Name: Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda a cultivar xenoenxertos derivados do paciente em hidrogéis 3D com plataforma microfluida perfusada. Este método melhora a viabilidade celular e permite triagem de fármacos em alta vazão para oncologia.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde National Cancer Institute Fase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.

O tecido tumoral foi obtido com o consentimento do paciente e de acordo com um protocolo aprovado do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Os xenoenxertos foram implantados, cultivados e colhidos de acordo com um protocolo aceito do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
NOTA: Todo o trabalho deve ser realizado em um armário de segurança biológica estéril para manter a esterilidade. Todas as etapas devem ser conduzidas à temperatura ambiente, a menos que seja especificada de outra forma.
1. Preparação de materiais para processamento de PDX
<ol><li>Fórceps autoclave e alça de bisturi ou lâminas de barbear.</li>
	<li>Solução de enzima dissociação de descongelamento a 4 °C durante a noite ou à temperatura ambiente no mesmo dia que a dissociação do tecido. NOTA: O degelo a 37 °C não é aconselhável, pois isso pode inativar algumas enzimas de dissociação.</li>
	<li>Prepare pelo menos 100 mL de meio de cultura PDX (mistura de nutrientes médios-nutrientes de Dulbecco F-12 [DMEM-F12] com penicilina U/mL de 100 U/mL e estreptomicina e 30% soro bovino fetal [FBS]), e pelo menos 25 mL de meio de processamento PDX (DMEM-F12 com penicilina u/mL 100 U/mL e estreptomicina e sem FBS). Armazene a 4 °C até ficar pronto para usar.</li>
</ol>2. Dissociação pdx e purificação inicial do componente estromal
<ol><li>Reúna utensílios autoclavados, filtros de células de 70 μm (2-3), pratos de cultura de tecido redondo de 60 mm (2), placas de cultura tecidual de 6 poços, tubos de centrífugas cônicas estéreis de 1x fosfato (PBS). Cultura quente de média a 37 °C e permitir que a solução de enzima dissociação chegue à temperatura ambiente.</li>
	<li>Quando o tecido PDX atingir um diâmetro de 1,0-1,5 cm em um hospedeiro do camundongo, remova cirurgicamente o tumor do camundongo por meios padrão (por exemplo, sob anestesia aceita) e armazene no gelo em um tubo de 50 mL com meio de cultura PDX(Figura 2A). Processe o tecido prontamente, através das etapas abaixo, para maximizar a viabilidade celular, de preferência dentro de 1-2 h após a colheita.</li>
	<li>Transfira tecido tumoral para um tubo cônico pré-pesado de 50 mL. Enxágüe 6x com 30 mL de PBS estéril para remover sangue e contaminantes. Remova o máximo de líquido possível e pese o tecido tumoral.</li>
	<li>Transfira o tecido tumoral para um prato de cultura de tecido redondo de 60 mm e pique em ~1 mm3 pedaços usando uma lâmina de barbear estéril ou bisturi.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio de processamento PDX para coletar chorume tumoral e transfira para um novo tubo estéril de 50 mL. Enxágüe o prato de cultura com mais 5 mL de meio de processamento PDX, em seguida, com solução de enzima dissociação (tumor de 10 mL/g, pelo menos 5 mL), adicionando todas as enxágues ao tubo de 50 mL.</li>
	<li>Incubar 20 min a 37 °C com agitação suave. Gire o tubo suavemente no meio do tempo de incubação.</li>
	<li>Pipeta para cima e para baixo suavemente com uma pipeta sorológica para quebrar aglomerados. Células filtradoras com um coador de células de 70 μm colocado sobre um novo tubo estéril de 50 mL. NOTA: Pode ser necessário mais de um filtro.</li>
	<li>Centrífuga a 200 x g por 5 min para células de pelota. Remova o supernatante e resuspend em 2-3 mL de meio de cultura PDX. Conte células usando um hemótmetro ou contador de células automatizada.</li>
	<li>Use a Tabela 1 para estimar o número necessário de células derivadas do PDX dissociadas necessárias para alcançar a densidade celular desejada por chip. NOTA: Os valores na Tabela 1 destinam-se a ser um ponto de partida. Os valores reais variam devido à viabilidade/celularidade tecidual e perda celular de congelamento/recuperação. Os tumores PDX são indivíduos mesmo dentro de um dado tipo de câncer, então esses valores devem ser ajustados empiricamente.</li>
	<li>Do número calculado na etapa 2.9, placa 1-2 x 106 células em 5 mL de cultura PDX média por poço de uma placa de cultura tecidual de 6 poços. Incubar (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade) por 48h com agitação suave (50-55 rpm) para promover a formação de cluster(Figura 2B). Após a formação do cluster, prossiga para a seção 3 para centrifugação.</li>
	<li>Criopreserve células PDX nãousadas da dissociação inicial em 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% de sulfóxido de dimetil (DMSO) ou um meio de congelamento de células primárias comercialmente disponível. NOTA: As células estromais do rato aderente também podem ser recuperadas da superfície da placa de tecido, se desejar, enxaguando brevemente com meio de cultura e expandindo por meios padrão.</li>
	<li>Para uso posterior de células tumorais PDX criopreservadas/estroma de rato, descongelar células em um banho de água de 37 °C por 2 min. Conde e placa em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, conforme descrito na etapa 2.10 antes de prosseguir para a seção 3. Aumente o número de células PDX em ~20% para acomodar perdas de viabilidade da criopreservação.</li>
</ol>3. Separação baseada em centrifugação de gradiente de densidade de aglomerados derivados do PDX de células únicas
<ol><li>Prepare 20 mL de solução de gradiente de densidade de 100% misturando completamente 18 mL de solução de centrifugação de gradiente de densidade com 2 mL de solução de sal balanceada de 10x estéril da Hanks (HBSS) em um tubo cônico estéril de 50 mL. Faça 10 mL cada um de 20%, 30%, 40% e 55% de soluções gradientes de densidade diluindo esta solução 100% com HBSS estéril e misturando bem. NOTA: Estes volumes são suficientes para dois gradientes de 15 mL que podem ser usados para separar ~15 x 106 células cada. Se separar menos de ~15 x 106 células, o segundo gradiente deve ser usado como um equilíbrio para centrifugação.</li>
	<li>Adicione 3 mL de solução gradiente de densidade de 55% ao fundo de um tubo cônico de 15 mL. Segurando o tubo em um ângulo, muito suavemente camada 3 mL de 40% de solução de gradiente de densidade em cima da camada de 55%, lentamente distribuindo o líquido para o lado angular do tubo para evitar misturar as camadas. Repita com a solução de gradiente de densidade de 30%.</li>
	<li>Colete o supernatante das culturas de rotação PDX com uma pipeta sorológica de 5 mL, enxaguando a superfície da placa suavemente. Centrífuga a 200 x g por 2 min para células de pelota.</li>
	<li>Remova o supernasciente e resuspense a pelota celular em 3 mL de solução gradiente de densidade de 20% de acordo com o número de gradientes necessários para separar as células. Cuidadosamente camada 20% solução gradiente de densidade com células na parte superior do gradiente(s). Se usar apenas um tubo de gradiente para células, cubra o tubo de gradiente de equilíbrio com solução de gradiente de densidade livre de células de 20%.</li>
	<li>Tampe os tubos e centrífugas em uma centrífuga de rotor de balde de balanço por 30 min a 4 °C, 2.000 x ge 0 freio.</li>
	<li>Após a centrifugação, as frações serão visíveis(Figura 2C). Colete 2-3 mL de frações em tubos frescos de 15 mL. Adicione 3−4 volumes de HBSS 1x estéril a cada fração e inverta para misturar bem.</li>
	<li>Centrífuga a 1.000 x g por 3 min para células de pelota. Remova o supernascimento e resuspense a pelota da célula em 1-2 mL de meio de processamento PDX. NOTA: Os clusters viáveis de células PDX são tipicamente encontrados na interface de solução de gradiente de densidade de 40-55%(Figura 2D)com células mortas/moribundas únicas acumuladas na interface de solução de gradiente de densidade de 20-40% para a maioria dos PDXs testados.</li>
	<li>Remova uma pequena alíquota representativa (50-100 μL) para re dissociação com um volume igual de solução de enzima dissociação para avaliar o número de célula na suspensão da célula agrupada. Conte células com hemótmetro ou contador de células automatizada.</li>
</ol>4. Preparação de hidrogel e semeadura de placas microfluídicas
<ol><li>Reconstituir soluções de hidrogel HA (HA, HA-SH modificadas por tiol; diacrilato de polietileno glicol de polietileno reativo de tiol-reativo, PEGDA) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de HBSS a todos os poços em colunas de janelas de observação (coluna 3, 7, 11, 15, 19, 23) de uma placa microfluidic de 2 pistas para manter a umidade da cultura e condições ideais de imagem.</li>
	<li>Calcule o volume de suspensão celular da seção 3 necessária para 50 μL de hidrogel na densidade celular desejada (ou seja, 5.000 células/μL). Para semear uma placa microfluida, aliquot o volume calculado em cada um dos 4 tubos de centrífuga estéril de 1,5 mL. NOTA: Os hidrogéis HA têm um tempo fixo para gelação. Ajuste o volume de alíquotas de solução de gel para a eficiência do usuário na dispensação se ocorrer gelação prematura.</li>
	<li>Ajuste o pH da solução HA-SH para 8.0 com 1 N NaOH imediatamente antes de ser usado. Realize uma gelação de teste misturando 40 μL de HA-SH com 10 μL de PEGDA e monitorando a gelação ao longo do tempo. A gelação geralmente começa 5-8 min depois de misturar HA-SH com o crosslinker PEGDA.</li>
	<li>As alíquotas de suspensão de células centrífugas por 2 min (200 x g, temperatura ambiente) para células de pelotização. Remova cuidadosamente as células supernascidas e resuspend no volume apropriado de HA-SH. NOTA: O hidrogel final é uma solução HA-SH:PEGDA de 4:1 (em volume) para que as células sejam resuspendidas em 40 μL de HA-SH para um volume final de 50 μL.</li>
	<li>Adicione 10 μL de PEGDA a uma alíquota de células em HA. Misture bem e espere 1−3 min (dependendo do tempo de gelação da etapa 4.4) antes de semear a placa microfluida. NOTA: Permitir a reação de gelação do início antes da semeadura ajuda a minimizar a acomodação celular.</li>
	<li>Afixe uma dica para dispensar volumes de 1,5 μL a um único canal repetindo pipeta e carga com células na solução de hidrogel HA. Lembre-se de manter a alíquota de hidrogel bem misturada para garantir a distribuição uniforme da célula.</li>
	<li>Para semear a placa microfluida, alinhe a ponta pipeta perpendicular à placa enquanto coloque suavemente a ponta no centro da entrada de gel (colunas 1, 5, 9, 13, 17, 21) para garantir o contato, mas sem pressão ao dispensar a solução de hidrogel. Trabalhando rapidamente para evitar a solidificação prematura do hidrogel, dispense 1,5 μL de solução de gel em cada entrada de gel.</li>
	<li>Observe o status de preenchimento dos canais microfluidos visualizando a partir da parte superior da placa, parte inferior da placa, ou por microscópio, e avalie o carregamento, utilizando a Figura 3 como guia (carregamento bem sucedido na Figura 3A,orientação de posicionamento de tubulação na Figura 3B, carregamento perdido na Figura 3C, não preenchido para terminar na Figura 3D, transbordar na Figura 3E). Identifique quaisquer ajustes necessários na técnica que possam melhorar o sucesso do preenchimento para a próxima rodada de chips (consulte discussão para dicas de solução de problemas).</li>
	<li>Repita as etapas 4.6-4.9 com as 3 alíquotas restantes das células na solução HA. Inverta a placa enquanto prepara a próxima alíquota (~1 min). NOTA: O tempo de espera de 1 min e a inversão da placa melhoram a distribuição 3D das células reduzindo a fixação celular à medida que ocorre a gelação.</li>
	<li>Depois que todos os chips forem preenchidos, incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada até que a gelação esteja completa (~45 min).</li>
	<li>Utilizando o manual fornecido, certifique-se de que o roqueiro de perfusão esteja instalado na incubadora de cultura celular com as configurações corretas de perfusão (ângulo de 14°, intervalos de 4 minutos).</li>
	<li>Adicione 50 μL de cultura PDX média a todas as entradas médias (colunas 2, 6, 10, 14, 18, 22) e verifique se os canais preenchidos corretamente invertendo a placa. Bata suavemente a placa contra uma superfície para incentivar o líquido a preencher os canais microfluidos.</li>
	<li>Adicione 50 μL de DMEM-F12 (10% FBS) para todas as tomadas médias (coluna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Se alguma bolha de ar estiver presa no canal de perfusão, remova tocando suavemente a placa contra uma superfície.</li>
	<li>Usando um microscópio e um formulário de layout de placa(Figura Suplementar 1),recorde de preenchimento de chip. Exclua os chips mal preenchidos de uso experimental posterior.</li>
	<li>Coloque a placa em um roqueiro inclinado definido para uma inclinação de 14° e um ciclo de 4 minutos para começar a perfusão. Substitua o meio de cultura PDX a cada 2 dias (primeiro 50 μL na entrada, depois 50 μL na tomada).</li>
</ol>5. Coloração celular, imagem e quantificação de imagem
<ol><li>Prepare uma solução de ensaio de viabilidade celular contendo três corantes fluorescentes (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).<ol>
<li>Preparar soluções de estoque de cada corante da seguinte forma: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/mL) em água desionizada; calcein AM a 4 mM em DMSO anidro; ethidium homodimer-1 a 2 mM em DMSO/H2O (1:4, v/v). NOTA: As soluções calcein AM e ethidium homodimer-1 são fornecidas no kit notatado na Tabela de Materiais.</li>
		<li>Prepare uma única solução de trabalho em HBSS ou meio sem fenol, contendo os três corantes. Otimize a concentração final de trabalho para cada tipo e matriz celular, dentro das faixas de 1,6−8,0 μM para Hoechst 33342, 0,1−10 μM para calcein AM e 0,1−10 μM para ethidium homodimer-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o meio de cultura e aplique a solução de corante de viabilidade de trabalho aos chips microfluidos desejados (75 μL na entrada, 25 μL na tomada) e coloque de volta no roqueiro de perfusão na incubadora de cultura celular por 1h.</li>
	<li>Imagem dos vidros de observação das culturas manchadas usando um microscópio confocal manual ou automatizado(Tabela de Materiais)com filtros fluorescentes (listados como comprimentos de onda de excitação/emissão, em nm) observar todos os núcleos (Hoechst 33342, 350/461), núcleos de células mortas (ethidium homodimer-1, 528/617) e citoplasma de células vivas (calcein AM, 494/517).</li>
	<li>Capture 140 μm Z-stacks com um tamanho de passo de ≤ 1 μm usando um objetivo de ar de 20x. Três campos de visão são necessários para visualizar todo o microcanal com uma pequena quantidade de sobreposição. Para evitar a dupla amostragem, imagem apenas dois campos de visão por chip. NOTA: As condições de imagem devem ser otimizadas para garantir a amostragem adequada de NyQuist. Na experiência dos autores, um sistema de imagem rápida, baseado na desconvolução de uma fonte convencional de epi-fluorescência ou modo de varredura de ressonância em um confocal, é necessário para avaliar totalmente uma pilha Z completa, com três cores laser, em 96 chips em uma placa dentro de uma quantidade razoável de tempo (aproximadamente 3,5 h com imagem automatizada, incluindo configuração).</li>
	<li>Usando o software de análise de imagens, teste as imagens da pilha Z para os dados quantificados desejados, como morfologia, estado de agregação ou outros recursos. Para quantificar a viabilidade celular, conte o número de células mortas (vermelhas) e núcleos celulares totais (azul).</li>
</ol>

<ol><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%3A+Official+Journal+of+Korean+Cancer+Association%22%5BJournal%5D)">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+one+patient+paradigm%3A+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX-MI%3A+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li>
<li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li>
<li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856(2016).</li>
<li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseguides%3A+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li>
<li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+CD15%2FSSEA-1%2C+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66(2010).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431(2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um método para processar e cultivar células tumorais viáveis derivadas de PDX em um sistema de cultura 3D de alta produtividade e perfundido. Embora este protocolo utilize tecido PDX PCa, é igualmente eficaz para outros tumores derivados da epitelial. As características tumorais variam entre linhas PDX individuais mesmo dentro do mesmo tecido de origem (próstata, mama, etc.). Algumas linhas PDX são mais fibrosas e difíceis de isolar células viáveis, enquanto outras são mais celulares. O tamanho do tumor ...

Na última década, o campo da pesquisa sobre o câncer demonstrou um entusiasmo renovado pelos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) como uma ferramenta para avaliar a dependência da via celular do câncer e a suscetibilidade de medicamentos1. Os modelos PDX mais comuns são estabelecidos pela implantação subcutânea ou ortotópica de células tumorais humanas — um fragmento de tumor, um conjunto de células derivadas de tumor dissociados ou uma amostra de células tumorais circulantes isoladas (CTCs) — em um hospedeiro de roedores. Se o tumor "tomar" for bem sucedido, as células de xenoenxerto se proliferarão, vascularizarão e interagirão com o tecido hospedeiro para criar um tumor, que pode ser colhido em um tamanho ideal, subdividido e reimplantado em outros hospedeiros. Entre suas muitas vantagens como sistema modelo, os PDXs normalmente retêm uma parcela substancial da heterogeneidade da população de células tumorais nativas e permitem a avaliação de vias específicas humanas e respostas celulares2,,3. O contexto in vivo permite a interação tumoral com vasculatura e outros estroma adjacentes e recapitula características teciduais, como dinâmica de difusão de drogas, tensão de oxigênio e influência de matriz extracelular que impacta biologicamente e mecanicamente a progressão do tumor. Um aspecto negativo dos PDXs é sua dependência de um hospedeiro roedor, tanto para expansão do tumor quanto, em última instância, para testes de hipóteses. Como muitos PDXs não conseguem se adaptar à cultura bidimensional tradicional (2D) no poliestireno da cultura tecidual sem perder muitas de suas características desejáveis, houve um meio termo mínimo para os pesquisadores entre este método in vitro relativamente controlado, e o aumento significativo dos requisitos de despesas, instalações e tempo para o uso in vivo do PDX.
Descrevemos vários modelos in vitro que implementam a cultura celular 3D dentro de uma matriz de apoio, e recentemente expandimos esse trabalho para demonstrar a cultura ex vivo de PDXs derivados de múltiplos câncer de próstata (PDXs) derivados, tanto sozinhos quanto em co-cultura com fibroblastos derivados da medula óssea4,,5. As matrizes de hidrogel baseadas em ácido hialurônico (HA) fornecem suporte personalizável e biologicamente relevante para ambos os tipos de células, com controle fácil sobre características de hidrogel e clareza óptica para imagem através da profundidade do hidrogel6.
Os tecidos tumorais PDX maduros compreendem uma mistura variável de células cancerígenas humanas heterogêneas e estroma de camundongos (fibroblastos, células endoteliais, etc.). Para estudar contribuições específicas do tipo celular para a progressão do tumor in vitro, pode ser vantajoso para dissociar tumores, separar as populações celulares e incorporá-los experimentalmente de forma organizada para dissecar caminhos da comunicação intercelular. As populações de células mistas dentro dos digestados teciduais têm compatibilidade diferencial com condições específicas de cultura. Por exemplo, a viabilidade do fibroblasto associado ao tumor requer a adesão à superfície ou matrizes 3D funcionalizadas com ligantes integrin, enquanto as células PDX derivadas da epitelial não costumam ter esses requisitos, em vez de favorecer interações célula-células. Essas diferenças podem ser exploradas para alcançar a separação efetiva das células PDX da contaminação das células estromais do rato. A cultura de rotação dos digestatos teciduais permite a adesão das células estrois à superfície da cultura tecidual, enquanto as aderências das células celulares impulsionam as células PDX flutuando acima da superfície da cultura rotativa para formar aglomerados multicelulares no supernante em 24-48 h. As características específicas desses clusters variam com o PDX (por exemplo, grandes, apertados, altamente esféricos ou agregados menores e mais soltos que se assemelham a cachos de uvas), mas são tipicamente de tamanhos biologicamente relevantes (50-250 μm de diâmetro), suficientes para avaliar interações celulares que dependem de contatos intercelulares.
A recuperação e o processamento do tumor inevitavelmente resultam em algum grau de morte celular colateral, seja devido a danos a curto prazo causados por interrupção mecânica/enzimática, ou incompatibilidade a longo prazo das subpopulações com as condições de cultura escolhidas. Apesar da utilidade da cultura de rotação como uma separação em massa inicial, células mortas ou moribundas são inevitavelmente transferidas com os clusters PDX e podem influenciar a cultura resultante. Essas células mortas são muitas vezes células PDX individuais que não foram integradas em um aglomerado, fibroblastos estromamais de camundongos que não podem sobreviver em condições de cultura selecionadas, ou células endoteliais particularmente frágeis. Essas células moribundas podem influenciar resultados experimentais de "sobreviventes" e podem impactar substancialmente a quantificação, por exemplo, através de ensaios de triagem de viabilidade fluorescentes baseados em imagem. Para melhorar a seleção de células PDX vivas a partir deste método, adaptamos métodos de centrifugação com passos de densidade para remover facilmente células mortas/moribundas individuais de misturas PDX e reter aglomerados multicelulares predominantemente vivos.
Para aprimorar o estudo de clusters derivados do PDX resultantes na cultura 3D, utilizamos uma plataforma de cultura de perfusão baseada em microfluidos, a OrganoPlate (Figura 1), que é uma plataforma de órgão-sobre-chip de alta produtividade que permite uma cultura simultânea de até 96 culturas 3D perfumadas e individuais em uma base de placas de microtiter de 384 poços(Figura 1A)7,,8. Na placa microfluida de 2 pistas, um único chip de tecido é conectado por dois canais microfluidos (Figura 1B, canal de gel: vermelho, canal de perfusão: azul) que abrangem quatro poços seguidos. Os dois canais microfluidos são separados por uma pequena crista de plástico chamada Phaseguide que impede o transbordamento de um canal em seu canal vizinho adjacente, e simultaneamente permite uma interface livre de membrana entre o conteúdo do gel e do canal de perfusão9. Como a parte inferior da placa microfluiida é composta de vidro de microscópio, as culturas podem ser vistas na janela de observação através da parte inferior da placa com um microscópio padrão ou automatizado. A perfusão é estabelecida na placa microfluida com um roqueiro programável, utilizando gravidade para conduzir a mídia através dos canais microfluidos, entre poços de reservatórios(Figura 1C). A imitação do fluxo de perfusão recapitula mais de perto o microambiente tumoral do que a cultura estática, permitindo a incorporação do estresse da cisalhamento e maior distribuição de gases e nutrientes. Os benefícios da manutenção de uma cultura de células cancerígenas perfumadas na placa microfluida foram descritos anteriormente como culturas de câncer de mama perfundidas apresentaram viabilidade ideal em comparação com uma cultura estática 3D das mesmas células7.
O presente relatório descreve um método de centrifugação de gradiente de densidade adaptada para isolar clusters PDX multicelulares vivos e demonstra sua utilidade no estabelecimento de culturas PDX 3D dentro de placas microfluidas perfusíveis. Como um número crescente de laboratórios de pesquisa está buscando métodos para facilitar o uso do PDX, prevemos que os protocolos aqui apresentados serão de utilidade imediata.

<table><tbody><tr><td>1N NaOH</td><td></td><td></td><td>qualquer grau</td></tr><tr><td></td><td></td> de cultura de tecidos<td>adequado 60 mm pratos redondos de cultura de tecidos</td> qualquer <td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>adequada qualquer</td>70 &micro adequado;<td></td><td></td></tr><tr><td> filtros de células m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R com rotor e baldes adequados para tubos de centrífuga cônicos de 15/50 mL</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Solução de centrifugação de gradiente de densidade</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido qualquer</td><td></td><td></td><td>grau de cultura de tecidos adequado</td></tr><tr><td>Solução enzimática de dissociação</td><td>StemCell Technologies</td><td>07921</td><td>ACCUMAX</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039021</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td>qualquer</td></tr><tr><td>kit de hidrogel HA</td> ADEQUADO <td>ESI BIO</td><td>GS311</td><td>HyStem (ácido hialurônico-SH e PEGDA)</td></tr> <tr><td>Hanks Solução salina balanceada</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Inativado por calor soro fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B Hausser BrightLine</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H1398</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>Oxford Instruments</td><td>Imaris 9.3</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade de Células VIVAS/MORTAS (Calcein-AM/ Etídio Homodímero-1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Placa de cultura microfluídica</td><td>Mimetas</td><td>9603-400-B</td><td>Microscópio de placas organográficas de 2 vias</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Tecido</td><td></td><td></td> <td>tumoral derivado de PDXobtido sob aprovação IRB para tecido humano e aprovação IACUC para hospedeiro animal</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Balancim de perfusão</td><td>Mimetas</td><td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td><td></td></tr><tr><td>tiras de pH (pH 5-9)</td><td></td><td></td> <td>qualquer</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td> adequada <td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Lâminas de</td><td></td><td></td> barbear <td>qualquer agitador</td></tr><tr><td>xy rotativo</td> adequado <td>VWR</td><td>Advanced 3500 Orbital Shaker</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Bisturi lidar com</td><td></td><td></td><td>qualquer</td></tr><tr><td>pipeta de repetição de canal único</td><td>adequado Eppendorf</td><td>22260201</td><td></td></tr><tr><td>Estéril, tubos</td><td></td><td></td> de centrífuga cônicos de 15mL <td>qualquer adequado</td></tr><tr><td>Estéril, 50mL tubos cônicos do</td><td></td><td></td> centrifugador <td>algum apropriado</td></tr></tbody></table>

viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3d ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), gerados quando ressecados do tecido tumoral do paciente são grafados diretamente em camundongos imunocomprometidos, permanecem biologicamente estáveis, preservando características moleculares, genéticas e histológicas, bem como a heterogeneidade do tumor original. No entanto, usar esses modelos para realizar uma infinidade de experimentos, incluindo a triagem de medicamentos, é proibitivo tanto em termos de custo quanto de tempo. Sistemas de cultura tridimensional (3D) são amplamente vistos como plataformas nas quais as células cancerígenas retêm sua integridade biológica através de interações bioquímicas, morfologia e arquitetura. Nossa equipe tem ampla experiência em cultivo de células PDX in vitro usando matrizes 3D compostas de ácido hialurônico (HA). A fim de separar as células estromais do fibroblasto do camundongo associadas aos PDXs, usamos cultura de rotação, onde células estromais aderem à superfície das placas tratadas pela cultura tecidual enquanto células tumorais PDX dissociadas flutuam e se associam a aglomerados multicelulares. Também flutuando no supernante estão células solteiras, muitas vezes mortas, que representam um desafio na coleta de agrupamentos PDX viáveis para encapsulamento a jusante em hidrogéis para cultura celular 3D. Para separar essas células únicas de aglomerados de células vivas, empregamos centrifugação gradiente de passo de densidade. O protocolo aqui descrito permite o esgotamento de células únicas não viáveis da população saudável de aglomerados celulares que serão usados para mais experimentações in vitro. Em nossos estudos, incorporamos as culturas 3D em placas microfluidas que permitem a perfusão da mídia durante a cultura. Depois de avaliar as culturas resultantes usando um ensaio de viabilidade baseado em imagem fluorescente de células purificadas versus não purificadas, nossos resultados mostram que essa etapa de separação adicional reduziu substancialmente o número de células não viáveis de nossas culturas.

Um roqueiro de perfusão programável foi preparado em uma incubadora padrão de cultura celular tomada pela água, e placas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento(Figura 1). Um tumor PDX MDA-PCA-118b foi expandido in vivo, colhido quando atingiu um tamanho máximo, e dissociado como descrito no protocolo seção 2 para criar uma suspensão de chorume de células, aproximadamente em um estado de célula única(Figura 2...

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Métodos de cultura aprimorados para amostras de tumores derivados do paciente são criticamente importantes à medida que o campo se afasta do uso de linhas celulares convencionais. Este protocolo permite a cultura in vitro de células tumorais derivadas do paciente em uma plataforma que é favorável a alta produtividade e rastreamento de alto teor de conteúdo, ao contrário dos modelos de câncer in vivo. A plataforma que incorpora PDXs nos permite avaliar sistemas mais heterogêneos que refletem tumores nativos.Isso pode produzir uma visão dos mecanismos de drogas e permitir uma triagem mais rápida de drogas. O método poderia ser expandido através da incorporação de estroma, endotélio e células imunes. Essas co-culturas poderiam ser ainda mais reflexivas da população e arquitetura de tumores nativos.Pratique carregar as placas microfluidas com linhas celulares facilmente expandidas para se tornar altamente proficiente antes de mudar para células mais preciosas como PDXs. O alinhamento durante a distribuição de placas impacta muito o sucesso, e uma demonstração visual pode facilmente transmitir esse conceito. Para começar, transfira tecido tumoral para um tubo cônico pré-pesado de 50 mililitros.Enxágüe seis vezes com 30 mililitros de PBS estéreis para remover sangue e contaminantes. Remova o máximo de líquido possível e pese o tecido tumoral. Transfira o tecido tumoral para um prato de cultura de tecido redondo de 60 milímetros, e use uma lâmina de barbear estéril ou um bisturi para pica-lo em pedaços de um milímetro.Adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX para coletar o chorume tumoral. Adicione cinco mililitros de solução de enzima dissociação para coletar o chorume tumoral. Enxágüe o prato de cultura com mais cinco mililitros de solução de enzima dissociação.Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX. Incubar 20 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave. No meio do tempo de incubação, gire o tubo suavemente.Após a incubação, pipeta para cima e para baixo suavemente com uma pipeta sorológica para quebrar aglomerados. Coloque um coador de células de 70 mícrons sobre um novo tubo estéril de 50 mililitros e filtre as células. Em seguida, centrífuga a 1.200 rpm por dois minutos para pelotar as células.Remova o supernatante e resuspend em dois a três mililitros de meio de cultura PDX. Conte as células usando um hemócitometro ou contador de células automatizada. Use esta tabela para estimar o número necessário das células derivadas do PDX associadas necessárias para alcançar a densidade celular desejada por chip.Placa de uma a duas vezes 10 para as seis células em cinco mililitros de cultura PDX médio por poço de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Incubar por 48 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade com agitação suave de 50 a 55 rpm para promover a formação de aglomerados. Depois que os clusters se formarem, prossiga para a centrifugação.Primeiro prepare 20 mililitros de solução de gradiente de 100% de densidade misturando completamente 18 mililitros de solução de centrifugação de gradiente de densidade com dois mililitros de HBSS 10X estéril em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Diluir esta solução 100% com HBSS 1X estéril para fazer 10 mililitros cada um de 20%30%40% e 55% de soluções gradientes de densidade. Adicione três mililitros de solução gradiente de densidade de 55% ao fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.Segurando o tubo em um ângulo, dispense lentamente três mililitros de solução de gradiente de densidade de 40% para o lado angular do tubo e em cima da camada de 55%. Repita com a solução de gradiente de densidade de 30%. Em seguida, colete o supernatante das culturas de rotação PDX com uma pipeta sorológica de cinco mililitros em um tubo, enxaguando a superfície da placa suavemente.Centrifugar a 1.200 rpm por dois minutos para as células de pelota. Remova o supernasciente e resuspense a pelota da célula em três mililitros de solução gradiente de densidade de 20%. Coloque cuidadosamente a solução gradiente de 20% de densidade com células na parte superior do gradiente no tubo de 15 mililitros.Tampe os tubos e centrífuga em uma centrífuga de rotor de balde de balanço 30 minutos a quatro graus Celsius, 2.000 vezes G, e zero break. Após a centrifugação, frações são visíveis. Culturas viáveis de células PDX são tipicamente encontradas na interface de solução de gradiente de densidade de 40 a 55%.Colete de dois a três mililitros de cada fração em tubos frescos de 15 mililitros. Adicione de três a quatro volumes de HBSS 1X estéreis a cada fração e inverta para misturar bem. Centrifugar a 1.000 vezes G por três minutos para pelotar as células.Remova o supernatante. Resuspenda a pelota de célula em um a dois mililitros de meio de processamento PDX. Transfira uma pequena alíquota entre 50 a 100 microliters em um tubo e adicione um volume igual de solução de enzima dissociação para redissociação.Avalie o número da célula na suspensão da célula agrupada. Conte as células com um hemócitometro ou contador de células automatizada. Reconstituir soluções de hidrogel de ácido hialurônico de acordo com as instruções do fabricante.Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters de HBSS a todos os poços em colunas de janelas de observação de uma placa microfluidic de duas pistas para manter a umidade da cultura e condições ideais de imagem. Calcule o volume de suspensão celular necessário para 50 microliters de hidrogel na densidade celular desejada, por exemplo, 5.000 células por microliter. Para semear uma placa microfluida, aliquot o volume calculado em cada um dos quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis.Ajuste o pH da solução de thiol HA para oito com 1 hidróxido de sódio normal imediatamente antes de ser usado. Realize uma gelação de teste misturando 40 microliters de ha thiol com 10 microliters de PEGdA e monitorando a gelação ao longo do tempo. Em seguida, centrifugar as alíquotas de suspensão celular por dois minutos a 200 vezes G e temperatura ambiente para pelotar as células.Remova cuidadosamente o supernascer e resuspenja as células em 40 microliters de ha thiol para um volume final de 50 microliteres. Adicione 10 microliters de PEGdA a uma alíquota das células de ha thiol. Misture bem, e espere de um a três minutos antes de semear a placa microfluida.Afixe uma dica para distribuir 1,5 microliters a uma pipeta repetindo um único canal e carregue com as células na solução de hidrogel HA. Lembre-se de manter a alíquota de hidrogênio bem misturada para garantir a distribuição uniforme da célula. Para semear a placa microfluida, alinhe a ponta da pipeta perpendicular à lâmina enquanto coloque suavemente a ponta no centro da entrada de gel para garantir o contato, mas sem pressão ao dispensar 1,5 microliters da solução de hidrogel.Observe o estado de preenchimento dos canais microfluidos visualizando a partir da parte superior da placa, parte inferior da placa ou por microscópio. Avalie o carregamento usando esta figura como guia. Um minuto após o carregamento, inverta a placa enquanto se prepara para a próxima alíquota.Repita a semeadura da placa microfluida para as três alíquotas restantes das células na solução HA. Depois que todos os chips forem preenchidos, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada 45 minutos até que a gelação esteja completa. Depois disso, utilizando o manual fornecido, certifique-se de que o roqueiro de perfusão esteja instalado na incubadora de cultura celular com a configuração correta de profusão em ângulo de 14 graus e intervalos de quatro minutos.Adicione 50 microliters de cultura celular PDX ao meio de todas as entradas médias. Bata suavemente a placa contra uma superfície para incentivar o líquido a preencher os canais microfluidos. Em seguida, gire a placa para verificar se os canais estão preenchidos corretamente.Adicione 50 microliters de DMEM/F-12 para todos os meios de comunicação. Se alguma bolha de ar estiver presa no canal de perfusão, remova por toques suaves da placa contra uma superfície. Usando um microscópio e um formulário de layout de placa, registo o sucesso do preenchimento do chip.Exclua os chips mal preenchidos de uso experimental posterior. Coloque a placa em um roqueiro inclinado definido para uma inclinação de 14 graus e um ciclo de quatro minutos para começar a perfusão. A cada dois dias, substitua o meio de cultura PDX, primeiro 50 microliters nas entradas, depois 50 microliters nas tomadas.Neste estudo, um roqueiro de perfusão programável foi instalado em uma incubadora padrão de cultura celular com capa d'água, e lâminas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento. A viabilidade e a morfologia da cultura PDX microfluídica 3D foram avaliadas em condições separadas de centrifugação de centrífugas não paraxidas e gradientes de densidade. No primeiro dia, as culturas submetidas ao método de separação apresentaram dez vezes menos células mortas em comparação com culturas não paradas.É importante ressaltar que os aglomerados separados consistiam principalmente de células vivas. Não foi identificada diferença estatisticamente significativa para a distribuição do tamanho do cluster. As culturas foram mantidas na placa microfluida por sete dias.O número total de células vivas permaneceu consistente, e os clusters mantiveram aproximadamente 80% de viabilidade ao longo da vida da cultura. Lembre-se que cada linha PDX é única, de modo que a facilidade de digestão do tumor, o tamanho fenotípico e a morfologia dos clusters, e a localização do cluster dentro da purificação do gradiente variam. As culturas PDX estabelecidas usando este método podem ser avaliadas com ensaios de viabilidade baseados em imagem ou leitor de placas, rotulados fixos e imunofluorescentamente, ou dissociados para coletar lises celulares para outros protocolos.O método permitirá que os pesquisadores recapitulem o microambiente tumoral, a fim de explorar a biologia ou a resposta medicamentosa das células tumorais. Os usuários devem completar o treinamento padrão de indivíduos humanos e o treinamento de patógenos transmitidos pelo sangue antes de trabalhar com tecidos derivados do homem. Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada (Vídeo) | JoVE Journal

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

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