Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Este protocolo permite a derivação de neurônios simpáticos de células-tronco pluripotentes humanas. Essas células permitirão que um cientista estude distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso simpático. Esta técnica permite a derivação de neurônios simpáticos em condições de reunião divididas sem alimentação em alta eficiência escalável.

Resulta em neurônios eletricamente ativos em 20 dias. Esta técnica pode ser aplicada a doenças causadas por um sistema nervoso simpatizante disfuncional, também pode ser usada para modelagem de doenças, medicina regenerativa e rastreamento de medicamentos. Essas células poderiam ser usadas in vitro para inovar qualquer tecido dentro de um sistema de co-cultura, por exemplo, para o estudo da regulação do tecido cardíaco.

Quando a cultura de células-tronco pluripotentes humanas atinge 80 a 90% de confluência, grandes colônias com bordas brilhantes lisas devem ser observadas. Para dividir, lave a cultura com PBS antes de tratar as células com quatro mililitros de 0,25 molar EDTA a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após dois minutos, lave a placa com 10 mililitros de média E8 e transfira a suspensão celular destacada para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, transfira 500 microliters de células para uma alíquota de 9,5 mililitros de meio E8 fresco. E coloque as células-tronco em novas antenas revestidas de 100 milímetros. Um dia antes da indução de diferenciação, cubra o número apropriado de seis placas de poço com dois mililitros de matriz de membrana de porão por poço.

E armazene as placas a 4 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, aqueça as placas à temperatura ambiente e lave a cultura de células-tronco pluripotentes humanas duas vezes com PBS fresco por lavagem. Após a segunda lavagem, trate as células com sete mililitros de 0,5 mililitros EDTA por 15 minutos na incubadora de cultura celular antes de aspirar as células-tronco pluripotentes humanas flutuantes e transferir as células colhidas para um tubo de 50 mililitros.

Adicione um volume igual de PBS ao tubo para diluir o EDTA e coletar as células por centrifugação. Resuspenda a pelota em um mililitro do meio de diferenciação do dia 01 antes de adicionar um volume adequado de meio para a contabilidade. Diluir as células para uma concentração de 1,25 vezes 10 vezes 10 a cinco células por centímetro quadrado em mililitros de meio de diferenciação por poço.

Aspire toda a solução de matriz de membrana do porão de cada poço do anteriormente preparado para seis placas de poço. Em seguida, semente dois mililitros de células em cada poço e colocar a placa na incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, alimente as células com três mililitros do dia 01 meio de diferenciação por poço.

No segundo dia de diferenciação, alimente as células com três mililitros do segundo dia a 10 meio de diferenciação por poço, depois alimente as células a cada dois dias até o dia 10. Para agregar as células da crista neural em esferoides, no dia 10, lave as células com PBS. E adicione dois mililitros de meio de dissociação a cada poço.

Após 20 minutos na incubadora de cultura celular, transfira as células flutuantes para um tubo cônico de 50 mililitros e leve o volume de suspensão no tubo para 50 mililitros com PBS fresco. Recolher as células por centrifugação. E resuspense a pelota em um volume suficiente do dia 10 a 14 meio esferoide para contar.

Após a contagem, dilui as células para cinco vezes 10 a 5 células por concentração de 500 microliters usando o meio esferoide do dia 10 a 14. E placa 500 microliters de células em cada poço de uma placa de 24 poços de fixação ultra baixa. Em seguida, devolva as células para a incubadora de cultura celular.

Para induzir uma cultura esferoide mínima, no 11º dia de cultura, alimentar os esferoides da crista neural com mais 500 microliters do dia 10 a 14 de meio esferoide por bem. No dia 12, incline a placa para acumular os esferoides de um lado da placa. E aspirar cuidadosamente o máximo possível de cada poço sem aspirar esferoides.

Em seguida, alimente os esferoides com um mililitro do dia 10 a 14 meio esferoide por poço. Para induzir uma cultura esferoide expandida, no dia 15, alimentar os esferoides com 1,5 mililitros do dia 10 a 14 médios esferoides suplementados com ácido retinóico de 0,5 micromolar por poço. Em seguida, devolva os esferoides para a incubadora de cultura celular.

Para diferenciação de neurônios simpáticos, nos dias 14 ou 28, incline a placa para acumular os esferoides de um lado da placa e aspire cuidadosamente o máximo possível. Alimente as células com um mililitro de meio neurônio simpático. Para quebrar grandes agregados esferoides em esferoides menores, adicione não mais do que um mililitro de médio por poço e pipeta os esferoides cinco a dez vezes antes de se dividir.

E remova o excesso de fibronectina de laminina de placas previamente preparadas de 24 poços. Divida a placa de um mililitro de esferoides de cada poço na placa de cultura esfóide de 24 poços entre quatro poços separados da nova placa revestida de 24 poços. Adicione 250 microliters de médio neurônio simpático fresco a cada poço.

E coloque a placa na incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, substitua o meio em cada poço por um mililitro de neurônio simpático médio suplementado com ácido retinóico de 0,125 micromolar e devolva a placa à incubadora de cultura celular. Após o dia 35, alimente os neurônios substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente em cada poço por meio fresco.

Antes da diferenciação, as colônias de células-tronco pluripotentes humanas devem ser redondas com bordas brilhantes e lisas e pouca ou nenhuma diferenciação. As células expressam o marcador de crista neural Sox10 dos dias 4 a 10. As células da crista neural emergem em cumes densos escavados que são visíveis desde o sexto dia.

Esses cumes também expressam Sox10. No estágio das células da crista neural, Sox10 se correlaciona com o marcador de superfície celular CD49D, que pode ser usado para classificar as células da crista neural. Populações positivas e não sortidas produziram spheróides de crista neural de forma semelhante.

Embora as células classificadas negativas não se agreguem adequadamente, não produzam esferoides redondos e saudáveis e morram dentro de três a quatro dias. Além disso, quando os esferoides da crista neural são comparados no dia 14, a transcrição reversa quantitativa PCR para crista neural e marcadores progenitores nervosos simpáticos, diferenças significativas entre as células classificadas e não sortidas não podem ser detectadas. No dia 20 ou 35, os respectivos protocolos mínimos ou estendidos, os neuroides podem ser observados crescendo em um padrão radial a partir dos esferoides conectados.

Marcadores relacionados à síntese e transporte da norepinefrina são expressos nesta fase, assim como Hox6 através de nove genes de crista neural do tronco. O registro eletrofisiológico também detecta atividade neural a partir do dia 20. Tal atividade pode ser aprimorada ou suprimida por drogas que visam autoreceptores de neurônios simpáticos ajustando a funcionalidade de neurônios diferenciados.

O próprio proponente humano deve ser saudável a partir do dia zero de diferenciação, caso contrário, o experimento provavelmente falhará. Inibidores ou ativadores farmacológicos podem ser adicionados aos neurônios para entender seu comportamento normal ou patológico. Este método abre um novo caminho para estudar biologia e patologia simpática, uma vez que agora é possível obter biópsias de neurônios simpáticos de humanos facilmente.