Name: Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a isolar e expandir neuroesferas a partir de nichos neurogênicos de camundongos pós-natais. Este método permite estudar células-tronco neurais, sua proliferação e diferenciação em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos.

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Este trabalho contou com o apoio do IF/01227/2015 e UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através dos Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) e R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) receberam bolsa da FCT. Os autores agradecem aos membros da unidade de bioimagem do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes pela assistência à microscopia.

<ol><li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393(2010).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li>
<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Mouse%2C+Two+Cultures%3A+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+%28CB1R%29+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529(2013).</li>
<li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li>
<li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li>
<li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457(2011).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639(2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li>
<li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+systems%3A+physiological+players+or+in+vitro+entities%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li>
<li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer%27s+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg%28APPswe%2CPSEN1dE9%2985Dbo%2FJ+embryonic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161(2014).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978(2017).</li>
<li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li>
<li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis%2C+Neural+Stem+Cell+Pool%2C+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li>
<li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516(2017).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Sistemas in vitro de NSPCs permitem uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares, que podem ser validados ainda mais in vivo. A NSA é um método muito poderoso para imitar condições fisiológicas devido à sua estrutura tridimensional. Além disso, este sistema de cultura também é tecnicamente mais fácil de cultivar10, em comparação com outros sistemas in vitro, como o sistema de cultura de monocamadas. De fato, com a NSA, é fácil controlar as pistas extrínsecas expostas durante o desenvolvimento celular, seja durante a expansão ou a fase de diferenciação, adicionando quantidades precisas e variáveis de fatores de interesse para a mídia, bem como por cultivar neuroesferas com outros tipos celulares6. Além disso, em comparação com as culturas de monocamada, na ANS, é possível obter uma maior densidade celular a partir de uma pequena quantidade de tecido ou com um pequeno número de células, permitindo a realização de estudos paralelos, reduzindo assim o número de animais1.
A NSA é o método mais comum para isolar e expandir OSCs11,,12,,13, pode ser usado para estimar o número de células precursoras presentes em uma determinada amostra de tecido5 e a freqüência celular precursora entre diferentes condições. No entanto, tanto as neuroesferas quanto as culturas de monocamada não são responsáveis por quiescência NSCs14. Além disso, a ANS possui algumas limitações11,,12,,13 e a freqüência da neurosfera resultante depende de muitos fatores, incluindo os componentes médios, o procedimento de dissecção, o processo de dissociação11,12,13, e a agregação da neuroesfera5. De fato, em uma cultura de alta densidade, as neuroesferas tendem a se agregar. Consequentemente, deve-se ter cuidado ao estimar o número de células precursoras em uma amostra. Para superar as limitações acima, os NSPCs isolados também podem ser expandidos e passados em uma monocamada5,15. É importante ressaltar que o uso da NSA para comparar a freqüência celular precursora entre diferentes condições é muito útil e preciso porque todas essas limitações são implícitas e semelhantes entre todas as condições realizadas no mesmo experimento.
Há passos críticos na cultura da neurosfera que precisam de atenção. Na etapa de colheita cerebral, a remoção completa das meninges e o bom isolamento dos nichos neurogênicos são essenciais para maximizar a pureza e o rendimento dos NSPCs. Durante a dissociação tecidual, devido à atividade proteolítica da tripsina, o uso excessivo de tripsina ou tempos de incubação mais longos podem levar à lse celular. Além disso, o dia da passagem é fundamental para a obtenção de uma população saudável de neuroesferas. A passagem de neuroesferas com diâmetro superior a 200 μm afeta muito a viabilidade, a capacidade proliferativa e diferenciativa dos NSPCs. Importante, mais de 10 ciclos mais longos de passagens, mais de 10 podem aumentar a instabilidade genética6. Além disso, o revestimento com PDL e PLD/laminin para células SVZ e DG, respectivamente, é essencial para garantir uma boa migração celular para fora das neuroesferas sem comprometer o processo de diferenciação. Em termos de análise imunocitoquímica, tempos de incubação mais longos com PFA podem comprometer a coloração mascarando os antígenos e aumentando o fundo.
A NSA é uma poderosa ferramenta para fornecer uma fonte consistente e ilimitada de NSPCs para estudos in vitro de desenvolvimento neural e diferenciação, bem como para fins terapêuticos16,17. De fato, este ensaio pode ser aplicado a modelos genéticos e comportamentais para compreender melhor os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na proliferação e diferenciação do INSS18,19. Este ensaio também é útil para testar diferentes drogas e compostos20,,21,22, bem como para realizar manipulações genéticas19,23 para modular as propriedades do NSC. Além da imunocitoquímica, a reação em cadeia de polimerase reversa e a análise de manchas ocidentais podem ser realizadas para acessar o RNA e a expressão proteica, enquanto estudos eletrofisiológicos e imagens de cálcio podem ser utilizados para avaliar a função dos neurônios recém-nascidos21.

O ensaio da neurosfera (NSA) foi descrito pela primeira vez em 19921,2 e ainda continua sendo uma ferramenta única e poderosa na pesquisa de células-tronco neurais (NSC). O isolamento das CNs das principais regiões neurogênicas tem problemas desafiadores porque os requisitos para manter essas células em condições fisiológicas permanecem pouco compreendidos. Na NSA, as células são cultivadas em um meio quimicamente definido sem soro com a presença de fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF)1,2,3. Células precursoras neurais (tronco e progenitores) são selecionadas usando esses mitogens, uma vez que essas células são EGF e FGF-responsivas entrando em um período de proliferação ativa, enquanto outras células, ou seja, células diferenciadas, morrem4. As células precursoras neurais crescem como neuroesferas, que podem ser então transitadas para expandir ainda mais o pool dessas células5. É importante ressaltar que, uma vez que essas células progenitoras-tronco neurais (NSPCs) são multipotentes, elas são capazes de se diferenciar nos três principais tipos de células do sistema nervoso central (SNC): neurônios, oligodendrócitos e astrócitos5.
A NSA fornece uma fonte renovável de precursores indiferenciados do SNC, que podem ser usados para estudar vários processos, incluindo a proliferação e auto-renovação do NSC, e a diferenciação neuronal e glial, tanto no contexto fisiológico quanto no de doenças. Além disso, estudos in vitro podem ser utilizados para avaliar o grau de especificação intrínseca presente em precursores neurais durante o desenvolvimento, bem como para estudar todo o potencial das células, removendo pistas extrínsecas associadas ao seu ambiente normal6. O modelo da neurosfera é valioso para avaliar os reguladores putativos, uma vez que, mantendo as células em um meio desprovido de soro, as pistas ambientais são fornecidas apenas pelas células circundantes6. Além disso, na NSA, os NSPCs são facilmente expandidos na cultura, a densidade de células por área é alta e a composição heterogênea das neuroesferas tem alguma semelhança com nichos in vivo6. Essas vantagens bem estabelecidas são a razão pela qual essa metodologia tem sido amplamente utilizada por muitos pesquisadores.
O protocolo a seguir descreve em detalhes todos os processos desde o isolamento da população de Nspc pós-natal das duas principais regiões neurogênicas, a zona subventricular (SVZ) e o giro dentato hipocampal (DG), até a expansão dessas células como neuroesferas, bem como a diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrocytes. Por último, diferentes ensaios também são descritos para acessar propriedades de haste e multipotência de NSPCs derivados de SVZ e DG.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X)</td> <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Solução azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>12mm Lamínulas de vidro</td><td>VWR</td><td>631-1577</td><td></td></tr><tr><td>15mL Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285-1G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo de Centrífuga</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Manuel Vieira & C & ordf; (Irm&atilde; o) Sucrs, Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de adesão, Menzel Gl&auml; ser, SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rato para burros IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-coelho para burros IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rato para burros IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rato para burros IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-coelho IgG (H + L)</td> <td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 cabra anti-rato IgG (H + L)</td> <td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-Bromo-2-Desoxiuridina</td><td>Dako</td><td>M0744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD140a (PDGFR&alfa;) (rato)</td> <td>BD Biosciences</td><td>558774</td><td>Diluir na proporção de 1:500.</td></tr><tr><td>Sulfato de Condroitina Anti-Condroitina Proteoglicano NG2 (coelho)</td><td>Merck Milipore</td><td>AB5320</td><td>Diluir na proporção de 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Doublecortin (coelho)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>Diluir na proporção de 1:200.</td></tr><tr>Sistemas <td>sinápticos</td> <td>anti-Doublecortin (frango)</td> <td>326006</td><td>diluir na proporção de 1:500.</td></tr><tr><td>Proteína Ácida Fibrilar Antiglial (coelho)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9269-.2ML</td><td>Diluir na proporção de 1:1000.</td></tr><tr><td>Tecnologia de Sinalização Celular Anti-Mielina Proteína Básica (coelho)</td><td></td> <td>78896S</td><td>Diluir na proporção de 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Nestin (rato)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB353</td><td>Diluir na proporção de 1:200.</td></tr><tr><td>Núcleos Anti-Neuronais (camundongo)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377</td><td>Use 6% BSA em PBS 1X. Diluir na proporção de 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 (coelho)</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Diluir na proporção de 1:500.</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina &beta; 3 (coelho)</td><td>BioLegend</td><td>802001</td><td>Diluir na proporção de 1:200.</td></tr><tr><td>Microscópio de campo amplo Axiovert 200</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sem soro</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500g</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células, Neubauer</td><td>Hirschmann</td><td>8100104</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células CO Incubadora 2</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated 24 Placa de Poços Múltiplos</td><td>Corning</td><td>CLS3524-100EA</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato di-sódico di-hidratado</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Suplemento GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinça Fina</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps #5S Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #7 FST</td><td></td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>ThermoFisher</td><td>53003018</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos</td><td>ThermoFisher</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>Papéis de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Sharp</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gillete Platinum 5 lâminas</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>1399</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000 (1L)</td><td></td></tr><tr><td>Labculture Classe II Gabinete de Segurança Biológica</td><td>ESCO</td><td>2012-65727</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>McILWAIN Helicóptero</td><td>de Tecidos O Laboratório Mickle Engineering CO. LTD.</td><td>MTC/2</td><td>definido para 450 &mu; m</td></tr><tr><td>Micro Espátula - 12 cm</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 0,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo 1,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 2,0 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação Química NeuroCult (Mouse)</td><td>Célula-tronco</td><td>5707</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus SZ51</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, pó</td><td>VWR</td><td>28794.295</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate soluções-padrão, PO43 - em água</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina 100mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Solução de poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>27800.360.5K</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Merck Milipore</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>VWR INCU-Line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e expansão das neuroesferas a partir de nichos neurogênicos de camundongos (p1-3)

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

O ensaio da neuroesfera é uma técnica in vitro extremamente útil para estudar as propriedades inerentes das células-tronco/progenitoras neurais (NSPCs), incluindo proliferação, auto-renovação e multipotência. No cérebro pós-natal e adulto, os NSPCs estão presentes principalmente em dois nichos neurogênicos: a zona subventricular (SVZ) que reveste os ventrículos laterais e a zona subgranular do giro dentato hipocampal (DG). O isolamento dos nichos neurogênicos do cérebro pós-natal permite obter uma maior quantidade de NSPCs na cultura com consequente vantagem de maiores rendimentos. O contato próximo entre as células dentro de cada neuroesfera cria um microambiente que pode se assemelhar a nichos neurogênicos. Aqui, descrevemos, em detalhes, como gerar culturas neurosferas derivadas de SVZ e DG de camundongos de 1-3 dias de idade (P1−3), bem como passaging, para expansão da neurosfera. Esta é uma abordagem vantajosa, uma vez que o ensaio da neurosfera permite uma geração rápida de clones NSPC (6-12 dias) e contribui para uma redução significativa no número de uso animal. Ao emplacar as neuroesferas em condições diferenciais, podemos obter uma pseudomonocamada de células compostas de NSPCs e células diferenciadas de diferentes linhagens neurais (neurônios, astrócitos e oligodendrócitos) permitindo o estudo das ações de fatores intrínsecos ou extrínsecos na proliferação do NSPC, diferenciação, sobrevivência celular e neuritogênese.

As neuroesferas SVZ e DG, obtidas por meio da NSA, são compostas por células indiferenciadas, positivas para Sox2, fator de transcrição envolvido na capacidade de auto-renovação e positiva para a nestin, uma proteína de filamento intermediário expressa em NSPCs(Figura 1A). Além disso, as neuroesferas derivadas do SVZ têm dimensões maiores do que suas contrapartes DG(Figura 1A). É importante ressaltar que, em condições diferenciais, os NSPCs derivados de SVZ e DG migram para fora das neuroesferas formando uma pseudomonocamada de células(Figura 1B).
Para acessar a capacidade de auto-renovação, o ensaio do par celular é realizado com base na expressão de Sox2 e nestin que tende a desaparecer em células divisórias que iniciam o processo de diferenciação com uma combinação de um marcador da linhagem neuronal, ou seja, DCX. Em ambas as regiões neurogênicas, é possível observar a presença de Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- divisões simétricas (auto-renovação) (Figura 2A1,B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCXX +/- divisões assimétricas(Figura 2A1,B2) e Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ divisões simétricas (diferenciação) (Figura 2A2,B1).
A passagem das neuroesferas aumenta o rendimento dos NSPCs; no entanto, a morte celular em DIV2 muda com a passagem. De fato, o percentual de células PI positivas é aumentado com a passagem celular em SVZ (P0: 15,6% ± 1,2% vs P1: 19,2% ± 2,7% vs P2: 32,35% ± 0,14% vs P3: 39,6% ± 4,0%) e em DG (P0: 16,31% ± 0,95% vs P1: 32,1% ± 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% ± 3,1%) (Figura 3).
A neuritogênese pode ser avaliada em neurônios obtidos a partir da diferenciação de NSPCs SVZ e DG no início da diferenciação: DIV1 (Figura 4A,D), DIV2(Figura 4B,E) e DIV3 ( Figura4C,F). De fato, como observado na Figura 4,o comprimento e a ramificação dos neurites aumentam com a diferenciação.
A proliferação celular pode ser avaliada em neuroesferas derivadas de SVZ e DG. Comparando-se as neuroesferas primárias diferenciadas na DIV1 da SVZ (Figura 5A1) e DG (Figura 5A2),o percentual de células BrdU-positivas é maior em SVZ do que em DG (SVZ: 6,15% ± 0,64% vs DG: 3,27% ± 0,13%; p &lt; 0,05; n = 4; Figura 5A3). Além disso, a diferenciação celular também pode ser acessada combinando a coloração de BrdU com um fabricante maduro, como núcleos neuronais (NeuN) que identifica neurônios maduros(Figura 5B1,B2). A Figura 5B3 mostra que o percentual de progenitores que se diferenciam em neurônios maduros é semelhante em SVZ e DG (SVZ: 12,04% ± 1,58% vs DG: 13,56% ± 0,48%; p &gt; 0,05; n = 4).
A haste e a multipotência dos NSPCs derivados de SVZ e DG podem ser acessados usando a NSA avaliando a expressão de diferentes marcadores em diferentes dias de diferenciação (DIV2 e DIV7). De fato, os NSCs (proteína fibriária fibriária de nestin e glial [GFAP]-células duplas positivas) estão presentes em ambas as regiões neurogênicas(Figura 6A,G). Essas células são capazes de se diferenciar em neurônios imaturos (células DCX-positivas) (Figura 6B,H),neurônios maduros (células neun-positivas) ( Figura6F,L), células precursoras oligodendrócitos (antígeno neuron-glial 2 [NG2] e plaquetas derivadas receptor fator de crescimento α [PDGFRα]- células positivas) (Figura 6C,I), oligodendrócitos maduros (proteína básica de mielina [células mbp]-positivas) (Figura 6E,K) e astrócitos (células GFAP-positivas) (Figura 6D,J).
Diferentes substratos podem ser usados para cobrir tampas para formar a pseudomonocamada de células em condições diferenciais. Como mostrado na Figura Suplementar 1,as células DG migram mais quando as tampas têm revestimento extra com lamin combinado com PLO ou PDL do que apenas com PDL(Figura Suplementar 1B-H). De fato, quando pDL e laminin são usados juntos como substratos(Figura Suplementar 1C,G), as células DG formam uma pseudomonocamada mais confluente do que as células SVZ para as quais o PDL é usado sozinho(Figura Suplementar 1A,E).
É importante ressaltar que esses resultados demonstram o potencial da ANS para avaliar as propriedades de haste e multipotência dos CNs derivados dos dois principais nichos neurogênicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figura 1: Zona subventricular e giro dentado derivado nspc cultivado como neuroesferas ou como pseudomonocamadas. (A) Imagens representativas de brightfield(A1,A3) e fluorescência(A2,A4)de neuroesferas derivadas de SVZ e DG, onde os núcleos foram manchados com Hoechst 33342 (azul) e NSCs para Sox2 (verde) e nestin (vermelho). (B) Imagens representativas de pseudomonocamadas geradas a partir de neuroesferas derivadas de SVZ e DG em condições diferenciais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Figura 2: O ensaio do par de células. Imagens representativas de fluorescência de pares celulares derivados de uma divisão celular progenitora. Os núcleos SVZ e DG foram manchados com Hoechst 33342 (azul), células-tronco para Sox2 (vermelho) e nestin (branco), bem como neurônios imaturos com DCX (verde). Pontas de flecha nos painéis A1 e B1 indicam Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- divisões simétricas de auto-renovação, setas nos painéis A1 e B2 indicam que as divisões assimétricas Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+, setas de linha tracejadas nos painéis A2 e B1 mostram sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ divisões de diferenciação simétricas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figura 3: Análise de sobrevivência celular com passaging celular. Análise quantitativa de células PI positivas em DIV2 na cultura da neurosfera diferenciada derivada de SVZ e DG, após 0, 1, 2 e 3 passagens (P0−P3). Os dados são expressos como média ± SEM, n = 1-8. PI = iodeto de propidium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figura 4: Análise de neuritogênese na DIV 1, 2 e 3. Imagens representativas de fluorescência confocal de neurites, identificadas pelo sinal βIII-tubulina, nos neurônios SVZ e DG em (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 e(C,F) DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figura 5: Ensaio de proliferação celular. Imagens confocais representativas de células BrdU-positivas em DIV1 em (A1) SVZ e (A2) DG. (A3) Análise quantitativa de células brdu-positivas em DIV1 na cultura de neurosfera diferenciada derivada de DG e SVZ. Os dados são expressos como média ± SEM, n = 4. *p &lt; 0,05 por t-test. Imagens representativas de fluorescência de células BrdU e NeuN-positivas em DIV7 em (B1) SVZ e (B2) DG. As pontas das flechas indicam células brdU-/NeuN-positivas. (B3) Análise quantitativa de células BrdU-/NeuN-positivas em DIV7 em ambos os nichos. Os dados são expressos como média ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridina, análogo de timmidina sintética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figura 6: Tipos de células neurais presentes na cultura da neurosfera diferenciada derivada de SVZ e DG. Imagens representativas de fluorescência de tipos de células derivadas de SVZ e DG após 2 e 7 dias de diferenciação da neurosfera (DIV2 e DIV7), onde os núcleos celulares foram manchados com Hoechst 33342 (azul) e: (A,G) NSCs para GFAP (verde) e nestin (vermelho),(B,H) imaturos neurônios para DCX (verde), (C,I) células precursoras oligodendrocyte para PDGFRα (verde) e NG2 (vermelho),(D,J) osasócitos para GFAP (verde),(E,K) oligodendrócitos maduros para MBP (verde) e (F,L) neurônios maduros para NeuN (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Figura suplementar 1: Testando diferentes substratos para adesão à neuroesfera e migração para formar uma pseudomonocamada. Imagens representativas de fluorescência de (A,E) pseudomonocamada derivada de SVZ usando poli-d-lisina como um substrato, (B,F) Pseudomonocamada derivada do DG usando poli-D-lisina como substrato, (C,G) pseudomonocamada derivada do DG usando poli-D-lisina com lamina como um substrato, e (D,H) pseudomonocamada derivada do DG usando poli-D-lysine com poli-L-ornitina como um substrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Neste artigo, descrevemos, em detalhes, um protocolo para a geração de culturas neurosferas a partir de células-tronco neurais de camundongos pós-natal derivadas dos principais nichos neurogênicos do rato. As neuroesferas são usadas para identificar células-tronco neurais do tecido cerebral permitindo a estimativa de números de células precursoras. Além disso, essas estruturas 3D podem ser banhadas em condições diferenciais, dando origem a neurônios, oligodendrócitos e astrócitos, permitindo o estudo do destino celular.

Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

O ensaio da neurosfera é útil na técnica in vitro para estudar as propriedades inerentes das células neurais tronco/progenitor, incluindo proliferação, autoconexão e multipotência no contexto fisiológico e patológico. Devido à sua estrutura tridimensional, esta técnica é uma poderosa ferramenta para estudar neurogênese adulta. Também é útil para acultura e obtenção de maiores rendimentos de células-tronco/progenitoras neurais.Este ensaio da neurosfera pode ser aplicado ao estudo de distúrbios cerebrais como Alzheimer e Doenças de Parkinson ou esclerose múltipla. Neuroesferas também podem ser obtidas de outras regiões cerebrais ou sistemas, como tecido adiposo ou intestino. Demonstrando o procedimento com Filipa Ribeiro será Rita Soares, doutoranda do meu grupo.Para colher o dia pós-natal de um a três cérebros de camundongos, segure a parte ventral do corpo na base da cabeça e use uma pequena tesoura pontiaguda para fazer uma incisão midline na pele sobre toda a extensão da cabeça para expor o crânio. Faça uma incisão longitudinal na base do crânio e continue cortando ao longo da sutura sagital em um ângulo raso possível para evitar danificar as estruturas cerebrais. Use fórceps curvos para descascar o crânio para os lados para expor o cérebro e deslizar uma pequena espátula sob o cérebro para cortar os nervos cranianos e vasos sanguíneos que estão conectados à base do cérebro.Coloque o cérebro em uma placa de Petri de HBSS frio suplementado com antibióticos e coloque a placa sob um microscópio dissecando em baixa ampliação. Posicione o cérebro em sua superfície dorsal. Enquanto segura o cérebro pelo cerebelo, use fórceps finos para remover meninges do lado ventral do cérebro e das lâmpadas olfativas.Gire o cérebro para o aspecto ventral e retire o resto das meninges. Em seguida, use os fórceps para remover o cerebelo e use fórceps pontiagudos curvos para transferir o cérebro para um pedaço de papel filtro com um poro de 11 micrômetros em cima de um helicóptero de tecido. Para microdisseção SVZ e DG, comece cortando o cérebro em seções coronais de 450 micrômetros.Use uma lâmina molhada para coletar o cérebro seccionado em uma nova placa de Petri cheia de HBSS suplementado com antibiótico frio sob um microscópio dissecando e use fórceps para separar fatias coronais de forma anterior a posterior até que as fatias com os ventrículos laterais sejam alcançadas. Use fórceps finos para cortar a fina camada dos tecidos ao redor da parede lateral dos ventrículos, excluindo o parenchyma estrital e o caloso corpus e coloque uma ponta dos fórceps imediatamente sob o caloso corpus e a outra no tecido imediatamente adjacente à área ventral do ventrículo lateral para isolar o SVZ. Corte uma pequena linha de tecidos ao redor do ventrículo lateral e colete o tecido dissecado em um tubo de amostra contendo solução hbss suplementada.Quando todas as fatias tiverem sido microdissectadas com fórceps e formação hipocampal foi atingida, descarte a primeira fatia com hipocampo em que o DG ainda é irreconhecível. Para remover o DG, primeiro isole o hipocampo das fatias e refoque o microscópio para visualizar as bordas ao redor do DG. Para colher o DG, utilize fórceps para fazer um corte entre a região de DG e CA1 seguido de um corte vertical entre a região do DG e CA3. Em seguida, remova a fimbria e qualquer tecido adjacente e coloque o tecido colhido em tubo separado de solução HBSS suplementada com antibióticos.Para dissociar as amostras de SVZ e DG, adicione Trypsin-EDTA 0,05% a uma concentração final de 5-10% de Trypsin-EDTA 0,05% em HBSS a cada tubo para uma incubação de aproximadamente 50 minutos a 37 graus Celsius. Todo o uso de trippsina ou tempo de incubação muito longo pode levar ao aumento da morte celular, impactando negativamente o crescimento celular. Quando o tecido se agrupar, substitua a solução enzimática por quatro lavagens consecutivas por um mililitro de HBSS fresco suplementado por lavagem.Após a última lavagem, resuspenda os tecidos digeridos em um mililitro de meio livre de soro suplementado com 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico e cinco nanogramas por mililitro de fator de crescimento do fibroblasto básico por tubo. Em seguida, dissociar mecanicamente os tecidos com tubos suaves de sete a dez vezes com um tubo P1000 até que uma solução celular homogênea tenha sido obtida. Para determinar a densidade da célula DG ou SVG dissociada, conte as células em cada suspensão em um hematócito.Para expandir as células em neuroesferas, diluir as populações celulares individuais em duas vezes dez para as quatro células por densidade mililitro em meio livre de soro complementado com fatores de crescimento e sementes cinco mililitros da suspensão celular em placas de Petri de 60 milímetros de diâmetro não revestidas. Em seguida, incubar as células SVZ por seis a oito dias e as células DG por 10 a 12 dias a 37 graus Celsius para formação da neurosfera primária. Quando a maioria das neurosferas tem de 150 a 200 micrômetros de diâmetro, colhe a suspensão celular das culturas e coleta as neuroferas por centrifugação.Resuspenque a palete neurofera com um kit de dissociação química do rato de acordo com as instruções do fabricante antes de coletar as células com outra centrifugação. Substitua o supernasal por um mililitro de meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento e tente suavemente classificar a pelota cerca de 10 vezes. Conte as células neurológicas dissociadas como demonstrado e reseed as células em duas vezes 10 para as quatro células por densidade mililitro em meio livre de soro complementado com fatores de crescimento em novas placas de Petri de 60 mililitros.Em seguida, devolva a célula à incubadora de cultura celular por mais seis a oito ou 10 a 12 dias, conforme apropriado para obter neuroesferas secundárias. As neuroesferas SVG e DG obtidas pelo uso do ensaio da neurosfera são compostas de células positivas e nestinas positivas. Notavelmente, as neurosferas derivadas do SVG têm dimensões maiores do que suas contrapartes DG.É importante ressaltar que, sob condições de diferenciação, as células tronco/progenitora neural derivadas do SVG e DG migram para fora das neurosferas, formando um pseudomonolar de células. Em ambas as regiões neurogênicas, é possível observar a presença de Sox2 duplo positivo, nestin duplo positivo, duplacortina duplamente negativa pares de células correspondentes a divisões simétricas indicativas de auto-renovação. Pares celulares em que uma célula de Sox2 positivo, nestin positivo, e doublecortin negativo, e a outra célula Sox2 negativo, nestin negativo, e doublecortin positivo demonstrando divisões assimétricas.E Sox2 duplo negativo, nestin duplo negativo, e duplacortina duplas pares de células positivas correspondentes a divisões simétricas indicativos de diferenciação. No geral, a aprovação altera a taxa de mortalidade celular no segundo dia in vitro. A neuritogênese pode ser avaliada em neurônios obtidos a partir da diferenciação das células-tronco/progenitoras neurais SVG e DG no início da diferenciação.Como observado, o comprimento e ramificação dos neurites aumenta com diferenciação. Uma alta porcentagem de células proliferativas é observada em SVG em comparação com dG. Embora a porcentagem de progenitores proliferadores que se diferenciam em neurônios maduros seja semelhante em ambos os nichos neurogênicos. Ambos os tipos de células também são capazes de se diferenciar em neurônios imaturos, nêutrons maduros, células precursoras de oligodendrocytes, oligodendrocitos maduros e astrócitos.Após a obtenção das neuroesferas, vários métodos, incluindo imunocitoquímica, imagem de cálcio, manchas ocidentais e RT-PCR podem ser realizados para estudar a hasteza e a multipotência das células tronco/progenitores neurais. O ensaio da neurosfera pode ser aplicado a modelos genéticos e de doenças para avaliar melhor os processos moleculares e celulares envolvidos tanto na proliferação quanto na diferenciação de células tronco/progenitores neurais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Aprenda a isolar e expandir neuroesferas a partir de nichos neurogênicos de camundongos pós-natais. Este método permite estudar células-tronco neurais, sua proliferação e diferenciação em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos.

Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

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