Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Nossa metodologia é a primeira a fornecer uma ferramenta experimental confiável para induzir uma ativação transitória de uma espécie reativa endógena de oxigênio ou produção de ROS em um tecido in vivo. Nossa metodologia fornece um procedimento robusto, fácil de usar e não invasivo, produzindo uma produção consistente de níveis fisiológicos de ROS estimulantes na pele basicamente usando uma fonte de luz vermelha. À medida que a indução fisiológica de ROS na pele atinge as necessidades do caule do tecido, aplicamos ainda mais nossa metodologia para terapia de regeneração da pele, incluindo boa cicatrização e crescimento do cabelo.

A biologia e sinalização de ROS é atualmente um pote de pesquisa. Uma grande limitação para investigar a função das EROs in vivo é a falta de ferramentas adequadas para induzir uma produção endógena controlada de EROs. NOSSA metodologia é amigável e fácil, mas todos os dispositivos, lâmpadas, IV, IS, etc., precisam ser calibrados adequadamente.

Os precursores químicos críticos devem ser frescos e todas as etapas do protocolo devem ser rigorosamente seguidas. Para induzir o crescimento de pelos na pele dorsal de camundongos na segunda fase telógena, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal em camundongos C57 pretos de seis camundongos pós-natal por volta do dia 50, use uma navalha e creme depilatório para remover duas regiões independentes lado a lado da pele da parte de trás de cada camundongo. Após alguns minutos, retire o creme com PBS e registre o crescimento do folículo piloso através da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas controle e tratadas da pele dorsal de cada animal.

Para induzir a geração de lesões de queimaduras de segundo grau na pele dorsal de camundongos na segunda fase telógena, remova o cabelo do dorso do camundongo. Pré-aqueça uma barra de latão de seção transversal de um centímetro a 95 graus Celsius em água fervente e aplique a barra na região central da pele do camundongo por cinco segundos. Imediatamente após a geração da queimadura, injetar intraperitonealmente nos animais um mililitro de solução fisiológica para evitar a desidratação e permitir que os camundongos se recuperem por 24 horas antes de prosseguir com o tratamento.

Para a geração de células de retenção marcadas com BrdU ou LRCs, injete companheiros de ninhada de 10 ou 14 dias de idade por via intraperitoneal uma vez ao dia durante quatro dias consecutivos com 50 miligramas por quilograma de peso corporal de BrdU em PBS. Após a fase de rotulagem, permita que os camundongos se desenvolvam por 50 a 60 dias antes de aplicar o tratamento. Para induzir a produção transitória de espécies reativas de oxigênio não letais ou níveis de ROS na pele do camundongo para uma análise do crescimento do cabelo, após adquirir uma imagem de crescimento do cabelo de linha de base, aplique topicamente aproximadamente 25 miligramas de creme mALA na região direita da pele raspada e coloque o animal no escuro por 2,5 horas.

No final do período de tratamento com fotossensibilizador, remova completamente qualquer excesso de creme com PBS e confirme a produção de PP9 in situ por expressão de fluorescência vermelha sob excitação de luz azul e, em seguida, irradie toda a pele posterior com uma fonte de luz vermelha adequada para uma dose total de 2,5 a 4 joules por centímetro quadrado. Em seguida, permita que os ratos se recuperem em um cobertor elétrico com monitoramento até a decúbito total antes de devolver os animais às suas gaiolas. Para ativar a produção transitória de ROS para cicatrização de queimaduras de segundo grau, aplique aproximadamente 25 miligramas de creme de mALA ao longo da superfície de queimadura direita e cerca de quatro milímetros de tecido adjacente e coloque os animais no escuro por 2,5 horas, conforme demonstrado.

Depois de remover o creme, irradie toda a pele do dorso e permita que os camundongos se recuperem com o monitoramento demonstrado. Para induzir a produção transitória de ROS na pele da cauda, aplique aproximadamente 25 miligramas de creme de mALA ao longo da área do tecido dorsal dos camundongos tratados com BrdU e irradie a pele dorsal da cauda conforme demonstrado. Depois de sacrificar os camundongos, colha a pele da cauda para detecção de BrdU.

Use um bisturi para colher a cauda de cada animal, depois faça incisões longitudinais retas e descasque toda a pele como uma única peça da espinha dorsal. Incube os pedaços de pele descascados em cinco tubos de EDTA e PBS milimolares e cinco mililitros por quatro horas a 37 graus Celsius para permitir a separação cuidadosa das folhas intactas da epiderme da derme com fórceps. Fixe os tecidos separados em formaldeído a 4% e PBS por pelo menos 72 horas em temperatura ambiente.

Em seguida, rotule os tecidos fixados com os anticorpos conjugados com fluorescência de interesse antes de visualizar os tecidos por microscopia confocal de fluorescência de acordo com protocolos padrão para identificar e quantificar LRCs em cada condição experimental. Para a avaliação ex vivo da produção de ROS, após a colheita de pedaços de pele de cauda de camundongo conforme demonstrado, incubar os tecidos controle não tratados e cinco MLA milimolares de EDTA e PBS sozinhos e as amostras de tratamento fotodinâmico em EDTA suplementadas com dois milimolares de mALA. Em seguida, adicione hidroetidina a uma concentração final micromolar de 3,2 a cada conjunto de tecidos e incube todas as amostras por uma hora em temperatura ambiente no escuro.

No final da incubação, use as pontas dos dedos para esticar as amostras de pele da cauda sobre uma superfície de vidro e irradiar os tecidos tratados com 636 nanômetros de luz vermelha a uma fluência de 10 joules por centímetro quadrado. No final do tratamento, separe imediatamente a epiderme da derme e fixe as lâminas epidérmicas em 4% de formaldeído e PBS por pelo menos 72 horas em temperatura ambiente. Ao final da fixação, avaliar a emissão de 2-hidroxietídio vermelho por microscopia de fluorescência usando luz verde excitante para permitir a aquisição de imagens de alta qualidade.

Para detecção in vivo da produção de ROS na pele dorsal, logo após a irradiação da luz vermelha, aplique 100 microlitros de um miligrama por mililitro DH-FDA e 50% de etanol em todas as áreas de controle alvo e tratadas da pele. A administração tópica do precursor mALA na pele das costas e da cauda do camundongo resulta em um acúmulo significativo de protoporfirina IX em todo o tecido e visivelmente no folículo piloso, conforme demonstrado pela fluorescência rosa avermelhada deste composto sob excitação de luz azul. A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha promove a produção transitória de ROS dentro do tecido, particularmente na região da protuberância do folículo piloso.

A ativação da produção não letal de ROS na pele de camundongos in vivo promove um aumento significativo no número de LRCs na região da protuberância do folículo piloso dois dias após o tratamento fotodinâmico. Notavelmente, o aumento nos números de LRC é transitório, restaurando os níveis normais seis dias após o tratamento. A produção transitória de ROS acelera a cicatrização da pele após uma queimadura de segundo grau.

A quantificação da redução gradual da pele danificada demonstra a robustez e a significância estatística do tecido do processo de aceleração da cicatrização de feridas. Da mesma forma, os níveis não letais de ROS promovem fortemente o crescimento do cabelo após o barbear durante o segundo telógeno coordenado, uma fase durante a qual o folículo piloso é refratário a responder a estímulos de crescimento. Além disso, a produção de ROS após fototratamentos também é significativamente reduzida pela aplicação de compostos antioxidantes.

A produção de PP IX in situ por expressão fluorescente vermelha sob excitação de luz azul deve ser cuidadosamente confirmada. Para induzir a produção de ROS, a irradiância da fonte de luz vermelha deve ser estabelecida corretamente. versus tecido e dose total de luz.

Após a indução de ROS, técnicas bioquímicas e de biologia celular e molecular atuais podem ser usadas para analisar as amostras coletadas e avaliar a resposta fisiológica dinâmica do tecido. Nossa metodologia fornece uma ferramenta poderosa para investigar o efeito fisiológico de uma produção transitória de ROS endógena em um tecido in vivo. Esta é uma nova abordagem experimental que pode ser muito útil para pesquisadores no campo da sinalização de ROS.