Dois diferentes paradigmas de preferência em tempo real usando optogenética dentro da área tegmental ventral do mouse

Nós aqui fornecemos um protocolo detalhado para avaliar as propriedades gratificantes ou aversivas da estimulação genética de uma região cerebral específica. A técnica pode responder rapidamente se a estimulação de células específicas é gratificante ou aversiva. Descrevemos a configuração para estimular a área tegmental ventral, mas nossos protocolos podem ser facilmente adaptados para alterar parâmetros específicos em termos de diferentes regiões estudadas.

Para começar, use microcontroladores de placa única para controlar a fonte de laser. Carregue o script na placa de microcontrolador usando o cabo de conexão apropriado para o computador. O script inclui modulação externa proveniente do software de rastreamento através de uma caixa TTL, e uma saída para o laser para controlar parâmetros de estimulação.

Use um cabo de rede para conectar a caixa TTL à placa. Certifique-se de que o laser está configurado para controlar por modulação externa e conecte o laser à placa usando um cabo FC/PC. Conecte os pinos apropriados às partes do solo da placa.

Para conectar a fonte laser à fibra óptica, primeiro conecte a fonte de laser a uma junta rotativa. Conecte um cabo de remendo à junta rotativa. Estabilize a junta rotativa acima do aparelho, mas fora da área de gravação.

Certifique-se de que o comprimento do cabo de remendo de fibra óptica é apropriado para permitir que o mouse se mova sem dificuldades na arena. Para calibrar a configuração da arena, use uma régua para medir uma parte específica do aparelho físico. No software, desenhe uma linha correspondente à peça medida.

Na escala Desarmes para Calibrar a guia, digite o valor já conhecido. Projete a arena, desenhe a área onde o movimento dos ratos será registrado. Crie as zonas, desenhe as zonas que eventualmente serão atribuídas como emparelhadas a laser, não-não-sem corte a laser e neutras.

Pressione o botão Validar a configuração para validar a configuração para confirmar se não há parâmetros conflitantes, por exemplo, zonas fora da arena. Certifique-se de que o controle de hardware está ativado e defina o tempo do experimento para 30 minutos, para a opção repetir até as configurações da caixa de referência. Atribua um compartimento como emparelhado a laser, no qual a entrada do mouse acionará um sinal TTL através do software de rastreamento para a placa de microcontrolador sob as configurações da condição.

Para modificar a configuração para a abordagem de preferência do compartimento neutro, após a configuração da arena e do tempo, atribua as zonas A e B como emparelhadas a laser adicionando quando o ponto central estiver em qualquer zona A e zona B para a caixa de condição relacionada às configurações dos compartimentos A e B. Para configurar as configurações de detecção, use um boneco para se assemelhar ao mouse. Coloque o boneco em um compartimento do aparelho e use a configuração automatizada com subtração dinâmica.

Remova o boneco e coloque-o no compartimento oposto. Certifique-se de que o boneco está totalmente detectado. Coloque o boneco no compartimento emparelhado com laser.

Para verificar se a estimulação funciona, comece a aquisição usando as configurações de controle de ensaio configuradas anteriormente e veja se a estimulação é acionada como deveria. Em seguida, coloque o boneco no compartimento não pago ou neutro, e veja se a estimulação está parada. Use o botão no laser para definir a potência laser para 10 miliwatts.

Conecte o implante de fibra óptica ao cabo de remendo de fibra óptica usando uma manga cerâmica e coloque o mouse no compartimento neutro do aparelho de três compartimentos. Aguarde até que o mouse seja detectado pelo software. Remova as portas de correr vertical que impedem o animal de entrar nos compartimentos principais.

Permita que o animal explore livremente sem distúrbios. Todo o experimento de preferência do lugar em tempo real ocorre ao longo de oito sessões. Os camundongos DAT-Cre injetados com o vírus EYFP de canal de AAV na área tegmental ventral foram testados para atingir neurônios dopaminérgicos.

Os camundongos passaram em média cerca de 70% do seu tempo no compartimento emparelhado a laser, em oposição ao compartimento não pago a 20% e ao compartimento neutro em 10%Um fenótipo comportamental oposto foi observado com ratos Vglut2-Cre injetados com EYFP canal de canal de AAV na área tegmental ventral. Os ratos evitaram o compartimento emparelhado com a estimulação, e passaram mais tempo no não pago. Durante as respostas condicionadas dias cinco e oito, os ratos não mostraram uma clara evitação do compartimento anteriormente emparelhado.

Para demonstrar ainda mais o papel gratificante ou aversivo dos neurônios específicos, o método descrito pode ser elogiado com outros métodos, como paradigmas operon, ou subestimulação fotogenética. Preste atenção durante o manuseio de vírus e quando você usa fontes de laser.