Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

A plataforma Presto-Tango foi concebida para executar o interrogatório paralelo e simultâneo de todos os GPCRs não olfativos no genoma humano, incluindo aqueles alvos órfãos para traçar o perfil de beta-detenção induzido por ligante no recrutamento 2. A plataforma Presto-Tango é o único recurso de código aberto para traçar o perfil de todo o genoma do GPCR em uma abordagem paralela, usando um ensaio de recrutamento de beta-arrestin independente de proteína G. Demonstrando que o processador seria Genevieve Laroche, uma pesquisadora associada no meu laboratório, e Manel Zighal, um doutorando no meu laboratório.

Antes de iniciar o procedimento adicione 20 microlitadores de uma solução de 25 microgramas por mililitro de poli-L-lysina a cada poço do número experimental apropriado de 384 placas de fundo óptico e incubar as placas em temperatura ambiente por 30 minutos a duas horas. No final da incubação, passe as placas sobre a pia para remover o excesso de poli-L-lysine e adicione 40 microliters de solução antimíctica antimíctica antibiótico para cada poço. Em seguida, incubar as placas necessárias para semeadura celular a 37 graus Celsius e colocar o resto das placas a quatro graus Celsius para armazenamento a longo prazo.

Para as células HTLA sementes para triagem primária, enxágue suavemente culturas celulares confluentes de 150 milímetros com 10 mililitros de PBS antes de tratar as culturas com seis mililitros de 0,05% de trippsina EDTA por prato. Quando as células possuem piscina separada as suspensões celulares em um tubo cônico de 50 mililitros contendo um volume igual de DMEM. E coletar as células por centrifugação.

Suspenda a pelota em 2,2 vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração de DMEM e pise as placas sobre a pia para remover a solução antimíctica antimíctica antimíctica antibiótico. Toque nas placas para secar e semear 45 microliters de células em cada poço. Em seguida, coloque as placas a 37 graus Celsius e 45% de dióxido de carbono durante a noite.

Para preparar a placa de origem de DNA 384 para transfecção distribua 50 nanogramas por mililitro de cada DNA plasmídeo de cortesia codificando a construção gprc tango de interesse em 0,1X Tris-EDTA por poço em cada poço de uma placa de poço 96. Use uma pipeta multicanal para transferir manualmente 10 microliters de solução de DNA de cada poço da placa de poço 96 para poços individuais de uma placa de 384 bem de DNA em quadruplicar para cada condição como ilustrado. Em seguida, transfira 40 microlitadores de uma solução de cloreto de cálcio molar de 0,313 para cada poço da placa de origem do DNA e misture suavemente o conteúdo de cada poço.

Adicione 50 microliters de 2x tampão HEPES a cada poço da placa de origem de DNA 384 bem com mistura suave. Após um minuto, transfira 10 microlitadores da mistura de transfecção de DNA da placa de 384 bem-fonte de DNA para cada poço de células HTLA semeadas e incubar as células da incubadora de cultura celular durante a noite. No dia seguinte, decantar o meio celular transfectado e lentamente adicionar 40 microliters de meio faminto a cada poço, tomando cuidado para não tocar diretamente nas células.

Em seguida, adicione 20 microliters do tampão do veículo para as linhas alternadas sem composto em 20 microliters do composto de juros em uma concentração de três vezes nas linhas alternadas, antes de devolver a placa à incubadora de cultura celular. 16 a 24 horas após a estimulação decantar o meio celular transfectado e adicionar 20 microliters de reagente de brilho recém-preparado a cada poço para uma incubação de cinco a 20 minutos à temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, leia as placas em um balcão de luminescência de microplaca com um tempo de integração de um segundo por poço.

Para uma triagem secundária, subcultura as células HTLA em pratos de 100 milímetros a cinco vezes 10 para as seis células densidade total celular em 11 milímetros de meio completo por prato por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, misturou 10 microgramas de DNA gratuito GPCR com 500 microliters de solução de cloreto de cálcio Tris-EDTA com vórtice seguido pela adição de 500 microliters de tampão HEPES. Após um tremor vigoroso, incubar a solução por um minuto à temperatura ambiente e adicionar imediatamente um mililitro da solução cair sábio nas células.

Balance suavemente para distribuir uniformemente o precipitado e coloque a placa a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, verifique a eficiência da transfecção sob um imager celular fluorescente. Transações superiores a 50% de cobertura são ideais.

Enxágue suavemente as células transfeinadas com solução de verseno antes de desprender as células com três mililitros de 0,05% de trippsina EDTA. Colete as células dissociadas por centrifugação e suspenda a pelota em quatro vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média faminta. Em seguida, semente 45 microliters de células em cada poço de uma placa de poço codificada 384 poli-L e colocar a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos quatro horas.

Para preparar uma placa de resposta de meia dose de log- curva adicionar 270 microliters de HBSS complementados com HEPES e antibiótico antimíctico para todos, exceto a última linha de uma placa de 96 poços e adicionar 30 microliters de cada solução de drogas alta e baixa para os poços da linha H.Transfira a solução de cada poço de linha H para o poço correspondente da linha G com mistura e continue a diluir serialmente os compostos compostos até a última linha da placa é alcançado. Utilizando o esquema como referência, misture 20 microlitadores das diluições da coluna baixa das linhas A a G da placa de 96 poços e 20 microliters das diluições da coluna alta aos poços B a H da placa de 96 poços até a placa de poço 384 anteriormente sentada. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por um mínimo de 16 horas.

16 a 24 horas após a estimulação decantar o meio celular transfectado e adicionar 20 microliters de reagente de brilho a cada poço para uma incubação de cinco a 20 minutos antes de ler as placas em um balcão de luminescência de micro placa com um tempo de integração de um segundo por poço. Neste experimento representativo, dos 168 GPCRs que foram interrogados na triagem primária, apenas o receptor de dopamina D3 e o opsin 5 eram candidatos como alvos ativos potenciais. O receptor de dopamina D3 produziu uma alteração significativa de 4,7 vezes, enquanto a opsina 5 produziu uma resposta ligeiramente menor de 2,39.

Em comparação, o receptor de dopamina D2, o controle positivo para a tela primária produziu uma alteração de 4,58 de 2008. Essas curvas de resposta da triagem secundária demonstraram que o extrato de grânulo de cromatina produz janelas de sinal semelhantes em valores de concentração efetivas semi-máximas para quinpirole confirmando sua validade como um golpe ativo no receptor de dopamina D3. Uma curva de dose plana semelhante ao controle negativo foi produzida para opsina 5, porém descartando este receptor como um possível alvo para o extrato do grânulo de cromatina. Presto-Tango requer cuidados especiais, pois variabilidades na distribuição celular, eficiência de transfecção e diluições de drogas seriais podem resultar em erro composto, o que pode afetar a precisão dos dados.

Métodos ortogonais como abordagens de radioligand vinculante, Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência e ensaios funcionais de cálcio e internalização Cíclico AMP podem ser usados para confirmar e caracterizar ainda mais as interações entre ligas e receptores.