OXPHOS durante a capacitação do esperma depende da atividade glicóltica.A fonte de energia e os ativadores e inibidores farmacológicos podem ser variados dependendo do objetivo do experimento e até 12 condições diferentes podem ser medidas em paralelo. O protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies como humano ou bovino, onde as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação são igualmente enigmáticas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo fornece uma abordagem bioquímica para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) de células leucêmicas primárias com ensaio de fluxo extracelular. A avaliação do perfil metabólico dessas células ajuda a caracterizar suas demandas, levando a uma terapia personalizada.

Ensaio de Fluxo Extracelular: Um Método para Medir o Perfil Metabólico das Células

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

A análise proteômica de qualquer tipo de célula é altamente dependente da pureza e do pré-fracionamento do material de partida, a fim de descomplexificar a amostra antes da espectrometria de massa (MS) por cromatografia líquida. Usando técnicas de retrolavagem, espermatozóides puros podem ser obtidos de roedores. Após a digestão, os fosfopeptídeos podem ser enriquecidos com TiO2.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

A glicólise é um marcador metabólico definidor em vários sistemas biológicos. O monitoramento da glicólise medindo o fluxo extracelular de H+ é comum, mas requer correção para ser quantitativa e inequívoca. Aqui, demonstramos como coletar e corrigir dados de fluxo extracelular para distinguir entre fontes respiratórias e glicolíticas de acidificação extracelular.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.

Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

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Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular

Aprenda a usar um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicólise e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma de camundongo. Este método permite monitorar o metabolismo energético em tempo real.

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Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

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