Name: Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda análise metabolômica não direcionada de grãos de trigo usando cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método robusto detecta uma gama mais ampla de metabólitos para compreender respostas bioquímicas ao estresse.

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Os autores gostariam de reconhecer o programa de Bolsas de Agricultura e Alimentação do Primeiro-Ministro da Austrália Ocidental (Departamento de Empregos, Turismo, Ciência e Inovação, Governo da Austrália Ocidental) e o Primeiro-Ministro, professor Simon Cook (Centro para Agricultura Digital, Universidade de Curtin e Universidade Murdoch). Os ensaios de campo e a coleta de amostras de grãos foram apoiados pelo governo do programa Royalties for Regions da Austrália Ocidental. Reconhecemos Grantley Stainer e Robert French por suas contribuições para testes de campo. As Bioplataformas da Austrália, financiadas pelo NCRIS, são reconhecidas pelo financiamento de equipamentos.

<ol><li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li>
<li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype%2C+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+%28Triticum+durum+Desf.%29+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li>
<li>Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li>
<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
<li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li>
<li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li>
<li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li>
<li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
<li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+4.0%3A+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li>
<li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li>
<li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li>
<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui, apresentamos um método de metabolômica não direcionado à base de LC-MS para a análise de grãos de trigo. O método combina quatro modos de aquisição (fase invertida e fase invertida com ionização positiva e negativa) em dois modos, introduzindo uma terceira fase móvel no gradiente de fase invertida. A abordagem combinada produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por polaridade de íons, com cerca de metade dessas significativamente diferentes em intensidade entre as variedades de trigo. M...

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e práticas de manejo na agricultura poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e da qualidade do produto. Os metabólitos vegetais são influenciados por fatores como o genoma, o ambiente (clima, chuvas etc.), e em um ambiente agrícola, a forma como as culturas são gerenciadas (ou seja, aplicação de fertilizantes, fungicidas etc.). Ao contrário do genoma, o metabolome é influenciado por todos esses fatores e, portanto, os dados metabolômicos fornecem uma impressão digital bioquímica dessas interações em um determinado momento. Geralmente, há uma das duas metas para um estudo baseado em metabolômica: em primeiro lugar, obter uma compreensão mais profunda da bioquímica do organismo e ajudar a explicar o mecanismo de resposta à perturbação (estresse abiótico ou biótico) em relação à fisiologia; e, em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo. Em ambos os casos, o resultado de ter esse conhecimento é uma estratégia de gestão mais precisa para alcançar o objetivo de melhorar o tamanho e a qualidade do rendimento.
Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares depequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas. Atualmente, nenhuma plataforma metabolômica (espectrometria de massa predominantemente e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode capturar todo o metabolome em uma única análise. Desenvolver tais técnicas (preparação da amostra, extração e análise metabólica), que fornecem a maior cobertura possível do metabolome dentro de uma única corrida analítica, é um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica. Análises metabolômicas não direcionadas anteriores de grãos de trigo combinaram dados de múltiplas separações cromatográficas e polaridades de aquisição e/ou instrumentação para maior cobertura metabolome. No entanto, isso exigiu que as amostras fossem preparadas e adquiridas separadamente para cada modalidade. Por exemplo, Beleggia et al.2 prepararam uma amostra derivatizada para a análise de ánlytes polares gc-ms, além da análise gc-ms dos analytes não polares. Das et al.3 utilizaram métodos GC e LC-MS para melhorar a cobertura em suas análises; no entanto, essa abordagem exigiria geralmente preparações amostrais separadas como descrito acima, bem como duas plataformas analíticas independentes. Análises anteriores de grãos de trigo utilizando GC-MS3,5 2,,3,,4 e LC-MS 3 , 5 plataformas produziram 50 a 412 (55 identificados) recursos para GC-MS, 409 para GC-MS e LC-MS combinados e vários milhares para análise de lipidomia slc-MS5. Ao combinar pelo menos dois modos em uma única análise, a cobertura metabolome estendida pode ser mantida, aumentando a riqueza da interpretação biológica e, ao mesmo tempo, oferecendo economia tanto no tempo quanto no custo.
Para permitir a separação eficiente de uma ampla gama de espécies lipídicas por cromatografia de fase invertida, as metodologias de lipidomia modernas geralmente utilizam uma alta proporção de isopropanol no solvente de elução6, proporcionando amenidade às classes lipídicas que poderiam ser não resolvidas pela cromatografia. Para uma separação lipídica eficiente, a fase móvel inicial também é muito maior na composição orgânica7 do que os métodos cromatográficos de fase invertidos típicos, que consideram outras classes de moléculas. A alta composição orgânica no início do gradiente torna esses métodos menos adequados para muitas outras classes de moléculas. Mais notavelmente, a cromatografia líquida de fase invertida emprega um gradiente binário solvente, começando com uma composição principalmente aquosa e aumentando em conteúdo orgânico à medida que a força de eluição da cromatografia é aumentada. Para tanto, buscou-se combinar as duas abordagens para alcançar a separação das classes lipídicas e não lipídicas de metabólitos em uma única análise.
Aqui, apresentamos um método cromatográfico que utiliza uma terceira fase móvel e permite um método de cromatografia de fase reversa e lipidomics adequado à lipidomia usando uma única preparação de amostra e uma coluna analítica. Adotamos muitas das medidas de controle de qualidade e etapas de filtragem de dados que já foram implementadas em estudos de metabolômica predominantemente clínica. Essas abordagens são úteis na determinação de características robustas com alta reprodutibilidade técnica e relevância biológica e excluem aquelas que não atendem a esses critérios. Por exemplo, descrevemos a repetição da amostra de QC agrupada8, correção QC9, filtragem de dados9,,10 e imputação de recursos ausentes11.

<table><tbody><tr><td>13C6-sorbitol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoantraceno</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS grau</td></tr><tr><td>formato de amônio</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>>99,995%</td></tr><tr><td>Analista TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>Versão 1.7</td></tr><tr><td>Software AnalyzerPro</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Software de processamento de dados usado para a etapa 7.2. Versão 5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XD sortware</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Software de processamento de dados usado para a etapa 7.5. Versão 1.4</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius. Balanças de Precisão Pty. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido d6-transcinâmico</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>99%</td></tr><tr><td>Liofilizador (Freezone 2.5 Plus)</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Schott de vidro (100 mL, 500 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro (2 mL) e tampas com tampa de rosca (pré-fenda)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (frascos), VSS-SC91191 (tampas)</td><td></td></tr><tr><td>Kit de instalação para Sciex TripleToF</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS grau</td></tr><tr><td>Liquidificador de laboratório</td><td>Waring comercial</td><td></td><td>Modelo HGBTWTS3</td></tr><tr><td>Leucina-encefalina</td><td>Waters</td><td>p/n 700008842</td><td>Solução de ajuste</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td><td></td><td>Pipeline analítico baseado na Web para metabolômica de alto rendimento. Ferramenta gratuita baseada na web. Versão 4.0.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS grau</td></tr><tr><td>Miconazol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga (Eppendorf 5415R)</td><td>Eppendorf (Distribuído pela Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>5426 No. 0021716</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2 mL)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View software</td><td>Sciex</td><td></td><td>Versão 1.2 (64 bits)</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas (200 uL, 1000 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de plástico (15 mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>Samll software de análise de descoberta de moléculas. Versão 2.3 (64 bits)</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa triplo ToF Sciex 5600</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de lise com tampa de rosca (2 mL) com esferas de cerâmica</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formato de sódio</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Lisador/homogeneizador de tecidos</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>Serial 0001620</td></tr><tr><td>Frascos volumétricos (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>IKA Works Inc. (Distribuído pela Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS grau</td></tr><tr><td>Water's Acquity LC system equipado com bombas quaternárias</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 coluna</td><td>Waters</td><td>p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e gestão na prática agrícola poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade do produto. Os dados metabolômicos fornecem uma leitura dessas interações em um dado momento e são informativos do estado bioquímico de um organismo. Além disso, metabólitos individuais ou painéis de metabólitos podem ser usados como biomarcadores precisos para previsão e gerenciamento de rendimento e qualidade. Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares de pequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas que fornecem uma oportunidade para uma visão bioquímica sobre traços fisiológicos e descoberta de biomarcadores. Para explorar isso, um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica é capturar o máximo possível da diversidade físico-química em uma única análise. Aqui apresentamos um método de metabolômica de massa de cromatografia líquida à base de espectrometria para a análise de grãos de trigo cultivados em campo. O método usa o gerenciador de solventes quaternários cromatógrafo líquido para introduzir uma terceira fase móvel e combina um gradiente tradicional de fase invertida com um gradiente lipídico-passível. Preparação de grãos, extração metabólica, análise instrumental e fluxos de trabalho de processamento de dados são descritos em detalhes. Foi observada boa precisão de massa e reprodutibilidade de sinal, e o método produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por modo de ionização. Além disso, foram determinados sinais de características metabólicas e lipídicas significativamente diferentes entre as variedades de trigo.

O metabolome vegetal é influenciado por uma combinação de seu genoma e ambiente, e adicionalmente em um ambiente agrícola, o regime de manejo de culturas. Demonstramos que as diferenças genéticas entre as variedades de trigo podem ser observadas no nível metabólito, aqui, com mais de 500 compostos medidos mostrando concentrações significativamente diferentes entre as variedades apenas no grão. Boa precisão de massa (&lt;10 ppm erro) e reprodutibilidade de sinal (&lt;20% RSD) das normas in...

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

O metabólito é influenciado por fatores como o ambiente do genoma e as práticas de manejo. Compreender as interações entre esses fatores poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade de um produto. Ao incorporar uma terceira fase móvel, em vez das duas tradicionais, esta técnica permite a separação e detecção de uma gama mais ampla de metabólitos.Metabolômica pode ser aplicada a qualquer área da biologia. Em primeiro lugar, para obter uma compreensão mais profunda da bioquímica de um organismo, e ajudar a explicar sua resposta ao estresse abiótico ou biótico em relação à fisiologia. Em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo.Como o álcool isopropílico é um solvente viscoso, deve ser introduzido a baixa taxa de sinalização, e tempo de equilíbrio suficiente usado antes de aumentar a composição para 98%Essas etapas impedirão que o sistema gráfico cromático pressione demais, devolvendo um erro ou potencialmente danificando a coluna analítica. Para começar a preparação dos grãos, use um liquidificador de laboratório para moer o grão. Execute o liquidificador em alta velocidade por 20 segundos e depois repita.Remova o frasco do liquidificador da base. Bata na lateral do frasco do liquidificador para trazer qualquer grão grosseiramente moído para a superfície da amostra. Os grãos moídos grossresamente podem ser descartados ou armazenados.Transfira o grão finamente moído do liquidificador para um tubo de micro centrífuga de plástico de dois mililitros. No mesmo dia da extração, prepare o solvente de extração, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, pese 200 miligramas de grãos finamente moídos em um tubo de micro centrífuga de dois mililitros.Adicione 500 microliters de solvente de extração ao grão no tubo. Além disso, prepare um branco adicionando 500 microliters de solvente de extração a um tubo vazio. Com um homogeneizador, fixado a 6.500 RPM, misture o solvente e o grão por 20 segundos.Então, repita por mais 20 segundos. Em seguida, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius e 16,100 vezes G, por cinco minutos. Transfira o supernatante para um tubo plástico de dois mililitros e mantenha a pelota.Repita o processo de extração na pelota duas vezes. Combine os três supernantes, produzindo um volume total de extrato de aproximadamente 1,5 mililitros e misture por vórtice. Para fazer uma amostra agrupada de todos os extratos de grãos a serem usados para controle de qualidade, transfira 55 microliters de cada extrato de grão para um tubo de dois mililitros e vórtice.Em seguida, transfira 50 alíquotas de microliter desta amostra agrupada para frascos de vidro. Transfira uma alíquota de 50 microliter de cada extrato de amostra de grão para frascos de vidro. Como descrito no manuscrito escrito, prepare as soluções que serão necessárias para espectrometria de massa cromatografia líquida.No dia da análise LCMS, prepare 100 mililitros de 5% de acetonitrilo, contendo 200 nanogramas por enkephalina de leucina mililitro. Adicione 950 microliters desta solução ao frasco de vidro contendo a alíquota de 50 microliteres do extrato de grãos. Misture o conteúdo no frasco por vórtice.Primeiro, configure um calibrar os instrumentos descritos no manuscrito e no guia de usuário do fabricante. Em seguida, purgar e lavar o sistema de fluidos LC usando solventes de grau LCMS, incluindo fase móvel e solventes de lavagem. Equilibre o sistema LC usando as condições de partida do método LC, garantindo que a pressão da coluna tenha estabilizado.Configure a tabela de sequência de instrumentos. Injete formato de sódio no início da sequência amostral para verificar a calibração do instrumento. Analisar primeiro os espaços em branco solventes e preparatórios, seguidos de amostras de controle de qualidade agrupadas para condicionamento do sistema e, em seguida, a lista de amostras aleatórias.Execute amostras de controle de qualidade em intervalos regulares, como réplicas técnicas. Execute duas amostras de controle de qualidade no final da sequência. Enquanto a sequência estiver em execução, verifique a qualidade dos dados, incluindo tanto a precisão de massa padrão interna quanto a reprodutibilidade do sinal.Para verificar a reprodutibilidade do sinal, a inspeção visual de espectros sobrepostos deve ser suficiente. Quatro normas internas foram incluídas na solução utilizada para a elaboração dos extratos de grãos. Durante o LCMS, observou-se boa precisão em massa e reprodutibilidade única de padrões internos para os modos de ionização positiva e negativa.Com base na análise de espaços em branco, 421 sinais no modo negativo e 835 sinais no modo positivo foram julgados como artefatos. Esses sinais estavam presentes em espaços em branco em intensidades iguais ou superiores a 5% da intensidade média única em amostras de grãos. Após a remoção dos artefatos e posterior filtragem dos dados, o modo negativo retornou 483 recursos e o modo positivo retornou 523 recursos.Aproximadamente 250 características foram biologicamente relevantes e diferiram significativamente em intensidade entre as variedades de trigo. As medidas de controle de qualidade, como a inclusão de espaços em branco preparatórios, normas internas e amostras agrupadas, são importantes de se lembrar neste protocolo.

untargeted-liquid-chromatography-mass-spectrometry-based-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Apresenta-se um protocolo para a determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo sob condições hidropônicas usando cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS-MS). Os resultados mostraram que o imidaclopride pode ser absorvido pelo trigo, e o imidaclopride foi detectado tanto nas raízes quanto nas folhas do trigo.

Determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo

Um método para análise metabolômica de cevada é apresentado. O método envolve fracionamento e derivatização de metabólitos e sua análise por cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC/MS). A análise metabolômica pode ser usada para determinar o efeito do consórcio e do estresse hídrico no grão.

Análise Metabolômica de Cevada por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas

Este protocolo apresenta um método validado de cromatografia líquida-mobilidade iónica e espectrometria de massa de alta resolução para determinar a presença de alcaloides da cravagem nos alimentos, em conformidade com o Regulamento (UE) 2023/915 da Comissão, recentemente publicado.

Detecção de Alcalóides Ergot Regulados em Matrizes de Alimentos por Cromatografia Líquida - Espectrometria de Mobilidade Iônica Aprisionada - Espectrometria de Massa por Tempo de Voo

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Aprenda análise metabolômica não direcionada de grãos de trigo usando cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método robusto detecta uma gama mais ampla de metabólitos para compreender respostas bioquímicas ao estresse.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

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