Microwaving e Fluorophore-Tyramide para Imunocoloração Multiplex em Adrenals de camundongos − Usando Anticorpos primários conjugados da mesma espécie hospedeira

A imunosstaining é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para identificar a localização de uma proteína de interesse. A imunosstaining multiplex pode detectar vários alvos na mesma amostra usando diferentes anticorpos primários. O benefício deste método é o uso de buffers comumente disponíveis para eliminar a reatividade cruzada de anticorpos permitindo imunossuagem usando dois ou mais anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira.

Demonstrando o procedimento estarão Sophia Zheng, uma estudante de pós-graduação, e Qiongxia Lyu, uma estudiosa visitante do meu laboratório. Antes de coloração, depilação e deslizamentos embutidos de parafina fixas formalina com imersões de cinco minutos em cada solução, conforme indicado. Após a segunda imersão de água destilada, coloque os slides em 275 mililitros de solução de citrato de sódio fervente na parte inferior de uma caixa de ponta de pipeta com tampa e coloque a caixa em um micro-ondas de 700 watts com 75% de potência por oito minutos.

No final do tratamento, abra a tampa e deixe a solução esfriar à temperatura ambiente antes de lavar os slides com três lavagens de cinco minutos de PBST fresco em um frasco de Coplin. Para bloquear quaisquer locais de ligação não específicos, após a última lavagem agite o excesso de PBST de cada slide e cubra os slides com um volume suficiente de uma solução de bloqueio apropriada. Após 30 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada, agite a solução de bloqueio em excesso de cada slide e adicione 250 microliters do primeiro anticorpo primário de interesse a cada amostra.

Para evitar que as amostras sequem, os slides podem ser cobertos por um pedaço de filme de parafina. Depois de uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada, lave os slides três vezes com PBST fresco por cinco minutos por lavagem. Retire o excesso de PBST e cubra rapidamente cada slide com 250 microliters de uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de uma hora em uma câmara umidificada à temperatura ambiente.

No final da incubação, lave os slides três vezes em PBST fresco como demonstrado e adicione 250 microliters de peroxidase de rabanete streptavidin recém-preparada a cada slide. Depois de 30 minutos em temperatura ambiente, lave os slides três vezes em PBST fresco. Em seguida, retire o excesso de PBST e cubra cada slide com 250 microliters de solução de fluoroforida recém-preparada.

Um minuto depois, submergir os slides em PBST fresco seguido de três lavagens de dois minutos em PBST fresco. Após a última lavagem, aplique algumas gotas de uma solução de glicerol-PBS de um para um nas seções e verifique se há a presença de um sinal de fluorescência por microscopia de fluorescência. Para retirar o primeiro complexo de anticorpos, coloque os slides rotulados de anticorpos em 275 mililitros de solução de citrato de sódio fervente por pelo menos oito minutos, como demonstrado.

Ao final do tratamento, abra a tampa e deixe a solução esfriar à temperatura ambiente antes de lavar os slides três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem. Para manchar para o segundo alvo proteína de interesse, após o bloqueio para vinculação inespecífica como demonstrado, rotule cada amostra com 250 microliters do segundo anticorpo primário de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave os slides três vezes por cinco minutos em PBST fresco por lavagem antes de cobrir cada slide com 250 microliters de uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de uma hora a temperatura ambiente.

No final da incubação, lave os slides três vezes em PBST fresco como demonstrado e adicione 250 microliters de peroxidase de rabanete streptavidin recém-preparada a cada slide. Para desenvolver o sinal para a segunda proteína alvo de interesse, depois de três lavagens PBST, trate os slides com o tirado conjugado fluoróforo em um espectro diferente de fluorescência. Para impedir o desenvolvimento do sinal de tiradoide, submergir os slides no PBST.

Em seguida, manche as amostras com um corante nuclear apropriado. Para a imagem por microscopia de fluorescência, monte cada lâmina de corante nuclear rotulada com uma gota de um meio de montagem apropriado em uma mancha de cobertura. Use o objetivo 4X para localizar o tecido na lâmina.

Mude para o objetivo de 10X para imagem e ajuste o tempo de exposição para 100 a 400 milissegundos com a fonte de luz entre 40 e 80% de intensidade. Em seguida, obtenha imagens em cada canal sem mover o palco. As imagens de cada canal podem ser mescladas para formar uma imagem fluorescente multiplex.

Sem descascar entre a primeira e a coloração secundária de anticorpos, a segunda mancha para hidroxilase de tiranosina captará sinais da proteína de primeiro alvo de interesse resultando em uma falsa mancha de hidroxilase tyrosina positiva, por exemplo, nesta amostra dentro do córtex adrenal. Para remover a reatividade cruzada de anticorpos no peroxidase de rabanete da primeira imunostaining, um minuto e oito minutos de descascamento mediado por micro-ondas podem ser realizados resultando em resultados limpos de coloração dupla. Nenhum sinal significativo é captado em amostras de controle negativos.

A desmontagem de oito minutos no tampão de citrato fervente também é suficiente para eliminar a reatividade cruzada de anticorpos para muitos anticorpos comumente usados na glândula suprarrenal. Em alguns casos, um sinal falso positivo fraco ainda é detectável, no entanto, e um aumento de 20 minutos para o tratamento de micro-ondas ainda pode não remover completamente o anticorpo cross-reatividade. Durante a imagem de fluorescência, é importante não mover o palco ao trocar de canal.

No entanto, pode ser necessário reajustar o foco para obter imagens claras de cada canal. Para cada canal, certifique-se de ajustar o tempo de exposição para garantir que os sinais sejam adequadamente expostos sem pixels ou áreas superexpostas nas imagens. Durante o procedimento de coloração, é importante manter os slides hidratados da depilação e os slides podem ser despojados usando os mesmos métodos de descascamento várias vezes para permitir a coloração multiplex.