Name: Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a induzir espécies reativas de oxigênio não letais em pele de camundongo usando luz vermelha para estimular regeneração tecidual, crescimento capilar e cicatrização de queimaduras.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 para JE) e Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 para JE) da Espanha. A EC foi apoiada pela bolsa Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidade de Madrid e UAM).

Todos os procedimentos de criação e experimentação de camundongos devem ser conduzidos em conformidade com a legislação local, nacional, internacional e diretrizes sobre experimentação animal.
1. Indução do crescimento de pelos, indução de queimaduras e identificação de LRCs de BrdU a longo prazo no epitélio da pele da cauda íntegra
NOTA: Utilizar camundongos C57BL/6 com 10 dias ou 7 semanas de idade, preferencialmente ninhadas, para os planejamentos experimentais descritos abaixo. Em todos os procedimentos experimentais, os animais serão anestesiados por inalação de isoflurano a 3% ou eutanasiados por luxação cervical conforme indicado.
<ol><li>Indução do crescimento de pelos na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)<ol><li>Anestesiar camundongos com inalação de isoflurano a 3%. Confirme a anestesia profunda completa pela falta de um reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé). Faça a barba de duas regiões independentes lado a lado da pele posterior em cada mouse usando cortadores de cabelo e creme depilatório (Tabela de Materiais). Use o lado esquerdo para o controle e o lado direito para o tratamento. NOTA: Verifique se, após o barbear, a pele subjacente do dorso está rósea e não acinzentada/preta, um indicador de melanogênese e entrada na fase anágena (crescente) nesta cepa de camundongo.</li>
		<li>Lavar cuidadosamente com PBS para remover todos os restos de creme e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito na secção 2.1.</li>
		<li>Registre o crescimento do folículo piloso através da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de controle e da pele das costas tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de lesões de queimadura de2º grau na pele posterior de camundongos na segunda fase telógena (repouso) (cerca de 50 dias pós-natal)<ol><li>Anestesiar camundongos. Faça a barba em toda a região da pele das costas em cada rato usando cortadores de cabelo e creme depilatório e lave bem com PBS para remover todos os restos de creme. OBS: Administrar injeções subcutâneas in situ de lidocaína a 0,5% (2 mg/ml) em soro fisiológico estéril, não excedendo 7 mg/ml, imediatamente antes do procedimento de queimadura.</li>
		<li>Pré-aqueça uma barra de latão (1 cm em secção transversal) a 95 °C imergindo em água fervente e, em seguida, aplique na região central da superfície dorsal da pele dorsal de cada rato durante 5 s.</li>
		<li>Logo após a geração da queimadura, injetar intraperitonealmente os animais com 1 mL de solução fisiológica (NaCl a 0,9%) em manta elétrica para evitar a desidratação. Deixar que os animais se recuperem durante 24 h e proceder à indução da produção transitória in situ de níveis não letais de ROS, conforme descrito no ponto 2.3.</li>
		<li>Registre a progressão da ferida por queimadura por meio da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas de pele das costas controladas e tratadas em cada animal (por exemplo, usando uma câmera HD acoplada a uma lente binocular de 5 a 20 vezes).</li>
	</ol></li>
	<li>Geração e identificação de LRCs de BrdU de longa duração no epitélio cutâneo da cauda<ol><li>Injetar ninhadas de 10/14 dias por via intraperitoneal (sem anestesia) uma vez por dia durante 4 dias consecutivos com 50 mg/kg de peso corporal BrdU dissolvido em PBS. Após a fase de marcação, permita que os ratos cresçam durante 50 a 60 dias antes de qualquer tratamento. NOTA: Use uma agulha nova para cada injeção.</li>
		<li>Proceder como descrito na secção 2.3 para a indução da produção transitória de ROS não letais in situ na pele da cauda em diferentes momentos antes da preparação de montagens inteiras de tecido.</li>
		<li>Para preparar montagens inteiras da epiderme da cauda, eutanasie camundongos por deslocamento cervical e prenda a cauda com tesoura cirúrgica.<ol><li>Use um bisturi para fazer uma incisão longitudinal reta ao longo de toda a cauda e descasque toda a pele como uma única peça da espinha dorsal. Incubar a pele descascada em EDTA 5 mM em PBS em tubos de 5 mL por 4 h a 37 °C e separar cuidadosamente as folhas intactas da epiderme da derme usando pinças.</li>
			<li>Fixar o tecido em formaldeído a 4% em PBS por pelo menos 72 h à temperatura ambiente (TR) e proceder à detecção de BrdU usando anticorpos apropriados.</li>
			<li>Utilizar fluorescência/microscopia confocal para identificar e quantificar LRCs em cada condição experimental, incluindo controles de luz e tratamentos fotodinâmicos em diferentes momentos antes da preparação dos tecidos inteiros, como descrito anteriormente em detalhes19,20. NOTA: As folhas epidérmicas fixas podem ser armazenadas em PBS contendo azida sódica a 0,02% a 4 °C por até três meses. Lâminas epidérmicas fixas podem ser usadas para imunolocalização das proteínas necessárias seguindo procedimentos de cortes histológicos padrão.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Indução da produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos
OBS: Para induzir a produção transitória de níveis não letais de ROS na pele de camundongos, será utilizado um tratamento fotodinâmico utilizando um precursor do fotossensibilizador endógeno PpIX, no caso, metil-aminolevulinato (mALA), e luz vermelha.
<ol><li>Para activar a produção transitória de ROS para a indução do crescimento de pelos na pele posterior, prepare os animais conforme indicado no ponto 1.1.<ol><li>Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico (Tabela de Materiais) na região direita, mantendo o lado esquerdo como controle interno evitando diferenças interindividuais. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total. NOTA: A produção de PpIX na pele posterior deve ser testada in situ pela sua fluorescência vermelha sob excitação de luz azul (407 nm).</li>
		<li>Anestesiar os animais.</li>
		<li>Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada (Tabela de Materiais) para uma dose total de 2,5−4 J/cm2. Manter os ratinhos numa manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.1.3. NOTA: A irradiância deve ser ajustada manipulando-se a distância entre a fonte de luz e o tecido e medida usando um medidor de energia de potência (Tabela de Materiais). O experimento é considerado terminado quando o crescimento total de pelos é observado em qualquer uma das regiões independentes raspadas de cada animal. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.</li>
	</ol></li>
	<li>Para ativar a produção transitória de ROS para melhorar a cicatrização de lesões de queimadura de2º grau, prepare os animais conforme indicado na seção 1.2.<ol><li>Aplicar ~25 mg de mALA na forma de creme tópico em toda a superfície queimada, abrangendo cerca de 4 mm de tecido adjacente. Incubar por 2,5 h no escuro, lavar bem o excesso de creme com PBS. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.</li>
		<li>Anestesiar os animais.</li>
		<li>Irradiar toda a pele do dorso com uma fonte de luz vermelha adequada para uma dose total de 2,5−4 J/cm2. Manter os ratinhos sobre uma manta eléctrica até à sua recuperação completa e proceder como descrito no passo 1.2.4. OBS: O procedimento experimental para cada animal é considerado concluído quando se observa a cicatrização completa da queimadura. Todo o procedimento envolve apenas um único tratamento fotográfico.</li>
	</ol></li>
	<li>Para ativar a produção transitória de ROS na pele da cauda, prepare ratinhos conforme indicado na secção 1.3, aplique ~25 mg de mALA sob a forma de creme tópico ao longo de toda a área do tecido dorsal e proceda como descrito na secção 2.1 para a pele posterior. Realizar tratamentos fotográficos e controles de luz correspondentes 24 h, 48 h ou 72 h antes da eutanásia do animal e posterior extração de montagens inteiras da pele da cauda. NOTA: Em todos os delineamentos experimentais, testar a dependência de ROS do processo usando removedores de ROS antioxidantes (por exemplo, inoculação diária de 100 mg/kg de peso corporal de N-acetil-cisteína por injeção intraperitoneal de uma solução de 20 mg/mL em PBS, pH 7,2, começando 5 dias antes dos tratamentos com mALA ou, alternativamente, duas doses de 100 mg/mL de ácido ascórbico em etanol a 50%, espaçado 30 min, aplicado topicamente sobre a pele no intervalo de tempo entre os tratamentos com mALA e a irradiação com luz vermelha).</li>
</ol>3. Detecção de ERO na pele
<ol><li>Avaliação ex vivo da produção de ERO na pele da cauda após tratamento fotodinâmico com hidroetidina NOTA: A hidroetidina é uma molécula não fluorescente que reage especificamente com ROS para produzir o corante fluorescente 2-hidroxietídio (hET).<ol><li>Incubar peles inteiras da cauda, obtidas como descrito no ponto 1.3.3, durante 3 h a 37 °C em EDTA 5 mM em solução PBS (amostras de controlo) ou adicionalmente contendo 2 mM mALA (amostras de tratamento fotodinâmico).</li>
		<li>Em todos os casos, adicionar hidroetidina a uma concentração final de 3,2 μM a partir de um estoque de 25 mg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar por 1 h no escuro em TR.</li>
		<li>Esticar as amostras de pele da cauda sobre uma superfície de vidro usando as pontas dos dedos e irradiar com luz vermelha de 636 nm a uma fluência de 10 J/cm2 .</li>
		<li>Proceder imediatamente à separação da epiderme da derme e à fixação das lâminas epidérmicas conforme descrito no ponto 1.3.3.</li>
		<li>Avalie a emissão vermelha de hET sob um microscópio de fluorescência/confocal usando luz verde excitante, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais. NOTA: Usar a coloração hET de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como um controle negativo para a auto-oxidação de hET.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção in vivo da produção de ERO na pele posterior após indução do crescimento do cabelo e cicatrização de queimaduras seguida de tratamento fotodinâmico NOTA: Esta etapa é realizada usando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DHF-DA), um composto não fluorescente persignificado celular que, após clivagem por enzimas esterases intracelulares, reage especificamente com ROS dando o corante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF).<ol><li>Utilizar animais preparados para a indução do crescimento de pelos (secção 1.1) ou para a cicatrização de queimaduras (secção 1.2). Imediatamente antes dos tratamentos tópicos com creme de mALA (ver secções 2.1 e 2.2), dispense topicamente 100 μL de 1 mg/ml em etanol a 50% de DHF-DA em todas as áreas de pele alvo de controlo/tratadas, deixe a pele absorver totalmente o material e prossiga com a aplicação tópica de creme de mALA.</li>
		<li>Incubar os animais tratados durante 4 h no escuro, lavar bem o creme mALA tópico da pele com PBS e dispensar uma segunda dose de 100 μL de solução de DHF-DA na pele. Para confirmar a profundidade da anestesia, monitorar os animais a cada 10 minutos até a recuperação total.</li>
		<li>Incubar os animais tratados por 50 min no escuro, anestesiar e irradiar toda a pele do dorso com uma fluência variando de 2,5 a 4 J/cm2 de luz vermelha de 636 nm usando uma lâmpada LED.</li>
		<li>Imediatamente após a irradiação, avaliar os níveis de ROS gerados na pele usando um sistema de imagem in vivo (Tabela de Materiais). Ajuste a caixa de filtro para excitação de 445−490 nm e emissão de 515−575 nm, capture imagens de alta qualidade e prossiga com análises adicionais. NOTA: Utilizar a coloração DHF-DA de amostras de tecido na ausência de tratamento fotodinâmico como controle negativo para a auto-oxidação de DHF-DA.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
<li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+Destroyers+or+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li>
<li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+from+health+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Medical+Weekly%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659(2012).</li>
<li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-radical+damage+theory%3A+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li>
<li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li>
<li>Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases%3A+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
<li>Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+A+radical+role+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+Passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((production+and+NF-%CE%BAB+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li>
<li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8(2013).</li>
<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
<li>Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109(2016).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li>
</ol>

Todas as aplicações comerciais dos procedimentos descritos neste trabalho estão protegidas por uma patente CSIC-UAM (EP2932967A1) de autoria da EC, MIC e JE e licenciada à Derma Innovate SL para exploração comercial. JE e JJM têm uma posição consultiva na Derma Innovate SL.

Aqui, apresentamos uma metodologia que permite uma ativação transitória da produção endógena de ERO in vivo em pele de camundongo com efeitos fisiológicos. A metodologia baseia-se em um procedimento fotodinâmico para induzir uma estimulação local e controlada do fotossensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Esta abordagem experimental é uma ferramenta interessante para estudar a biologia de ROS em sistemas experimentais in vivo, constituindo um avanço significativo sobre metodologias que ut...

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são o resultado da redução química do oxigênio molecular para formar água, e incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila 1,2,3. As ROS têm uma vida útil muito curta devido à sua natureza extremamente química reativa. Em organismos aeróbios, as ERO são formadas incidentalmente no interior das células como um importante subproduto da respiração aeróbica (cadeia de transporte de elétrons) nas mitocôndrias. O acúmulo transitório de altos níveis de ERO na célula resulta em uma condição de estresse oxidativo que pode provocar a inativação irreversível de proteínas, lipídios e açúcares e a introdução de mutações na molécula de DNA 2,3,4,5. O acúmulo gradual de dano oxidativo em células, tecidos e organismos inteiros aumenta progressivamente com o tempo e tem sido associado à indução de programas de morte celular, diversas patologias e ao processo de envelhecimento 2,3,4,6.
Os organismos aeróbios têm desenvolvido constantemente mecanismos moleculares eficientes para combater o acúmulo excessivo de ERO em células e tecidos. Esses mecanismos incluem membros da família de proteínas superóxido dismutase (SOD), que catalisam a dismutação do radical superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio, bem como diferentes catalases e peroxidases que utilizam o pool antioxidante (glutationa, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina 7,8) para catalisar a subsequente conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular.
No entanto, vários relatos suportam o papel das ROS como componentes-chave de circuitos moleculares que regulam funções celulares críticas, incluindo proliferação, diferenciação emobilidade2,3,4. Esse conceito é ainda apoiado pela identificação e caracterização inicial de mecanismos dedicados produtores de ERO em organismos aeróbios, incluindo lipoxigenases ciclooxigenases e NADPH oxidases 9,10. Nesse sentido, as ERO exibem um papel ativo durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados 11,12,13 e papéis fundamentais para essas moléculas na regulação de funções fisiológicas específicas in vivo têm sido relatados em diferentes sistemas experimentais, incluindo o programa de diferenciação de progenitores hematopoéticos em Drosophila14, indução de cura em zebrafish ou regeneração da cauda em girinos de Xenopus 15. Em mamíferos, as ROS têm sido envolvidas no potencial de auto-renovação/diferenciação de células-tronco neurais em um modelo de neuroesfera16 e na desregulação da função das células-tronco intestinais durante o início do câncer colorretal17. Na pele, a sinalização das ERO tem sido associada à diferenciação epidérmica e à regulação do nicho de células-tronco cutâneas e do ciclo de crescimento dos folículos pilosos18,19.
Nessa perspectiva, uma grande limitação experimental para determinar os papéis fisiológicos das ROS em sistemas biológicos, tanto em condições normais quanto patológicas, é a falta de ferramentas experimentais adequadas para induzir a produção controlada dessas moléculas em células e tecidos, assemelhando-se com precisão à sua produção fisiológica como mensageiros de segunda sinalização. Atualmente, a maioria das abordagens experimentais envolve a administração de ERO exógenas, principalmente na forma de peróxido de hidrogênio. Recentemente, implementamos uma abordagem experimental para ativar uma produção in vivo transitória e não letal de ROS endógenas na pele de camundongos, baseada na administração de precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por exemplo, ácido aminolaevulínico ou seu derivado metílico metilaminolevulinato) e posterior irradiação da amostra com luz vermelha para induzir a formação in situ de ROS a partir de oxigênio molecular intracelular (Figura 1). Esse procedimento fotodinâmico pode ser eficientemente utilizado para estimular nichos de células-tronco residentes, ativando os programas regenerativos do tecido19,20 e abrindo caminho para novas modalidades terapêuticas na medicina regenerativa da pele. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo, mostrando exemplos representativos de estimulação de nichos de células-tronco, medida como um aumento no número de células de retenção de marcação (LRCs) de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a longo prazo na região do abaulamento do folículo piloso19,21, e subsequente ativação de programas de regeneração (aceleração do crescimento do cabelo e processos de cicatrização de queimaduras) induzidos por produção não letal de ERO na pele da linhagem C57Bl6 de camundongos.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diclorofluorescina diacetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeoxiuridina-Fluoresceína</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório (por exemplo, Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem in vivo, por exemplo, IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA na forma de creme tópico, por exemplo, METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Medidor de energia Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power (por exemplo, ThorLabs Modelo PM100D)ThorLabs</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fonte de luz vermelha, por exemplo, lâmpada LED Aktilite de 636 nm</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina ix comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir fotogeração in vivo comutável de espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) em pele de camundongos. Essa produção transitória de ERO in situ ativa eficientemente a proliferação celular em nichos de células-tronco e estimula a regeneração tecidual, fortemente manifestada através da aceleração dos processos de cicatrização de queimaduras e crescimento de folículos pilosos. O protocolo é baseado em um tratamento fotodinâmico regulável que trata o tecido com precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX e irradia o tecido com luz vermelha sob parâmetros físico-químicos rigorosamente controlados. De modo geral, este protocolo constitui uma ferramenta experimental interessante para analisar a biologia das EROs.

A administração tópica do precursor mALA na pele do dorso e da cauda de camundongos resulta em acúmulo significativo de PpIX em todo o tecido e, visivelmente, no folículo piloso, como demonstrado pela fluorescência vermelho-rósea desse composto sob excitação à luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha (636 nm) a uma fluência de 2,5−4 J/cm2 promove a produção transitória de ERO no tecido, particularmente na região ...

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Nossa metodologia é a primeira a fornecer uma ferramenta experimental confiável para induzir uma ativação transitória de uma espécie reativa endógena de oxigênio ou produção de ROS em um tecido in vivo. Nossa metodologia fornece um procedimento robusto, fácil de usar e não invasivo, produzindo uma produção consistente de níveis fisiológicos de ROS estimulantes na pele basicamente usando uma fonte de luz vermelha. À medida que a indução fisiológica de ROS na pele atinge as necessidades do caule do tecido, aplicamos ainda mais nossa metodologia para terapia de regeneração da pele, incluindo boa cicatrização e crescimento do cabelo.A biologia e sinalização de ROS é atualmente um pote de pesquisa. Uma grande limitação para investigar a função das EROs in vivo é a falta de ferramentas adequadas para induzir uma produção endógena controlada de EROs. NOSSA metodologia é amigável e fácil, mas todos os dispositivos, lâmpadas, IV, IS, etc., precisam ser calibrados adequadamente.Os precursores químicos críticos devem ser frescos e todas as etapas do protocolo devem ser rigorosamente seguidas. Para induzir o crescimento de pelos na pele dorsal de camundongos na segunda fase telógena, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal em camundongos C57 pretos de seis camundongos pós-natal por volta do dia 50, use uma navalha e creme depilatório para remover duas regiões independentes lado a lado da pele da parte de trás de cada camundongo. Após alguns minutos, retire o creme com PBS e registre o crescimento do folículo piloso através da aquisição diária de imagens de alta resolução das áreas controle e tratadas da pele dorsal de cada animal.Para induzir a geração de lesões de queimaduras de segundo grau na pele dorsal de camundongos na segunda fase telógena, remova o cabelo do dorso do camundongo. Pré-aqueça uma barra de latão de seção transversal de um centímetro a 95 graus Celsius em água fervente e aplique a barra na região central da pele do camundongo por cinco segundos. Imediatamente após a geração da queimadura, injetar intraperitonealmente nos animais um mililitro de solução fisiológica para evitar a desidratação e permitir que os camundongos se recuperem por 24 horas antes de prosseguir com o tratamento.Para a geração de células de retenção marcadas com BrdU ou LRCs, injete companheiros de ninhada de 10 ou 14 dias de idade por via intraperitoneal uma vez ao dia durante quatro dias consecutivos com 50 miligramas por quilograma de peso corporal de BrdU em PBS. Após a fase de rotulagem, permita que os camundongos se desenvolvam por 50 a 60 dias antes de aplicar o tratamento. Para induzir a produção transitória de espécies reativas de oxigênio não letais ou níveis de ROS na pele do camundongo para uma análise do crescimento do cabelo, após adquirir uma imagem de crescimento do cabelo de linha de base, aplique topicamente aproximadamente 25 miligramas de creme mALA na região direita da pele raspada e coloque o animal no escuro por 2,5 horas.No final do período de tratamento com fotossensibilizador, remova completamente qualquer excesso de creme com PBS e confirme a produção de PP9 in situ por expressão de fluorescência vermelha sob excitação de luz azul e, em seguida, irradie toda a pele posterior com uma fonte de luz vermelha adequada para uma dose total de 2,5 a 4 joules por centímetro quadrado. Em seguida, permita que os ratos se recuperem em um cobertor elétrico com monitoramento até a decúbito total antes de devolver os animais às suas gaiolas. Para ativar a produção transitória de ROS para cicatrização de queimaduras de segundo grau, aplique aproximadamente 25 miligramas de creme de mALA ao longo da superfície de queimadura direita e cerca de quatro milímetros de tecido adjacente e coloque os animais no escuro por 2,5 horas, conforme demonstrado.Depois de remover o creme, irradie toda a pele do dorso e permita que os camundongos se recuperem com o monitoramento demonstrado. Para induzir a produção transitória de ROS na pele da cauda, aplique aproximadamente 25 miligramas de creme de mALA ao longo da área do tecido dorsal dos camundongos tratados com BrdU e irradie a pele dorsal da cauda conforme demonstrado. Depois de sacrificar os camundongos, colha a pele da cauda para detecção de BrdU.Use um bisturi para colher a cauda de cada animal, depois faça incisões longitudinais retas e descasque toda a pele como uma única peça da espinha dorsal. Incube os pedaços de pele descascados em cinco tubos de EDTA e PBS milimolares e cinco mililitros por quatro horas a 37 graus Celsius para permitir a separação cuidadosa das folhas intactas da epiderme da derme com fórceps. Fixe os tecidos separados em formaldeído a 4% e PBS por pelo menos 72 horas em temperatura ambiente.Em seguida, rotule os tecidos fixados com os anticorpos conjugados com fluorescência de interesse antes de visualizar os tecidos por microscopia confocal de fluorescência de acordo com protocolos padrão para identificar e quantificar LRCs em cada condição experimental. Para a avaliação ex vivo da produção de ROS, após a colheita de pedaços de pele de cauda de camundongo conforme demonstrado, incubar os tecidos controle não tratados e cinco MLA milimolares de EDTA e PBS sozinhos e as amostras de tratamento fotodinâmico em EDTA suplementadas com dois milimolares de mALA. Em seguida, adicione hidroetidina a uma concentração final micromolar de 3,2 a cada conjunto de tecidos e incube todas as amostras por uma hora em temperatura ambiente no escuro.No final da incubação, use as pontas dos dedos para esticar as amostras de pele da cauda sobre uma superfície de vidro e irradiar os tecidos tratados com 636 nanômetros de luz vermelha a uma fluência de 10 joules por centímetro quadrado. No final do tratamento, separe imediatamente a epiderme da derme e fixe as lâminas epidérmicas em 4% de formaldeído e PBS por pelo menos 72 horas em temperatura ambiente. Ao final da fixação, avaliar a emissão de 2-hidroxietídio vermelho por microscopia de fluorescência usando luz verde excitante para permitir a aquisição de imagens de alta qualidade.Para detecção in vivo da produção de ROS na pele dorsal, logo após a irradiação da luz vermelha, aplique 100 microlitros de um miligrama por mililitro DH-FDA e 50% de etanol em todas as áreas de controle alvo e tratadas da pele. A administração tópica do precursor mALA na pele das costas e da cauda do camundongo resulta em um acúmulo significativo de protoporfirina IX em todo o tecido e visivelmente no folículo piloso, conforme demonstrado pela fluorescência rosa avermelhada deste composto sob excitação de luz azul. A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha promove a produção transitória de ROS dentro do tecido, particularmente na região da protuberância do folículo piloso.A ativação da produção não letal de ROS na pele de camundongos in vivo promove um aumento significativo no número de LRCs na região da protuberância do folículo piloso dois dias após o tratamento fotodinâmico. Notavelmente, o aumento nos números de LRC é transitório, restaurando os níveis normais seis dias após o tratamento. A produção transitória de ROS acelera a cicatrização da pele após uma queimadura de segundo grau.A quantificação da redução gradual da pele danificada demonstra a robustez e a significância estatística do tecido do processo de aceleração da cicatrização de feridas. Da mesma forma, os níveis não letais de ROS promovem fortemente o crescimento do cabelo após o barbear durante o segundo telógeno coordenado, uma fase durante a qual o folículo piloso é refratário a responder a estímulos de crescimento. Além disso, a produção de ROS após fototratamentos também é significativamente reduzida pela aplicação de compostos antioxidantes.A produção de PP IX in situ por expressão fluorescente vermelha sob excitação de luz azul deve ser cuidadosamente confirmada. Para induzir a produção de ROS, a irradiância da fonte de luz vermelha deve ser estabelecida corretamente. versus tecido e dose total de luz.Após a indução de ROS, técnicas bioquímicas e de biologia celular e molecular atuais podem ser usadas para analisar as amostras coletadas e avaliar a resposta fisiológica dinâmica do tecido. Nossa metodologia fornece uma ferramenta poderosa para investigar o efeito fisiológico de uma produção transitória de ROS endógena em um tecido in vivo. Esta é uma nova abordagem experimental que pode ser muito útil para pesquisadores no campo da sinalização de ROS.

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Biology

Biologia

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

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Tradicionalmente, a cultura celular é realizada em substratos planares que imitam mal o ambiente natural das células in vivo. Aqui descrevemos um método para produzir substratos de cultura celular com geometrias curvas fisiologicamente relevantes e proteínas extracelulares micropatteradas, permitindo investigações sistemáticas sobre o sensoriamento celular dessas pistas extracelulares.

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Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando o uso de hidrogel como uma estrutura de cultura de células tridimensional (3D) para cultura de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) e introduzindo fotobiomodulação (PBM) para aumentar a proliferação de ADSCs dentro do ambiente de cultura 3D.

Cultura Celular Tridimensional de Células-Tronco Derivadas do Tecido Adiposo em Hidrogel com Aumento da Fotobiomodulação

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Este protocolo descreve um método para produzir organoides da pele contendo folículos pilosos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido planar e fisiologicamente relevante para replicar a arquitetura e a função da pele.

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

Esse método estuda como fibroblastos cutâneos senescentes afetam os saudáveis. A senescência é induzida por exposição à UVB, e o meio condicionado é aplicado aos fibroblastos normais. Ele ajuda a avaliar compostos bioativos que visam a comunicação celular alterada no envelhecimento da pele.

Nova combinação de antioxidantes para restaurar a comunicação intercelular saudável em um modelo in vitro usando meio condicionado de células senescentes

Aprenda a induzir espécies reativas de oxigênio não letais em pele de camundongo usando luz vermelha para estimular regeneração tecidual, crescimento capilar e cicatrização de queimaduras.

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Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

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