Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias

As nanopartículas magnéticas são ferramentas ideais para a ciência analítica e a nano medicina devido às suas fortes propriedades magnéticas e à fácil funcionalidade de sua superfície. Relatamos aqui a primeira instância de um conjugado entre partículas magnéticas de sílica amino funcionalizadas e a feroxamina siderophore, juntamente com avaliação para a captura de material fotogênico. Siderophores são pequenas moléculas orgânicas que desempenham um papel fundamental no mecanismo de partake de ferro, e são reconhecidos por receptores específicos de membrana externa de bactérias.

Este vídeo exibe, passo a passo, um protocolo eficiente para preparar nanopartículas de ferro magnético. Em seguida, foram revestidos com sílica para proteger a dispersão e proteger o núcleo magnético. A superfície do reator resultante foi funcionalizada com grupos de amina.

Síntese de nanopartículas magnéticas conjugadas com feroxamina. Adicione 0,5 gramas de Fe(acac)3 em um frasco de vidro de 20 mL. Em seguida, misture com 10 mL de álcool benzílico.

Sonicar esta mistura por 2 minutos. Em seguida, transfira para um bloco de aquecimento e aqueça a 180 graus Centígrados por 72 horas. Enxágüe as nanopartículas com 96% de etanol.

E centrífuga por 30 minutos. Separe as nanopartículas do supernante por atração magnética, usando um ímã de neodímio. Descarte o solvente residual.

Descarte o supernatante, alternando com a sônica, até que o solvente pareça claro. Prepare uma suspensão de 2 gramas de MNP em 80 mililitros de isopropanol, adicione 4 mililitros de 21%, 7,5 mililitros de água destilada e 0,56 mililitros de TEOS. Aqueça a mistura a 40 graus centígrados por 2 horas, com agitação contínua.

Então, sonicate por 1 hora. Separe o MNP com um ímã, descarte o supernascer, disperse-o em 30 mililitros de isopropanol, adicione amônia, água destilada e TEOS, na mesma ordem descrita anteriormente. Aqueça a mistura a 40 graus centígrados por duas horas com agitação contínua.

Então, sonicate por uma hora. Remova e lave convenientemente a barra de agitação magnética, para recuperar todo o material. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes, alternando com a sônica.

Seque as nanopartículas sob vácuo à temperatura ambiente por 12 horas. Enxágüe 500 miligramas do MNP@SIO2 obtidos da etapa anterior com dimetilformamida. Sonicá-los e descartar.

Suspenda as partículas em um frasco de fundo redondo, mexa com uma barra magnética e adicione 9 mililitros de APTES. Mexa a mistura a 60 graus centígrados por 12 horas. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes, alternando com a sônica.

Dissolva 100 mg de deferoxamina, sal mesilado e 53,0 miligramas de acetilado de ferro em 5 mililitros de água destilada. Mexa a mistura durante a noite em temperatura ambiente. Lave o produto resultante três vezes com 20 mililitros de acetato etílico em um funil de separação.

Remova o solvente orgânico sob vácuo. Congele a fase aquosa para pagar feroxamina e um sólido vermelho. Adicione 350 miligramas de anidrido de succinico a uma solução de 100 mg de feroxamina em 5 mililitros de piridina em um frasco de fundo redondo de 50 mililitros.

Mexa a mistura resultante, em temperatura ambiente, por 16 horas. Remova o excesso de piridina sob pressão reduzida. Dissolva a reação em 3 mililitros de metanol.

Transfira a solução metodólica em uma coluna LH-20 e elute a 0,5 mL/minuto. Colete a fração vermelha e remova o metanol sob vácuo. Enxágüe 30 mg de nanopartículas funcionais de amina seca duas vezes com DMF e sonicar as nanopartículas em um frasco de 100 mililitros Erlenmeyer por 30 minutos.

Prepare uma solução de 200 miligramas N-succinylferoxamine, 173 miligramas Benzotriazole 1-yl-oxy-tris-fosphonium hexafluorophosphate BOP, 46 mg 1-hidroxibenzotriazole HOBt e 128,8 miligramas N, N-diisopropilethylamina DIPEA, em 10 mL de DMF, em um frasco de fundo redondo de 50 mililitros. Suspenda o MNP@SiO2@NH2 anteriormente enxaguado em um 3 mililitro de DMF, sob sônica em condições secas e livres de oxigênio. Use atmosfera de argônio.

Adicione, dropwise, misture A para misturar B.Shake a mistura final, usando um agitador orbital, à temperatura ambiente durante a noite. Separe o conjugado resultante da suspensão usando um ímã. Ensaio bacteriano com cepas Y.enterocolitica para quantificar o isolamento e captura de bactérias patogênicas com nanopartículas.

Prepare a suspensão de todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final em PBS a 1 mg/mL em tubos estéreis. Prepare uma cultura de Y.entorocolitica em 5 mL de Luria Bertani, LB, caldo durante a noite. Prepare um 5 mL de ferro deficiente Trypcase Soy Broth, TSB, pela adição de 50 microliters de 10 mM 2, solução de 2 bipiridos.

Inocular o 5 mililitro de caldo TSB deficiente de ferro com 50 microliters da cultura da noite para o dia de Y.enterocolitica. Incubar a 37 graus centígrados com agitação até que um OD600 de 0,5 a 0,8 seja alcançado. Pegue 100 microliters da cultura da noite para o dia e dilua-o em um tubo contendo 900 microliters de PBS para obter a primeira diluição de 1/10.

Em seguida, prepare uma diluição de 1/100 da primeira diluição usando o mesmo procedimento para obter uma concentração de células bacterianas a 10 ao poder de 6 Unidades formadoras de colônias por mililitro aproximadamente. Adicione 100 microliters de suspensão de nanopartículas e 1 mg/mL a 1 mililitro da diluição de 1/100 bactérias. Separe os agregados de bactérias MNP, usando um ímã, descarte, cuidadosamente, o supernasce.

Enxágüe as nanopartículas separadas duas vezes com PBS de 1 milímetro usando um vórtice. Prepare quatro diluições consecutivas de 1/10 da suspensão anterior, até um 10 ao poder de diluição de menos 4. Placa 10 microliters de cada diluição em placas de ágar TS.

Fotografe a placa com um digitalizador de gel no modo epi branco. Processe a imagem, usando o software conveniente, para amplificar um local para contar o número de colônias individuais. Para confirmar a formação do vínculo covalente entre as nanopartículas e o siderophore, empregamos espectroscopia FT-IR Raman para monitorar a síntese, observando como novas bandas aparecem de acordo com um novo grupo funcional em cada etapa.

Foram utilizadas microscopia TEM e SEM para observar a morfologia e o tamanho das partículas. Análise termogravimétrica para medir a perda de peso devido à adição de material orgânico. E a XPS nos permite analisar os diferentes estados de oxidação dos átomos na superfície e confirmar a formação de ligações covalentes.

Finalmente, usamos todos os intermediários no conjugado final para testar sua capacidade de capturar bactérias, a fim de estabelecer suas propriedades como biosensor. Este protocolo foi projetado para tirar proveito da alta biocompatibilidade das nanopartículas magnetitas. O revestimento com sílica melhora a dispersão e protege o núcleo magnético da degradação em mídia aquosa.

E também dar uma superfície reativa para funcionalizar com grupos de amina que são necessários para prender um siderophore modificado ácido pela química de carbodiimídeo. Neste caso, N-succynilferoxamine. A capacidade de captura de bactérias conjugadas foi testada e, como resultado, foi encontrado um baixo número de colônias, sem diferença significativa com os intermediários devido a interações específicas sobre efeitos volumosos apresentados na suspensão bacteriana da PBS.