Name: Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a entrega de mRNA modificado para transferência gênica cardíaca em modelo de infarto do miocárdio em camundongos. Este protocolo padronizado permite a expressão transiente de genes de interesse no coração.

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Os autores reconhecem Ann Anu Kurian por sua ajuda com este manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de iniciação em cardiologia concedida ao laboratório Zangi e também pela concessão do NIH R01 HL142768-01

Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no Comitê de Cuidados Institucionais e De Uso do Monte Sinai.
1. Síntese de modRNA
NOTA: Os detalhes da síntese modRNA podem ser encontrados em Kondrat et al.13.
<ol><li>Peça os modelos plasmídeos(Tabela de Materiais)e gere um produto PCR limpo para usar como modelo mRNA.</li>
	<li>Prepare os modRNAs por transcrição in vitro com uma mistura de ribonucleosídeo personalizada do seguinte(Tabela de Materiais): Kit de transcrição T7, 6 mM anti-reverso analógico (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, Triphosfato de guanosina de 75 mM, triphosfato de adenosina de 75 mM, triptosfato de citidina de 75 mM, pseudouridina de 100 mM-5-triphosfato e enzima T7 DNase.</li>
	<li>Purifique o modRNA feito na etapa 1.2 com um kit de limpeza de transcrição(Tabela de Materiais) e trate com fosfattase antártica. Em seguida, reaproveque o modRNA com o kit de limpeza de transcrição e quantifique-o usando um espectrômetro.</li>
	<li>Precipitar o modRNA com etanol e acetato de amônio e resuspend em 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA.</li>
	<li>Concentre o modRNA para entrega in vivo por filtros centrífugos e meça a qualidade utilizando uma plataforma automatizada de eletroforese(Tabela de Materiais).</li>
</ol>2. Preparação da injeção de modRNA para entrega in vivo
<ol><li>Calcule o volume necessário para 100 μg de injeção de luciferase (Luc)/Cre modRNA com base na concentração de modRNA.</li>
	<li>Misture o volume calculado de modRNA com partes iguais da solução de sacarose preparada em água livre de nuclease (0,3 g/mL) e solução de citrato de 0,1 M (pH = 7) (20 μL cada recomendado).</li>
	<li>Leve o volume final da injeção para 60 μL adicionando solução salina.</li>
</ol>3. Cirurgia de infarto do miocárdio
<ol><li>Anestesia e preparação do animal NOTA: Este estudo utiliza camundongos CFW masculinos e femininos de 8 a 12 semanas de idade.<ol>
<li>Anestesiar o rato com 2% de isoflurane usando uma câmara de indução e colocar o animal de costas em uma posição dorsal com uma máscara facial sobre o nariz e a boca para manter a anestesia. Mantenha a anestesia por ventilação mecânica usando um respirador equipado com um tubo de 7-8 mm das vias aéreas e um filtro.</li>
		<li>Para imobilizar o rato na plataforma de cirurgia, proteja seus membros com fita cirúrgica. raspar a área do pescoço e o lado esquerdo da caixa torácica e desinfetar usando 70% de etanol e iodo povidone. Repita o passo de desinfetante duas vezes. Verifique seus reflexos, beliscando a cauda e os pés traseiros para avaliar a profundidade da anestesia.</li>
		<li>Monitore e mantenha continuamente a temperatura do núcleo do corpo na normotermia (37,5-38 °C).</li>
		<li>Mantenha uma via aérea aberta realizando intubação intratraqueal. Para isso, coloque o rato em uma posição ventral com a boca voltada para o experimentador e puxe suavemente a língua. Ajuste o ângulo do pescoço e endireitar o caminho da intubação e empurre na cânula de intubação.</li>
		<li>Caso o animal não consiga respirar através dele, a traqueostomia pode ser realizada. Realize uma incisão cervical ao longo da linha média isolando a pele, músculo e tecido delineando a traqueia usando um microscópio. Quando a traqueia estiver claramente visível, insira o tubo endotraqueal no tecido entre dois anéis de cartucho abaixo do glottis fazendo um pequeno furo e segurando a parte craniana da traqueia usando fórceps microcirúrgicos.</li>
		<li>Observe o movimento torácico do camundongo para verificar se ambos os pulmões estão recebendo oxigênio. A taxa respiratória (RR) deve ser de aproximadamente 120 respirações por minuto, com uma pressão inspiratória de 17-18 cm H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligação da artéria descendente anterior (LAD) esquerda<ol>
<li>Para realizar a ligadura LAD, gire o mouse cuidadosamente para que ele esteja deitado no lado direito. Levante a pele e realize uma toracotomia lateral esquerda entre a 3ª e a 4ª costela e dissecar o tecido e o músculo cuidadosamente. Use um cautery para evitar sangramento.</li>
		<li>Abra o tórax cuidadosamente e uma vez aberto, encontre o coração, sem tocar no pulmão com qualquer objeto afiado. Coloque os retratores na incisão para manter a cavidade torácica aberta e ter uma visão clara do coração. Agora mova os pulmões para a borda da incisão e remova a parte do saco pericárdico que está cobrindo o coração para acessar a superfície anterior do coração.</li>
		<li>Identifique cuidadosamente o LAD, que pode ser visto como um vaso vermelho de luz profunda localizado entre a artéria pulmonar e a aurícula esquerda. Ligate o LAD proximal com uma única sutura de uma sutura de seda 7-0. Coloque um tubo torácico (28 G, cateter venal), entre a 4ª e a 5ª costela.</li>
		<li>Feche a incisão torácica em camadas. Use as suturas de seda 6-0 para adaptar as costelas e use suturas de seda 5-0 para fechar a pele. Certifique-se de deixar uma janela adequada para futura medição ecocardiográfica.</li>
		<li>Escorra cuidadosamente o tórax com solução isotônica quente (9 g de cloreto de sódio em 1 L de água) usando uma seringa de 2 mL. Coloque o rato de costas. Se realizar a traqueostomia, tire o tubo endotraqueal e use suturas de seda 7-0, adapte os anéis do cartucho traqueal com um único ponto. Coloque a máscara facial no mouse e feche a pele usando suturas de seda 5-0.</li>
		<li>Para a fase de recuperação, desconecte a cânula de intubação do ventilador e permita a respiração espontânea. Coloque o animal sob uma lâmpada de calor até atingir a consciência. Não deixe o animal sozinho após a cirurgia até que esteja totalmente acordado.</li>
		<li>Gerencie a terapia da dor com buprenofina a 0,1 mg/kg de peso corporal, injetada subcutânea pelos próximos 3 dias em intervalos de 12h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Parto cardíaco de modRNA
<ol><li>Entregue um total de 60 μL do modRNA preparado na etapa 2.3 intramuscularmente (IM) usando uma seringa de insulina (31 G) seguindo um MI.<ol>
<li>Injete 20 μL do modRNA em três locais diferentes do músculo cardíaco ao redor da área de infarto (dois em ambos os lados da ligadura e um no ápice). Faça as injeções imediatamente após o LAD, antes de fechar o peito. NOTA: Imagens representativas de locais de injeção de modRNA podem ser vistas na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validação da expressão proteica no coração pós MI
<ol><li>Expressão de modRNA de luciferase usando um sistema de imagem de bioluminescência NOTA: Um total de 100 μg de Luc mRNA preparado em 60 μL do tampão citrato de sacarose é diretamente injetado no coração dos camundongos CFW após o MI.<ol>
<li>A 24 h pós MI e injeção de modRNA, anestesia os camundongos com 2% de isoflurane usando uma câmara de indução e injeção intraperitoneal de luciferina (150 mg/g de peso corporal) para validar o sinal Luc in vivo.</li>
		<li>Imagem dos ratos usando um sistema de imagem de bioluminescência a cada 2 minutos até que o sinal luc atinja a saturação.</li>
		<li>Quantifique os dados de imagem coletados com o software de análise de imagens. Use os camundongos injetados com soro fisiológico apenas como uma leitura de linha de base para a expressão de Luc e subtraia o sinal de fundo coletado dos camundongos injetados por soro fisiológico. NOTA: O sinal de Luc é expresso em p/s/cm2/sr x 106.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imunostaining para validação de transfecção de Cre<ol>
<li>Para validar a transfecção com Cre, sacrifique os animais 24h após a injeção usando uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina seguida de luxação cervical. Antes de fazer uma incisão, desinfete o peito e o abdômen usando um cotonete de álcool de 70%.</li>
		<li>Abra a cavidade torácica fazendo uma incisão transversal ~1 cm mais baixa que o esterno e mova a tesoura em direção à cabeça, cortando a caixa torácica.</li>
		<li>Abra o peito e injete 1 mL de PBS estéril na câmara ventricular direita para remover o excesso de sangue. Extirja o coração imediatamente e coloque-o no PBS estéril para lavar o sangue restante.</li>
		<li>Fixar o coração em 4% de paraformaldeído (PFA) por 24 h, seguido de incubação durante a noite em solução de sacarose de 30% a 4 °C. No dia seguinte, incorpore os corações em meio de temperatura de corte ideal e selá-los a uma espessura de 10 μm usando um criostat.</li>
		<li>Manche as seções com anticorpos primários contra troponina cardíaca I (cTNI) e rotule-as com um anticorpo secundário fluorescente. Para identificar o núcleo, colora com 4',6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) por 5 min. Imagem os slides usando um microscópio fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análise estatística
<ol><li>Plote um gráfico de barras com base na expressão luc em camundongos salinos e injetados por Luc e informe os valores como média ± SEM. Compare os dois grupos usando um teste t não pago (***p < 0,0001).</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A terapia genética tem mostrado um enorme potencial para avançar significativamente no tratamento de doenças cardíacas. No entanto, as ferramentas tradicionais empregadas nos ensaios clínicos iniciais para o tratamento de HF têm mostrado sucesso limitado e estão associadas a efeitos colaterais graves. O RNA modificado apresenta uma entrega genética não-viral que está continuamente ganhando popularidade como uma ferramenta de transferência genética no coração. ModRNA não requer localização nuclear de genes para tradução, ...

A terapia genética é uma poderosa ferramenta que envolve a entrega de ácidos nucleicos para o tratamento, cura ou prevenção de doenças humanas. Apesar do progresso nas abordagens diagnósticas e terapêuticas para doenças cardíacas, houve sucesso limitado na entrega de genes no infarto do miocárdio (MI) e insuficiência cardíaca (HF). Por mais simples que o processo de terapia genética pareça, é uma abordagem marcadamente complexa considerando os muitos fatores que precisam ser otimizados antes de empregar um determinado veículo de entrega. O vetor de parto correto deve ser não-imunogênico, eficiente e estável dentro do corpo humano. Os esforços nesse campo geraram dois tipos de sistemas de entrega: viral ou não viral. Os sistemas virais amplamente utilizados, incluindo transferência de genes por adenovírus, retrovírus, lentivírus ou vírus associado ao adeno, mostraram uma capacidade de transdução excepcional. No entanto, seu uso em clínicas é limitado devido à forte resposta imune induzida1, risco de tumorigênese2, ou a presença de anticorpos neutralizantes3, todos os quais permanecem um grande obstáculo para a aplicação ampla e eficaz de vetores virais na terapia genética humana. Por outro lado, apesar de seu impressionante padrão de expressão, a entrega de DNA plasmídeo nu exibe uma baixa eficiência de transfecção, enquanto a transferência de mRNA apresenta alta imunogenicidade e suscetibilidade à degradação pelo RNase4.
Com a extensa pesquisa no campo do mRNA, o modRNA tornou-se uma ferramenta atraente para a entrega de genes ao coração e a vários outros órgãos devido às suas inúmeras vantagens sobre os vetores tradicionais5. A substituição completa do urido por pseudouridina de ocorrência natural resulta em expressão proteica mais robusta e transitória, com indução mínima de resposta imune inata e risco de integração genômica6. Protocolos recentemente estabelecidos utilizam uma quantidade otimizada de analógico de tampa antiverré (ARCA) que aumenta ainda mais a tradução proteica aumentando a estabilidade e transabilidade do mRNA7sintético .
Relatórios anteriores mostraram a expressão de vários genes repórteres ou funcionais entregues por modRNA no miocárdio roedor após MI. Com aplicações de modRNA, áreas significativas do miocárdio, incluindo tanto cardiomiócitos quanto nãocardiomiócitos, foram transfectadas com sucesso lesão pós-cardíaca8 para induzir angiogênese9,,10, sobrevivência de células cardíacas11e proliferação de cardiomiócitos12. Uma única administração de modRNA codificada para follistatina humana mutada 1 induz a proliferação de CMs adultos de camundongos e aumenta significativamente a função cardíaca, diminui o tamanho da cicatriz e aumenta a densidade capilar 4 semanas após o MI12. Um estudo mais recente relatou melhora da função cardíaca após o MI com a aplicação de modRNA VEGFA em um modelo de suíno10.
Assim, com o aumento da popularidade do modRNA no campo cardíaco, é essencial desenvolver e otimizar um protocolo para a entrega de modRNA ao coração pós-MI. Aqui é um protocolo que descreve a preparação e a entrega de modRNA purificado e otimizado em uma formulação citrato-salina biocompatível que fornece expressão proteica robusta e estável sem estimular qualquer resposta imune. O método mostrado neste protocolo e vídeo demonstra o procedimento cirúrgico padrão de um MI de camundongos por ligadura permanente da artéria descendente anterior esquerda (LAD), seguido por três injeções intracardiac de local de modRNA. O objetivo deste artigo é definir claramente um método altamente preciso e reprodutível de entrega de modRNA ao miocárdio murine para tornar a aplicação de modRNA amplamente acessível para terapia genética cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de adenosina</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>incluído no kit Megascript</td></tr><tr><td>Fosfatase Antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>Análogo de tampa anti-reversa, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem bioluminescense</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 sistema de imagem de dispositivo acoplado a carga</td></tr><tr><td>Afastadores rombos</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Tropnina cardíaca I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de citidina</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Incluído no kit Megascript</td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia Dupla</td><td>Aparelho Harvard</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps- Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps- Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de guanosina</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Incluído no kit Megascript</td></tr><tr><td>Kit de transcrição in vitro</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 Kit</td></tr><tr><td>Cânula de intubação</td><td>Aparelho Harvard Kit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear Life</td><td>Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de rato</td><td>Harvard Aparelho</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-metilpseudouridina-5-trifosfato</td><td>Espectrômetro NanoDrop TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de agulha Olsen hegar com tesoura de sutura</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Modelos de plasmídeo</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação de ponta afiada</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNase enzima</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Incluído no kit Megascript</td></tr><tr><td>Estação de</td> <td>fitaKit</td> de limpeza de transcrição Aligent <td>4200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 filtros centrífugos 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de mrna modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental. Na última década, a terapia genética tornou-se uma opção promissora de tratamento para doenças cardíacas, devido à sua eficiência e efeitos terapêuticos excepcionais. Em um esforço para reparar o tecido danificado pós-MI, vários estudos têm empregado terapia genética baseada em DNA ou viral, mas enfrentaram obstáculos consideráveis devido à expressão pobre e descontrolada dos genes entregues, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. O mRNA modificado sintético (modRNA) apresenta uma nova abordagem de terapia genética que oferece alta, transitória, segura, não imunomunogênica e entrega mRNA controlada ao tecido cardíaco sem qualquer risco de integração genômica. Devido a essas características notáveis combinadas com sua farmacocinética em forma de sino no coração, o modRNA tornou-se uma abordagem atraente para o tratamento de doenças cardíacas. No entanto, para aumentar sua eficácia in vivo, um método de entrega consistente e confiável precisa ser seguido. Assim, para maximizar a eficiência de entrega do modRNA e a consistência de rendimento no uso de modRNA para aplicações in vivo, é apresentado um método otimizado de preparação e entrega de injeção intracardiac modRNA em um modelo MI de mouse. Este protocolo tornará a entrega de modRNA mais acessível para pesquisas básicas e translacionais.

Camundongos de oito a dez semanas foram anestesiados com isoflurano e entubados. Após o animal estar sob anestesia, a região torácica esquerda foi raspada e esterilizada com etanol, e o coração foi exposto para ligadura LAD. A artéria coronária esquerda foi ocluída por amarrar firmemente a sutura sob a artéria (representação diagrama Figura 1A). Após um infarto bem sucedido (indicado pela paling da parede livre ventricular esquerda), uma injeção direta de 100 μg de Luc ou Cre modRNA dissolvi...

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

RNA modificado é um novo método para transferência de genes para o coração, e outros órgãos. Este protocolo fornecerá uma abordagem precisa de entregar genes desejados transitoriamente ao coração, após infarto do miocárdio. Este método não se limita ao infarto do miocárdio, mas também pode ser aplicado à reperfusão de isquemia e modelos de constrição aórtica transversal.O RNA modificado está sendo usado em vários ensaios clínicos em humanos. No entanto, não há um protocolo padronizado para gene transferido para o coração usando este método. A demonstração visual permitirá que os pesquisadores injetem corretamente o RNA modificado em locais apropriados do coração.Demonstrando o procedule estarão Ajit Magadum, pós-doutorando, e Elena Chepurko, supervisora de animais do nosso laboratório. Com base na concentração do previamente preparado no modRNA, calcule o volume de modRNA necessário para uma injeção de 100 microgramas. Faz volumes iguais de sacarose e soluções de citrato.Em seguida, adicione o volume calculado de modRNA, e solução salina suficiente para trazer o volume de injeção para 60 microliters. Depois de anestesiar o animal, coloque-o de lado ventral para cima, com a boca vol

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

O procedimento cirúrgico utilizado para induzir o enfarte do miocárdio experimental em ratos começa com toracotomia esquerda entre a terceira e quarta das nervuras, a fim de visualizar a superfície anterior do coração e do pulmão esquerdo. A artéria coronária esquerda é ligada, a caixa é fechada e o rato é deixado a recuperar-se espontaneamente.

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Um modelo altamente reprodutível para infarto do miocárdio em camundongos com manipulações minimamente invasivas é descrito. O modelo pode ser facilmente executado, resultando em alta reprodutibilidade e taxa de sobrevida. Assim, o modelo descrito reduzirá o número de animais necessários conforme solicitado pelo princípio 3R (Substituição, Refinamento e Redução).

Minimal procedimento cirúrgico invasivo de induzir Infarto do Miocárdio em Ratos

Nisto nós descrevemos um procedimento cirúrgico que mostra como conseguir a ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerdo-anterior nos ratos. Este modelo é de grande relevância para investigar a fisiopatologia do infarto do miocárdio e os processos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Este artigo demonstra um modelo para estudar o remodelamento cardíaco após o cryoinjúria miocárdico nos ratos.

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

Sob anestesia adequada, o coração de camundongo foi exteriorizado através do espaço intercostal, e o infarto do miocárdio foi induzido com sucesso pela ligadura da artéria descendente anterior (DA) usando materiais prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios.

Um Método Simples Modificado para Indução de Infarto do Miocárdio em Camundongos

Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Apresenta-se aqui um procedimento cirúrgico para ligadura permanente da artéria coronária esquerda em camundongos. Este modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia e a resposta inflamatória associada após o infarto do miocárdio.

Laqueadura da Artéria Coronária Esquerda: Um Modelo Murino Cirúrgico de Infarto do Miocárdio

Aprenda a entrega de mRNA modificado para transferência gênica cardíaca em modelo de infarto do miocárdio em camundongos. Este protocolo padronizado permite a expressão transiente de genes de interesse no coração.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

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