Name: Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a diferenciar neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas em cultura sem alimentadores. Este método gera neurônios eletricamente ativos em 20 dias para modelagem de doenças autonômicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a Heidi Ulrichs pela leitura crítica e edição do manuscrito.

<ol><li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia%3A+History%2C+genotype%2C+phenotype+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li>
<li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li>
<li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li>
<li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+renal+sympathetic+denervation%3A+2013+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li>
<li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Anatomy%2C+Physiology%2C+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+NM+%22The+Neural+Crest%22">The Neural Crest</a>. , Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li>
<li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li>
<li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP%2C+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).</li>
<li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth%2C+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li>
<li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li>
<li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li>
<li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insm1+%28IA-1%29+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrainor%2C+P+%22Neural+Crest+Cells%3A+Evolution%2C+Development+and+Disease%22">Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li>
<li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling%3A+current+hurdles+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li>
<li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li>
<li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).</li>
<li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li>
<li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+systems+in+stress%3A+structural+and+molecular+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Review%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li>
<li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling%2C+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Autonomic+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li>
<li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Neurophotonics%3B+Neural+Imaging+and+Sensing%3B+and+Optogenetics+and+Optical+Manipulation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Publicamos recentemente duas revisões, uma discutindo o uso de symNs derivados do hPSC para modelagem de doenças31, bem como uma comparação aprofundada dos protocolos de diferenciação disponíveis22. Assim, aqui nos concentramos em solucionar problemas do protocolo atual para ajudar o pesquisador interessado a ter sucesso na fabricação de symNs. Durante todo o processo de diferenciação, a fim de obter dados consistentes, bem como células diferenciadas saudáveis, a contaminaç...

Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade1. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos2. Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.
Anatomia O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios5. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).
Desenvolvimento Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição6, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos7. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-1112. Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL113, que promove a expressão de PHOX2B14 e INSM115. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH16. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th17.
Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta18 para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.
Protocolo symN anterior Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente22. Em 201623, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno23. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo24. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD25 para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D+ ou SOX10+ 26,23, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)27. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc28. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D+/SOX10+ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de células de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de cultura de tecidos de 15 mL</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ultra-baixa fixação de 24 poços</td><td>Corning</td><td>07 200 601 e 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos 5% CO2/20% O2</td><td>Thermo Fisher/Life Tecnologias</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de cultura de tecidos de 50 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>Solução de dissociação celular</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-AP2a</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Hospedeiro: Coelho; diluição</td></tr> <tr><td>1:400Anticorpo anti-Ascl1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD49D</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 &mu; l/milhão de células em 100 &mu; l volume</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD49D (isotipo)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 &mu; l/milhão de células em 100 &mu; l volume</td></tr><tr><td>DAPI corante</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 diluição</td></tr><tr><td>Anti-DBH anticorpo</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Hospedeiro: Frango; diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-HOXC9</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NET1</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PRPH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Hospedeiro: Camundongo IgG2a; diluição 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SOX10</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TH</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101-150</td><td>Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Concentração de estoque: 100 mM</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Concentração de estoque: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Concentração de estoque: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Concentração de estoque: 6 mM</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças da câmara de contagem de células</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>Concentração de estoque: 6 mM</td></tr><tr><td>Cryo-vial</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Concentração de estoque: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Concentração de estoque: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Concentração de estoque: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 gibco médio</td><td></td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 gibco médio</td><td></td><td>A15169-01</td><td>Concentração de estoque: 1x</td></tr><tr><td>suplemento E8</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Concentração de estoque: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Concentração de estoque: 0,5 M</td></tr><tr><td>Placas de eletrofisiologia (AXION cytoview MEA96)</td>Máquina FACS <td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX (para FACS)</td><td></td></tr><tr><td>Máquina FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (para classificação)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS (tampa de filtro azul)</td><td>Tubos Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS (tampa branca)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Concentração de estoque: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Matriz de membrana basal; Concentração de estoque: 100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>Concentração de estoque: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>de L-glutamina</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>Concentração de estoque: 200 mM</td></tr><tr><td>LN tank</td><td>Custom Biogenic Systems</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>MEA leitor</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Mouse lamina I (LM)</td> <td>R & D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>Concentração de estoque: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>de suplemento de N2</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Concentração de estoque: 100x</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>Concentração de estoque: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>Concentração de estoque: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Concentração de estoque: 1x</td></tr><tr><td>bromidrato de poli-L-ornitina (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Concentração de estoque: 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Primocin (antibióticos)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Concentração de estoque: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>de máquina de qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>placas de qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB/CF</td><td>Concentração de estoque: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Concentração de estoque: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Concentração de estoque: 10 mM</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Concentração de estoque: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Concentração de estoque: 10 mM</td></tr></tbody></table>

diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tornaram-se uma poderosa ferramenta para a modelagem de doenças e o estudo do desenvolvimento embrionário humano in vitro. Anteriormente, apresentamos um protocolo de diferenciação para a derivação de neurônios autônomos com caráter simpático que tem sido aplicado a pacientes com neuropatia autônoma. No entanto, o protocolo foi construído sobre a Substituição de Soro Knock Out (KSR) e as condições de cultura baseadas em alimentadores, e para garantir alta eficiência de diferenciação, a classificação celular era necessária. Esses fatores causam alta variabilidade, alto custo e baixa reprodutibilidade. Além disso, não foram verificadas propriedades simpáticas maduras, incluindo a atividade elétrica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado onde a cultura e a diferenciação do PSC são realizadas em condições culturais livres de alimentadores e quimicamente definidas. Marcadores genéticos que identificam a crista neural do tronco são identificados. Outra diferenciação em neurônios simpáticos pós-ganglionários é alcançada após 20 dias sem a necessidade de classificação celular. A gravação eletrofisiológica mostra ainda a identidade funcional do neurônio. O disparo detectado a partir de nossos neurônios diferenciados pode ser aprimorado pela nicotina e suprimido pelo antagonista do receptor adrenérgico propranolol. Progenitores neurais simpáticos intermediários neste protocolo podem ser mantidos como esferóides neurais por até 2 semanas, o que permite a expansão das culturas. Em suma, nosso protocolo de diferenciação de neurônios simpáticos atualizados mostra alta eficiência de diferenciação, melhor reprodutibilidade, mais flexibilidade e melhor maturação neural em comparação com a versão anterior. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores as células necessárias para estudar os distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso autônomo.

Neste protocolo, damos instruções sobre como gerar symNs a partir de hPSCs. As condições de cultura aqui demonstradas foram melhoradas de um protocolo publicadoanteriormente 23,24 (Figura 1A) para condições livres de alimentadores e quimicamente definidas(Figura 1B). Duas opções são fornecidas, uma em que os simns são feitos dentro de 20 dias, e outra onde os NCCs podem ser expandidos por 2 semanas para ...

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Este protocolo permite a derivação de neurônios simpáticos de células-tronco pluripotentes humanas. Essas células permitirão que um cientista estude distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso simpático. Esta técnica permite a derivação de neurônios simpáticos em condições de reunião divididas sem alimentação em alta eficiência escalável.Resulta em neurônios eletricamente ativos em 20 dias. Esta técnica pode ser aplicada a doenças causadas por um sistema nervoso simpatizante disfuncional, também pode ser usada para modelagem de doenças, medicina regenerativa e rastreamento de medicamentos. Essas células poderiam ser usadas in vitro para inovar qualquer tecido dentro de um sistema de co-cultura, por exemplo, para o estudo da regulação do tecido cardíaco.Quando a cultura de células-tronco pluripotentes humanas atinge 80 a 90% de confluência, grandes colônias com bordas brilhantes lisas devem ser observadas. Para dividir, lave a cultura com PBS antes de tratar as células com quatro mililitros de 0,25 molar EDTA a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após dois minutos, lave a placa com 10 mililitros de média E8 e transfira a suspensão celular destacada para um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, transfira 500 microliters de células para uma alíquota de 9,5 mililitros de meio E8 fresco. E coloque as células-tronco em novas antenas revestidas de 100 milímetros. Um dia antes da indução de diferenciação, cubra o número apropriado de seis placas de poço com dois mililitros de matriz de membrana de porão por poço.E armazene as placas a 4 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, aqueça as placas à temperatura ambiente e lave a cultura de células-tronco pluripotentes humanas duas vezes com PBS fresco por lavagem. Após a segunda lavagem, trate as células com sete mililitros de 0,5 mililitros EDTA por 15 minutos na incubadora de cultura celular antes de aspirar as células-tronco pluripotentes humanas flutuantes e transferir as células colhidas para um tubo de 50 mililitros.Adicione um volume igual de PBS ao tubo para diluir o EDTA e coletar as células por centrifugação. Resuspenda a pelota em um mililitro do meio de diferenciação do dia 01 antes de adicionar um volume adequado de meio para a contabilidade. Diluir as células para uma concentração de 1,25 vezes 10 vezes 10 a cinco células por centímetro quadrado em mililitros de meio de diferenciação por poço.Aspire toda a solução de matriz de membrana do porão de cada poço do anteriormente preparado para seis placas de poço. Em seguida, semente dois mililitros de células em cada poço e colocar a placa na incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, alimente as células com três mililitros do dia 01 meio de diferenciação por poço.No segundo dia de diferenciação, alimente as células com três mililitros do segundo dia a 10 meio de diferenciação por poço, depois alimente as células a cada dois dias até o dia 10. Para agregar as células da crista neural em esferoides, no dia 10, lave as células com PBS. E adicione dois mililitros de meio de dissociação a cada poço.Após 20 minutos na incubadora de cultura celular, transfira as células flutuantes para um tubo cônico de 50 mililitros e leve o volume de suspensão no tubo para 50 mililitros com PBS fresco. Recolher as células por centrifugação. E resuspense a pelota em um volume suficiente do dia 10 a 14 meio esferoide para contar.Após a contagem, dilui as células para cinco vezes 10 a 5 células por concentração de 500 microliters usando o meio esferoide do dia 10 a 14. E placa 500 microliters de células em cada poço de uma placa de 24 poços de fixação ultra baixa. Em seguida, devolva as células para a incubadora de cultura celular.Para induzir uma cultura esferoide mínima, no 11º dia de cultura, alimentar os esferoides da crista neural com mais 500 microliters do dia 10 a 14 de meio esferoide por bem. No dia 12, incline a placa para acumular os esferoides de um lado da placa. E aspirar cuidadosamente o máximo possível de cada poço sem aspirar esferoides.Em seguida, alimente os esferoides com um mililitro do dia 10 a 14 meio esferoide por poço. Para induzir uma cultura esferoide expandida, no dia 15, alimentar os esferoides com 1,5 mililitros do dia 10 a 14 médios esferoides suplementados com ácido retinóico de 0,5 micromolar por poço. Em seguida, devolva os esferoides para a incubadora de cultura celular.Para diferenciação de neurônios simpáticos, nos dias 14 ou 28, incline a placa para acumular os esferoides de um lado da placa e aspire cuidadosamente o máximo possível. Alimente as células com um mililitro de meio neurônio simpático. Para quebrar grandes agregados esferoides em esferoides menores, adicione não mais do que um mililitro de médio por poço e pipeta os esferoides cinco a dez vezes antes de se dividir.E remova o excesso de fibronectina de laminina de placas previamente preparadas de 24 poços. Divida a placa de um mililitro de esferoides de cada poço na placa de cultura esfóide de 24 poços entre quatro poços separados da nova placa revestida de 24 poços. Adicione 250 microliters de médio neurônio simpático fresco a cada poço.E coloque a placa na incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, substitua o meio em cada poço por um mililitro de neurônio simpático médio suplementado com ácido retinóico de 0,125 micromolar e devolva a placa à incubadora de cultura celular. Após o dia 35, alimente os neurônios substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente em cada poço por meio fresco.Antes da diferenciação, as colônias de células-tronco pluripotentes humanas devem ser redondas com bordas brilhantes e lisas e pouca ou nenhuma diferenciação. As células expressam o marcador de crista neural Sox10 dos dias 4 a 10. As células da crista neural emergem em cumes densos escavados que são visíveis desde o sexto dia.Esses cumes também expressam Sox10. No estágio das células da crista neural, Sox10 se correlaciona com o marcador de superfície celular CD49D, que pode ser usado para classificar as células da crista neural. Populações positivas e não sortidas produziram spheróides de crista neural de forma semelhante.Embora as células classificadas negativas não se agreguem adequadamente, não produzam esferoides redondos e saudáveis e morram dentro de três a quatro dias. Além disso, quando os esferoides da crista neural são comparados no dia 14, a transcrição reversa quantitativa PCR para crista neural e marcadores progenitores nervosos simpáticos, diferenças significativas entre as células classificadas e não sortidas não podem ser detectadas. No dia 20 ou 35, os respectivos protocolos mínimos ou estendidos, os neuroides podem ser observados crescendo em um padrão radial a partir dos esferoides conectados.Marcadores relacionados à síntese e transporte da norepinefrina são expressos nesta fase, assim como Hox6 através de nove genes de crista neural do tronco. O registro eletrofisiológico também detecta atividade neural a partir do dia 20. Tal atividade pode ser aprimorada ou suprimida por drogas que visam autoreceptores de neurônios simpáticos ajustando a funcionalidade de neurônios diferenciados.O próprio proponente humano deve ser saudável a partir do dia zero de diferenciação, caso contrário, o experimento provavelmente falhará. Inibidores ou ativadores farmacológicos podem ser adicionados aos neurônios para entender seu comportamento normal ou patológico. Este método abre um novo caminho para estudar biologia e patologia simpática, uma vez que agora é possível obter biópsias de neurônios simpáticos de humanos facilmente.

efficient-differentiation-postganglionic-sympathetic-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Este vídeo demonstra um método in vitro para gerar neurônios simpáticos pós-ganglionares a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células da crista neural (NCCs) em um suporte de matriz de membrana basal usando um meio de diferenciação. Os NCCs são então dissociados e formados em esferóides usando outro meio de diferenciação. Finalmente, os esferóides são transformados em neurônios simpáticos pós-ganglionares usando um meio de neurônio simpático.

Geração de neurônios simpáticos pós-ganglionares a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este vídeo demonstra a geração de células progenitoras neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células progenitoras neurais usando um meio de diferenciação neuronal. Enquanto a diferenciação é induzida em células não transgênicas usando pequenas moléculas, as hPSCs transgênicas são diferenciadas pela adição de um antibiótico que induz o promotor de um fator de transcrição específico de diferenciação neuronal.

Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Este vídeo mostra o processo de diferenciação de iPSCs humanas em neurônios motores. A lógica envolve a utilização de iPSCs que foram geneticamente modificadas para expressar fatores de transcrição específicos. Quando cultivado em um meio contendo doxiciclina, esse antibiótico desencadeia a expressão de fatores de transcrição, promovendo assim a diferenciação de iPSC em progenitores do neurônio motor. Em última análise, os progenitores são cultivados em um meio neuronal para produzir neurônios...

Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios motores funcionais

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a diferenciar neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas em cultura sem alimentadores. Este método gera neurônios eletricamente ativos em 20 dias para modelagem de doenças autonômicas.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas (Vídeo) | JoVE Journal

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Explorar mais vídeos