Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

A adesão do paciente é muito desafiadora e o metabolismo medicamentoso pode variar de pessoa para pessoa, de modo que a medição objetiva dos níveis de medicamentos pode ser importante na prevenção do surgimento da resistência durante o tratamento da TB. Se a adesão pudesse ser mais precisa e facilmente quantificada, então os profissionais de saúde poderiam desenvolver um plano de tratamento que limitasse o desenvolvimento da resistência a medicamentos. Desenvolvemos o primeiro painel de espectrometria de massa de analito múltiplo para múltiplos medicamentos para TB dentro de pequenas amostras de cabelo em um único ensaio.

Nosso painel multidrogas requer apenas uma amostra de dois miligramas por paciente e não usa extração de fase sólida ou etapa de filtragem para evitar qualquer perda de volume amostral. Medidas objetivas de exposição a medicamentos medidas no início do curso de tratamento poderiam potencialmente alertar os médicos para problemas com medicamentos individuais no regime de tratamento. As amostras de cabelo devem ser pulverizadas no dia da análise para uma medição precisa do nível de concentração de drogas.

Para adquirir amostras de cabelo, após obter o consentimento por escrito informado, prepare os materiais, incluindo um rótulo fino, dois rótulos participantes, um par de tesouras, um pedaço desdobrado de papel alumínio, um lenço de álcool e um saco plástico. Limpe as lâminas da tesoura com um lenço de álcool. Vá para a parte de trás da cabeça e levante a parte superior do cabelo usando um grampo de cabelo, se desejar.

Reúna 30 fios de cabelo da parte de trás da cabeça e isole a palha com a mão. Leve a tesoura até o couro cabeludo e corte a palha do cabelo. Coloque cuidadosamente a palha do cabelo na folha de alumínio.

Coloque o rótulo fino sobre a extremidade distal da palha do cabelo, gravando-a firmemente na folha de alumínio. A extremidade distal é o lado mais distante do couro cabeludo. Dobre sobre o pedaço de papel alumínio em cima da palha do cabelo e coloque uma etiqueta participante em cima da folha de alumínio.

Coloque o pedaço dobrado sobre a folha de alumínio no saco plástico e coloque outra etiqueta participante em cima do saco plástico. Para extração de drogas das amostras de cabelo, pese dois miligramas de cada amostra de cabelo em tubos de contas rotulados individualmente e dois miligramas da amostra de cabelo em branco em cada um dos 16 tubos adicionais de contas. Após a pesagem, coloque todos os tubos de contas em um homogeneizador de moinho de contas e homogeneize as amostras a uma velocidade de 6,95 metros por segundo para dois ciclos de 30 segundos com um período de descanso de 15 segundos entre cada ciclo.

Após a segunda homogeneização, adicione 500 microliters da mistura padrão interna apropriada a cada amostra e adicione 500 microliters de metanol ao tubo em branco da matriz. Espete os tubos de curva de calibração com o volume apropriado de mistura padrão de referência de acordo com a mesa e coloque todos os tubos em um banho de água de 37 graus com agitação suave por duas horas. No final da incubação, transfira o supernascer de cada tubo de contas para novos tubos de microcentrifuuge rotulados e adicione 500 microliters de metanol aos tubos de contas.

Vórtice dos tubos de contas e transfira a lavagem de metanol para os tubos de microcentrifuuge correspondentes. Centrifugar as amostras e transferir cuidadosamente os supernantes para novos tubos sem perturbar as pelotas de cabelo. Evaporar o líquido nos tubos até secar a 32 graus Celsius e reconstituir as amostras com 200 microliters de água de grau de cromatografia líquida de alta pressão com ácido 1% fórmico.

Após o vórtice, transfira as amostras líquidas para frascos âmbar com 250 inserções de microliteres. Para a espectrometria de massa de cromatografia líquida, instale primeiro uma coluna de dois a 100 milímetros com tamanho de partícula de 2,5 micrômetros e tamanho de 100 poros angstrom com contas de fenol etherlinked polar totalmente feitas de sílica porosa no compartimento da coluna. Confirme se a coluna também tem um cartucho de guarda recomendado pelo fabricante instalado.

Copie e cole as informações compostas incluídas nas transições do método LCMS MDR-TB. arquivo csv na caixa na janela de especificação de massa. Em uma planilha, crie uma sequência em lote da curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração e controles de qualidade.

Adicione injeções em branco de solvente no início e no final da corrida, bem como antes e depois da curva de calibração, controles de qualidade e amostras do paciente. Em seguida, coloque pelo menos oito injeções em branco de solvente nas injeções na curva de calibração e no frasco de controle de alta qualidade para reduzir a transferência de analito. Quando os lotes terminarem, abra o software de quantitação.

Role as transições para garantir que o tempo de retenção selecionado automaticamente seja preciso e verifique se a suavização gaussiana está definida como 1.5. Em seguida, clique em exibir a curva de calibração e a regressão e defina o tipo de espera para um sobre x. Clique em OK e valide a curva de calibração e as amostras de controle de qualidade para garantir que o lote seja ranuado com sucesso.

Para cada analito de referência do quantificador, pelo menos dois terços dos pontos de calibração devem ter uma precisão dentro de 80-120% Verifique se o valor R exibido acima da curva de calibração é superior a 0,975. Se todas as condições acima estiverem satisfeitas, o lote passou e as amostras podem ser quantificadas. Clique em Editar na barra de ferramentas e clique em Copiar a tabela inteira.

Em seguida, cole a tabela em uma planilha e use a média da concentração calculada das duas injeções amostrais para determinar a concentração relatada de cada amostra. Aqui é mostrada uma ilustração de um cromatograma com níveis confirmados de todos os 11 medicamentos resistentes a medicamentos resistentes a medicamentos. Nestas figuras, podem ser observados cromatogramas de íons extraídos para uma determinada droga em um dos calibradores.

As transições do quantificador e da qualificação são utilizadas para confirmar qualitativamente a presença da droga, pois a razão entre a área do quantificador e a área de qualificação permanece a constante entre as amostras. O padrão interno também é monitorado para garantir que cada injeção de amostra seja normalizada. Nesta análise, uma amostra conveniente de 15 amostras de cabelo entre uma população total de 96 pacientes que tomam medicamentos resistentes a medicamentos para TB sob condições terapêuticas diretamente observadas do Cabo Ocidental, África do Sul foi avaliada para determinar níveis representativos de medicamentos resistentes a medicamentos para TB nos níveis mais baixos e mais altos para cada analito.

Na ausência de uma fase sólida de extração ou etapa de filtragem, tome cuidado ao transferir o sobrenatante para os tubos de evaporação. Qualquer coisa transferida para os tubos pode acabar injetada na coluna. Como o rotor do raptor de contas pode voar se não estiver bem aparafusado ou bloqueado, certifique-se de verificar novamente o rotor antes de operar.

Em contraste com os antirretrovirais no campo do HIV, a relação entre a farmacocinética medicamentosa de TB, a adesão e os desfechos clínicos permanece em grande parte não estudada. Temos a hipótese de que alguns medicamentos para tuberculose não se acumulam bem no cabelo. Direcionar os metabólitos dessas drogas pode proporcionar uma melhor compreensão da adesão do paciente.