Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Este protocolo de parafinização seguido de recuperação de antígeno de seções aórticas incorporadas à parafina pode ser uma ferramenta útil para estudar o papel das armadilhas tricelulares neutrófilas na trombose felina. A detecção de armadilhas tricelulares neutrófilas por imunofluorescência em tecido fixo e incorporado à parafina, é superior aos stents histológicos convencionais como o HNE, pois permite a detecção simultânea de DNA mais seguro e proteínas extracelulares. Este protocolo pode ser usado em outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias.

A identificação de armadilhas extracelulares de neutrófilos dentro do trombo arterial felino sugerem que eles podem desempenhar um papel na trombose em gatos. Protocolos apresentados aqui são diretrizes. Encorajamos fortemente os investigadores a ajustar a duração e as condições do processo de recuperação de antígenos para produzir um sinal satisfatório.

Para usar um sistema automatizado para realizar a desparafinação e a re-hidratação das seções em lâminas de vidro, coloque os slides de vidro em racks. Submergir completamente em 100% salino por três minutos. Repita este passo duas vezes.

Não enxágue entre as etapas. Submergir completamente na diminuição das concentrações de etanol à temperatura ambiente três vezes por três minutos cada. Submerse completamente em água desionizada por dois minutos e repita mais uma vez.

Após o tratamento com TBST, encha o reservatório com água deionizada aquecida a 100 graus Celsius. Deixe a câmara de vapor equilibrar por 20 minutos. Em uma placa de calor, aqueça a solução de recuperação de antígeno comercialmente disponível contendo Tris e EDTA em pH 9,0 a 95 a 97 graus Celsius.

Certifique-se de que não ferva. Suberge completamente os slides na solução de recuperação de antígenos aquecidos e continue a aplicação de aquecimento externo através do vapor por 20 minutos. Em seguida, lave os slides três vezes com TBST por cinco minutos.

Agora, coloque as seções no bloqueio do buffer 1. Incubar por duas horas em temperatura ambiente sob balanço suave entre 30 e 50 rpm. Sem lavar, aplique imediatamente 100 microlitadores de coelhinhos diluídos anti-humanos anticorpos de histona H3 diretamente no slide.

Coloque um deslizamento de cobertura em cada seção para permitir a distribuição uniforme da mistura de anticorpos. Incubar por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius com balanço suave. Depois disso, lave os slides três vezes com TBST por cinco minutos cada vez.

Para aplicar anticorpos, use uma pipeta e distribua uniformemente 100 microliters de anticorpo anti-coelho de cabra conjugado à Alexa Fluor 488. Cubra os slides com papel alumínio e incuba os slides por uma hora em temperatura ambiente sob balanço suave. Depois de lavar com TBST de acordo com o manuscrito, incubar as seções no bloqueio tampão 2 durante a noite a quatro graus celsius sob balanço suave.

Proteja-se da luz. Lave com TBST três vezes por cinco minutos cada vez. Bloqueie as seções no bloqueio do buffer 3, como feito anteriormente à temperatura ambiente por duas horas sob balanço suave.

Incubar as seções com biotina esployclonal coelho anti-humano anticorpo elastase de 4 graus Celsius por 12 a 16 horas, como descrito anteriormente. Depois de lavar com TBST incubar os slides com Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate por uma hora em temperatura ambiente. Depois disso, lave com TBST uma vez por cinco minutos.

Aplique 100 microliters de autofluorescense Quenching mistura de solução diretamente nas seções durante um minuto, conforme instruído pelo fabricante. Lave imediatamente os slides com TBST seis vezes por 10 minutos cada vez. Cubra cada slide com 100 microliters de 300 DAPI nanomolar por cinco minutos no escuro.

Em seguida, lave com TBST cinco vezes por três minutos cada vez. Aplique uma gota de meio de montagem antifato diretamente na lâmina de vidro ao redor da seção. Coloque um deslizamento de cobertura suavemente na seção sem criar bolhas.

Permita que as amostras curem durante a noite no escuro a quatro graus Celsius. Para localizar trombo, escaneie cranialmente para caudal ao longo do comprimento da aorta, bifurcação aórtica e cada artéria femeral usando microscopia de contraste de fase com um objetivo de 10x. Primeiro examine as seções de DNA livre de células usando o canal DAPI com a excitação em 357 e 44 nanômetros.

Identifique elastase de neutrófilo extracelular e histítono citrulliado H3 nos canais de proteína fluorescente vermelha e verde do Texas, respectivamente. Mantenha um tempo de exposição consistente e ganhos de cada canal durante a aquisição de imagens para evitar saturação na intensidade dos pixels. Armadilhas extracelulares de neutrófilos são identificadas com base na co-localização de elastase neutrófilo, histona citrulliada H3 e DNA livre de células.

Usando hematoxilalina e eosina, e microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consiste em glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquetas. Os NETs apareceram como redes de fios roxos profundos de vários comprimentos ao redor de eritrócitos e leucócitos próximos. Usando este protocolo, a microscopia de imunofluorescência revelou grandes agregados de NETs compostos de DNA livre de células, histona h3 citrulliada extracelular e elastase neutrófila.

Em contraste de fase na microscopia imunológica, um trombo foi caracterizado como uma estrutura bem demarcada dentro do espaço vascular. No entanto, o trombo não foi detectado em nenhuma das amostras de controle. Esta figura demonstra uma autofluoresência profunda de elementos de coágulos como eritrócitos quando imagens no comprimento de onda de 488 nanômetros.

Breve saciamento de autofluoresência após a imunolabellação aumentou significativamente a sensibilidade da co-localização de proteínas e detecção de REDE mesmo em áreas com abundância de eritrócitos. A duração da fixação afeta a imunoreatividade de certos antígenos. Recomendamos fixação por não mais do que 24 horas por igual à desidratação e incorporação de parafina.

Alternativamente, o paraformaldeído sem metanol pode ser usado para limitar o artefato por ácido fórmico e cetonas da oxidação de formaldeído. Para evitar interferências ao usar anticorpos primários originários da mesma espécie, incluímos etapa de bloqueio adicional para saturar quaisquer locais de ligação restantes nos anticorpos secundários. Os investigadores devem incluir controles negativos que consistem em anticorpos isótipos, exclusão de anticorpos primários e medidas de rotulagem imuno-rotulagem e controles biológicos de gatos sem trombose.

A autofluoresência dos limites teciduais do trombo pode martelar a identificação microscópica de armadilhas extracelulares de neutrófilos. O investigador pode minimizar a fluorescência pelo uso de fluoroforos vermelhos distantes. Esta técnica pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo de armadilhas extracelulares de neutrófilos em outras espécies veterinárias.

Isso pode proporcionar uma melhor compreensão da fisiopatologia da trombose.