Name: Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a produzir plasma autólogo rico em plaquetas para expandir fibroblastos humanos de forma segura. Este método padronizado promove proliferação celular massiva para terapias autólogas em medicina regenerativa.

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Agradecemos ao senhor deputado Grégory Schneiter pela assistência técnica com os dados da citometria de fluxo; a professora Muriel Cuendet (Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e da Universidade de Genebra) por permitir o uso do citômetro de fluxo Attune e do microscópio de alto rendimento Cytation 3; Professora Brigitte Pittet pelos pareceres científicos.

O protocolo do estudo seguiu a Declaração de Helsinque, e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de participarem do estudo. As amostras de pele são obtidas de mulheres saudáveis submetidas à abdominoplastia no Departamento de Cirurgia Plástica, Reconstrutiva e Estética dos Hospitais Universitários de Genebra (Genebra, Suíça). O procedimento está em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética institucional local (protocolo #3126).
1. Elaboração do PRP
NOTA: Os tubos CuteCell-PRP (Tabela de Materiais) são projetados para a rápida preparação de PRP a partir de um pequeno volume de sangue do paciente em um sistema de circuito fechado.
<ol><li>Coleta de sangue total OBS: Colher sangue autólogo de uma veia periférica do braço utilizando agulha borboleta conectada diretamente ao tubo de PRP, conforme protocolo de coleta do instituto médico. O sangue pode ser retirado diretamente através da cânula venosa se o paciente estiver sob anestesia.<ol><li>Abra a embalagem blister do tubo. Realizar a punção venosa e preencher o número desejado de tubos de PRP com sangue total. O vácuo dentro dos tubos permitirá a coleta automática do volume necessário de sangue (~10 mL).</li>
		<li>Vire cuidadosamente os tubos de cabeça para baixo várias vezes para misturar o sangue com anticoagulante.</li>
		<li>Dentro de um gabinete de biossegurança (classe 2), remova 100 μL de sangue total usando uma seringa de 1 mL para contagens adicionais do número de células sanguíneas.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugação NOTA: Certifique-se de que a centrífuga está correctamente equilibrada antes de a iniciar.<ol><li>Uma vez que o sangue é coletado nos tubos de PRP, se necessário, prepare um tubo de contrapeso (fornecido separadamente) com água no mesmo nível que o sangue no tubo de PRP. Coloque os tubos cheios na centrífuga opostos uns aos outros, garantindo que a máquina esteja equilibrada.</li>
		<li>Centrifugar amostras a 1.500 x g por 5 min. NOTA: Defina a velocidade de rotação correspondente de acordo com as instruções do fabricante da centrífuga. Após a centrifugação, o sangue será fracionado. Os glóbulos vermelhos e brancos ficam presos sob o gel, e as plaquetas se depositam na superfície do gel (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Inverter suavemente o tubo de PRP 20x para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático. NOTA: Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel. O plasma deve mudar de claro e transparente para turvo. Se houver agregados plaquetários, eles devem ser coletados com o plasma.</li>
	<li>Para coletar o PRP, retire a solução de plasma do tubo usando um dispositivo de transferência de seringa conectado a uma seringa de 10 mL. OBS: Cerca de 5 mL de PRP serão obtidos de cada tubo. A solução de PRP está agora pronta para misturar na preparação final do meio. A solução pode ser mantida à temperatura ambiente (RT) sob o gabinete de segurança até as etapas futuras envolvendo analisador hematológico e uso.</li>
	<li>Antes de usar o PRP, determinar a concentração plaquetária, o volume plaquetário médio e o número de hemácias e leucócitos usando um analisador hematológico automatizado (Tabela de material). Para isso, retire cuidadosamente 100 μL da solução e transfira para um tubo de 1,5 mL. NOTA: PRP é usado como um suplemento de cultura autóloga em uma concentração entre 5-20% v/v. A concentração ótima de PRP precisa ser determinada para cada linhagem celular. Para prevenir a formação de coágulos de fibrina, o meio de cultura final deve ser suplementado com 2 U/mL de heparina.</li>
</ol>2. Isolamento de fibroblastos autólogos e cultura em meio suplementado com SFB ou PRP
<ol><li>Lavar as amostras de pele em solução salina tamponada com fosfato (PBS) agitando suavemente em um tubo de polipropileno de 50 mL.</li>
	<li>Se a amostra de pele for relativamente grande (>10 cm 2), coloque a amostra na tampa de uma placa de cultura de tecidos de 150 cm2 (lado epidérmico para baixo). Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS. NOTA: Use placa de cultura de tecido menor para amostras menores.</li>
	<li>Quando o corte de gordura estiver completo, corte o tecido em tiras de aproximadamente 0,5 cm x 1,5 cm usando um bisturi estéril.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de mistura colagenase-dispase (Tabela de Materiais; 14 unidades Wünsch/mL) a um tubo estéril de 15 mL.</li>
	<li>Transfira o tecido cortado para o tubo, garantindo que os pedaços de tecido estejam submersos na solução. Tampe o tubo com segurança.</li>
	<li>Colocar os tubos numa incubadora a 37 °C com agitação orbital durante 150 minutos. Após a incubação, coloque o tubo contendo o tecido no armário de biossegurança.</li>
	<li>Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 mm de cabeça para baixo no armário de biossegurança. Transfira a solução de tecido digerido para o fundo da placa de cultura de 100 mm, sem respingos. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de 1 mL ou pinça estéril para transferir os pedaços de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 mm.</li>
	<li>Com a tira da epiderme voltada para cima, separe a lâmina de epiderme intacta da derme usando dois pares de pinças. Segure a derme da tira de tecido com um par de pinças e a borda da epiderme com outro par de pinças. Descasque a derme e a epiderme em dois pedaços, mantendo os pedaços separados na mesma tampa. Tente realizar essa etapa rapidamente e repita a manipulação para cada pedaço de tecido.</li>
	<li>Transfira as peças dérmicas para uma nova placa de cultura de 100 mm contendo PBS.</li>
	<li>Com pinça de laboratório, colocar as peças dérmicas em tubo de polipropileno de 15 mL com 3 mL de tripsina/PBS a 0,3%. Incubar durante 10-20 minutos em banho-maria a 37 °C e inverter o tubo várias vezes a cada 2-3 minutos.</li>
	<li>Para interromper a reação enzimática, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo gelado (meio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] ou RPMI contendo 10% de FBS). Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes. Filtrar a suspensão de fibroblastos através de uma tela de náilon de 85 μm (colocada sobre o topo de um tubo de 50 mL) para remover detritos dérmicos.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 150 x g, a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100−1.000 μL de meio de crescimento completo.</li>
	<li>Usando azul de tripano (fator de diluição de x2) misturado com a suspensão celular, conte o número de células totais e viáveis preenchendo a câmara do hemocitômetro. NOTA: A viabilidade celular depende das condições utilizadas para a digestão enzimática. Para aumentar a recuperação celular e a viabilidade celular, a amostra de pele pode ser cortada em pedaços menores.</li>
	<li>Placa 3−10 x 104 células em 5 mL de meio de cultura completo de SFB (DMEM, 10% de FBS inativado termicamente por 60 min a 56 °C, solução tampão 1% M HEPES, mistura de aminoácidos não essenciais 1% 100x, 1% 100x L-glutamina, 1% 100x penicilina/estreptomicina, 1% 100x piruvato de sódio) em um frasco de cultura de tecidos25 cm2 . Incubar a 37 °C. NOTA: Os fibroblastos viáveis fixam-se ao frasco dentro de 24 h e começam a exibir a forma fusiforme em 2-3 dias.</li>
	<li>No dia 2, aspirar o meio contendo células não aderentes e adicionar meio fresco. NOTA: Como as células mortas no meio de cultura afetam o crescimento de fibroblastos viáveis, as células mortas não aderentes devem ser removidas da cultura.</li>
	<li>Troque o meio a cada 3−4 dias até que a cultura atinja 70−80% de confluência.</li>
	<li>Para colher fibroblastos, lavar com PBS e incubar com solução de tripsina/EDTA por 3 min a 37 °C na incubadora.</li>
	<li>Para parar a reação, adicione 3 a 5 mL de meio de crescimento completo morno (DMEM ou RPMI contendo 10% de FBS). Tome uma alíquota da suspensão celular para contar as células com o hemocitômetro. Centrifugar a suspensão por 5 min a 200 x g e retirar o meio por aspiração.</li>
	<li>Cultura do fibroblasto em meio PRP (DMEM, PRP 20%, tampão HEPES 1% 1M, mistura de aminoácidos não essenciais 100x 1%, L-glutamina 100x, penicilina/estreptomicina 100x, piruvato de sódio 100x 1%, heparina 2U/mL) na incubadora a 37 °C. NOTA: A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis/cm2.</li>
	<li>Para avaliar os efeitos do PRP sobre a proliferação fibroblástica, foram utilizados fibroblastos de sementes (passagem 2) em placas de 24 poços a uma densidade de 8 x 103 células por poço em meio de PRP com diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) e com 2 U/mL de heparina ou em condições clássicas de meio de cultura (10% SFB). Após 7 dias de cultivo, adicionar um corante vital (violeta de proliferação celular) às células e avaliar a proliferação por citometria de fluxo.</li>
	<li>Para estudar rearranjos citoesqueléticos, as células de sementes em 96 placas de fundo plano bem preto/claro a uma concentração de 1 x 105 células/mL em DMEM de crescimento completo de FBS (ver etapa 2.14) suplementadas com 0,5% de FBS por 24 horas. Tratar as células com SFB a 10% ou diferentes concentrações de PRP (1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) por 7 dias.<ol><li>Fixar os fibroblastos com paraformaldeído a 4% por 10 min e permeabilizar com Triton X-100 a 0,1% por 5 min na RT. Manchar os fibroblastos com 50 mL de faloidina 5 U/mL, lavar 2x com PBS e marcar com 50 mL de 1 mg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. Cytation 3 cell imaging multimode reader (BioTek) foi usado para visualizar a coloração de faloidina.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Atashi, F. S. B., Nayernia, Z., Pittet-Cuénod, B., Modarressi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Rich+Plasma+Promotes+Proliferation+of+Adipose+Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+via+Activation+of+AKT+and+Smad2+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (8), (2015).</li>
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Este projeto foi financiado pela Regen Lab SA. Sarah Berndt é gerente de projeto chefe de terapia celular do Regen Lab e trabalha no Regen Lab SA. Antoine Turzi é o CEO da RegenLab.

As vantagens do uso de fibroblastos autólogos como uma alternativa natural em comparação com outros materiais de preenchimento na terapia celular de feridas incluem boa biocompatibilidade, efeitos colaterais mínimos e facilidade de coleta e uso. No entanto, antes de usar essas terapêuticas em um ambiente clínico diário, estudos pré-clínicos adequados são necessários para identificar as características de crescimento e avaliar a função biológica e a segurança dos fibroblastos isolados antes e após o transplante. Assim, lo...

A medicina regenerativa visa curar ou substituir tecidos e órgãos danificados pela idade, doença ou trauma, bem como corrigir defeitos congênitos. Na terapia autóloga, células ou tecidos são retirados de um paciente, expandidos ou modificados e, em seguida, reintroduzidos no doador. Essa forma terapêutica tem amplo potencial no campo da dermatologia1. Na terapia autóloga de fibroblastos, os fibroblastos de um paciente são cultivados e reinjetados para tratar rugas, rítides ou cicatrizes de acne. Como os fibroblastos são as principais células funcionais da derme, a injeção de fibroblastos autólogos pode ser mais benéfica do que outras terapias no rejuvenescimentofacial2.
Na pele, os fibroblastos são responsáveis pela síntese e secreção de proteínas extracelulares (colágeno, elastina, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos). Eles também liberam fatores de crescimento que regulam a função celular, migração e interações célula-matriz/célula-célula na homeostase normal da pele e cicatrização de feridas3. Os fibroblastos dérmicos já foram introduzidos como potencial terapia celular clínica para cicatrização de feridascutâneas4, regeneração tecidual5 ou preenchimentos dérmicos em procedimentos estéticos e de cirurgiaplástica6. Alguns estudos até sugerem que, no contexto da medicina regenerativa, os fibroblastos podem ser uma terapia celular mais prática e eficaz do que as células-tronco mesenquimais7.
Para obter um número suficiente de fibroblastos para aplicações clínicas, a expansão celular é geralmente obrigatória. A cultura de células ex vivo/in vitro requer meio basal suplementado com fatores de crescimento, proteínas e enzimas para apoiar a adesão e proliferação celular. O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento comum para meios de cultura celular, pois o sangue fetal 1) é rico em fatores de crescimento em comparação com o sangue adulto e 2) apresenta baixo conteúdo de anticorpos8. À medida que a terapia celular progride, há preocupações sobre a segurança das condições clássicas de cultura de células nas quais a SFB é adicionada ao meio de cultura. Além disso, há uma tendência de substituir a SFB por alternativas9. Vários substitutos de FBS têm mostrado resultados promissores10.
A alternativa de plasma rico em plaquetas (PRP) foi selecionada aqui, e desenvolvemos um dispositivo médico para produzir uma preparação padronizada de PRP, denominada CuteCell-PRP. O uso pretendido deste dispositivo é a preparação de PRP autólogo para ser usado como um suplemento de meio de cultura para expansão in vitro de células autólogas sob condições de GMP.
O PRP é definido como uma suspensão concentrada de plaquetas no plasma. Como existem inúmeros protocolos de preparação, que diferem em 1) a quantidade de sangue necessária, 2) os tipos de dispositivos usados e 3) o protocolo de centrifugação, as concentrações plaquetárias resultantes variam de um pouco acima a mais de 10x o valor basal do sangue. Além disso, as preparações de PRP contêm níveis variáveis de contaminação de glóbulos vermelhos e brancos. A terminologia "PRP" é, portanto, usada para descrever produtos que variam muito em sua composição biológica e potenciais efeitos terapêuticos.
Na maioria dos estudos, a substituição da SFB é obtida usando diferentes concentrações de PRP que é ativado (por trombina ou cálcio). Essa ativação artificial provoca uma liberação imediata e importante de fatores de crescimento plaquetário de 15 min até 24 h11. Portanto, acredita-se que a ativação plaquetária seja indesejável para aplicações em culturas celulares, nas quais a liberação lenta de fatores de crescimento a partir da degranulação plaquetária gradual é necessária.
A terapia com PRP envolve a preparação de plaquetas autólogas em plasma concentrado12. A concentração plaquetária ideal não é clara, e uma ampla gama de dispositivos comerciais está disponível para preparar o PRP13. Essa falta de padronização decorre da inconsistência entre os estudos e levou a uma caixa preta em relação à dosagem e ao momento da injeção. Este protocolo descreve um procedimento para obtenção de PRP autólogo usando este dispositivo de PRP dedicado para expandir fibroblastos da pele em um modelo de cultura ex vivo 100% autóloga.

<table><tbody><tr><td>96 poços preto claro fundo plano</td><td>BD Falcon</td><td>353219</td><td>32/caixa</td></tr><tr><td>Traço celular Corante Violeta</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C34557</td><td>180 ensaios</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>3 tubos por pacote</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>de Glutamina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Contador de Hematologia</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>Heparina 5000E Liquemine</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Solução Tampão HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>2x 5 mg por embalagem</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Na Piruvato 1mg/mL</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Faloidina alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A12379</td><td>300 unidades</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Tripsina 1x 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>de tripsina EDTA 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr></tbody></table>

produção de plasma autólogo rico em plaquetas para impulsionar a expansão in vitro de fibroblastos humanos

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Atualmente, há grande interesse clínico no uso de fibroblastos autólogos para reparação cutânea. Na maioria dos casos, a cultura de células da pele in vitro é necessária. No entanto, a cultura celular usando meios de cultura xenogênicos ou alogênicos tem algumas desvantagens (i.e., risco de transmissão de agentes infecciosos ou expansão celular lenta). Aqui, um sistema de cultura autóloga é desenvolvido para a expansão de células de fibroblastos da pele humana in vitro usando o plasma rico em plaquetas (PRP) do próprio paciente. Os fibroblastos dérmicos humanos são isolados do paciente durante a abdominoplastia. As culturas são acompanhadas por até 7 dias usando um meio suplementado com soro fetal bovino (SFB) ou PRP. O conteúdo de células sanguíneas em preparações de PRP, proliferação e diferenciação de fibroblastos são avaliados. Este protocolo descreve o método para obter uma preparação padronizada e não ativada de PRP usando um dispositivo médico dedicado. A preparação requer apenas um dispositivo médico (CuteCell-PRP) e centrífuga. Este dispositivo é adequado sob condições de prática médica suficientes e é um sistema fechado de uma etapa, apirogênico e estéril que requer uma centrifugação única e suave de rotação de 1.500 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, os componentes sanguíneos são separados e o plasma rico em plaquetas é facilmente coletado. Este dispositivo permite uma preparação rápida, consistente e padronizada de PRP que pode ser usado como um suplemento de cultura celular para expansão in vitro de células humanas. O PRP obtido aqui contém uma concentração plaquetária de 1,5 vezes em comparação com o sangue total em conjunto, com uma remoção preferencial de glóbulos vermelhos e brancos. Demonstrou-se que o PRP apresenta um efeito potencializador na proliferação celular em comparação com a SFB (7,7x) e que os fibroblastos são ativados no tratamento com PRP.

Esta tecnologia patenteada é um dispositivo médico simples, rápido e reprodutível usado para produzir preparações padronizadas de PRP. É um sistema de uma etapa, totalmente fechado, que permite a preparação do PRP a partir do sangue total venoso após 5 min de centrifugação a 1.500 x g (devido à tecnologia de gel separador). O PRP obtido após a centrifugação é eliminado dos glóbulos vermelhos e brancos, que ficam abaixo do gel. Após várias inversões tubárias, as plaquetas que estão em cima do gel são ressuspensas...

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Este protocolo é o sistema autólogo para cultura de fibroblastos humanos com plasma rico em plaquetas do próprio paciente e preparo padronizado por cinco minutos. O PRP promove uma expansão celular maciça de fibroblastos em cultura. Eu recomendaria que você use este método usando PRP como um suplemento celular quando você precisa de riacho maciço e expansão celular segura para terapias celulares autólogas.Quando você tenta esse protocolo, eu recomendo que você verifique a integridade do PRP. Seu plasma tem que ser muito limpo com ausência de glóbulos vermelhos. Quando você transfere, você tem que fazê-lo com muito cuidado.E em relação à digestão do seu tecido, ele tem que estar muito limpo antes de prosseguir. Para começar, vire cuidadosamente os tubos de plasma rico em plaquetas cheios de sangue, ou PRP, de cabeça para baixo três vezes para misturar o sangue com anticoagulante. Centrifugar as amostras de sangue a 1500g por cinco minutos em um rotor fixo de 45 graus angulados e equilibrar os tubos.Após a centrifugação, o sangue fracionado tem glóbulos vermelhos e brancos presos sob o gel separador e plaquetas na superfície do gel. Inverter suavemente o tubo de PRP 20 vezes para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático. Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel e que o plasma deve mudar de límpido e transparente para turvo.Recolher a solução de plasma do tubo utilizando um dispositivo de transferência ligado a uma seringa de 10 mililitros. Coloque as amostras de pele em um tubo de polipropileno de 50 mililitros com PBS e agite o tubo suavemente. Se a amostra de pele for relativamente grande, coloque-a na tampa de uma placa de cultura de tecido de 150 centímetros quadrados com o lado epidérmico para baixo.Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS. Quando a remoção de gordura estiver completa, use um bisturi para cortar as amostras de pele em tiras, aproximadamente 0,5 por 1,5 centímetros.Em seguida, adicione cinco mililitros de mistura de colagenase/dispase a um tubo estéril de 15 mililitros. Transfira o tecido cortado para o tubo. Certifique-se de que as peças de tecido estão submersas na solução e tampar o tubo com segurança.Coloque os tubos em uma incubadora a 37 graus Celsius com agitação orbital por 150 minutos. Após a incubação, mova o tubo contendo o tecido para o gabinete de biossegurança. Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 milímetros de cabeça para baixo no armário de biossegurança.Transfira a suspensão de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 milímetros sem respingar. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de um mililitro ou pinça estéril para transferir as peças para o fundo da placa de cultura. Com a epiderme voltada para cima, segure a derme com um par de pinças.Segure a borda da epiderme com outro par de pinças e descasque a derme e a epiderme. Mantendo as peças separadas na mesma tampa, coloque as peças dérmicas em uma nova placa de cultura de 100 milímetros contendo PBS. Em seguida, utilizando pinça de laboratório, transferir as peças dérmicas para um tubo de polipropileno de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS de tripsina 0,3%.Incube o tubo em banho-maria de 37 graus Celsius e misture o conteúdo a cada dois ou três minutos, invertendo o tubo várias vezes. Após 10 a 20 minutos, pare a reação adicionando de três a cinco mililitros de meio de crescimento completo gelado. Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes.Filtre a suspensão, que contém os fibroblastos, através de uma malha de nylon de 85 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a solução de fibroblastos a 150g durante 10 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 a 200 microlitros de meio de crescimento completo para contagem celular.Plaquear as células em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados. Em seguida, incubar o balão a 37 graus Celsius. Troque o meio que contém células não aderentes no dia seguinte e, novamente, a cada três ou quatro dias.Quando os fibroblastos atingirem 70 a 80% de confluência, lave-os com PBS e adicione solução de tripsina-EDTA. Depois de incubar o balão durante três minutos a 37 graus Celsius, pare a reacção adicionando três a cinco mililitros de meio de crescimento completo quente. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 200g por cinco minutos.Remover o sobrenadante por aspiração. Cultivar os fibroblastos em meio PRP e incubar a 37 graus Celsius. A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis por centímetro ao quadrado.Um dispositivo médico dedicado foi usado para produzir PRP através do processamento de sangue total de 10 pacientes diferentes. O dispositivo removeu a maioria dos glóbulos vermelhos e glóbulos brancos. A concentração plaquetária média no PRP foi aproximadamente 50% maior que a concentração plaquetária no sangue total.Fibroblastos autólogos foram cultivados em meio com SFB a 10% ou em meio com concentrações de PRP variando de um a 50% Após sete dias de cultivo, sem alterar o meio, as culturas submetidas a priming com 20% de PRP exibiram maior número de fibroblastos viáveis. O PRP teve efeitos potentes como impulsionador da proliferação até 7,7 vezes em comparação com a SFB. A coloração com faloidina mostrou que a alteração morfológica observada na ativação do PRP estava relacionada à reorganização da F-actina, que é uma assinatura da ativação dos fibroblastos.Uma grande preocupação da rápida expansão celular é o risco de modificação genômica. Para avaliar isso, você pode realizar um ensaio de hibridização genômica comparativa para avaliar a estabilidade genômica de suas células. A principal vantagem dessa técnica é substituir a SFB por um PRP, que é um suplemento biológico autólogo mais potente.Com isso, o pesquisador pode crescer mais células mais rápido sem qualquer adição de uma substância xenogênica. Podemos utilizar esta técnica para outros tipos celulares que necessitem de expansão ex vivo antes da aplicação clínica, por exemplo, queratinócitos ou células-tronco mesenquimais.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Este vídeo demonstra uma técnica para a diferenciação de megacariócitos e a formação de plaquetas. As células-tronco progenitoras hematopoiéticas - isoladas do sangue do cordão umbilical humano - diferenciam-se em megacariócitos maduros na presença de trombopoietina. Os megacariócitos maduros produzem extensões citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dão origem a plaquetas individuais.

Um método in vitro para a diferenciação de megacariócitos e formação de plaquetas

Este vídeo demonstra a preparação de plasma rico em plaquetas (PRP) de alta qualidade por meio da triagem da contagem de plaquetas, coleta e centrifugação de sangue e isolamento de plaquetas. Este PRP é usado em aplicações terapêuticas para regeneração e cicatrização de tecidos.

Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de sangue periférico humano

A Fibrina Rica em Plaquetas Leucocitárias (L-PRF) representa uma preparação aprovada pela FDA de concentrados de plaquetas autólogos que possui arquitetura única de fibrina, plaquetas enriquecidas e fatores de crescimento abundantes. Aqui, apresentamos um protocolo para geração de L-PRF em consultório, bem como avaliamos suas propriedades mecânicas, incluindo testes uniaxiais e testes de resistência à retenção de sutura.

Caracterização de leucócito-rico em plaquetas de fibrina, A Novel Biomaterial

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

O plasma rico em plaquetas (PRP) é usado no tratamento de distúrbios musculoesqueléticos equinos. Diferentes técnicas produzem PRP com concentrações variadas de plaquetas e leucócitos. Este artigo descreve um método para obter PRP a partir de sangue de cavalo.

Um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino

Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.

Recuperação cirúrgica, isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Expansão de humanos anteriores Cruciate células do ligamento derivados para aplicações em engenharia de tecidos

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

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Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

Aprenda a produzir plasma autólogo rico em plaquetas para expandir fibroblastos humanos de forma segura. Este método padronizado promove proliferação celular massiva para terapias autólogas em medicina regenerativa.

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

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