Name: Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda a criar um modelo de sarcoma de tecido mole em camundongos com ressecção incompleta para testar terapias (neo)adjuvantes. Este método padronizado permite avaliar tratamentos pós-operatórios em condições controladas.

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Este trabalho é apoiado por subsídios do Sock-lo para Sarcoma! Fundação, Associação Australiana e Neozelandesa de Sarcoma, Fundação de Pesquisa em Leucemia Infantil e Câncer e Filantropia Perpétua. W.J.L é apoiado por uma Bolsa Simon Lee e uma bolsa de pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, e do Cancer Council WA.

Os animais utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro de Recursos Animais (Perth, Austrália Ocidental). Os animais foram mantidos sob condições padrão sem patógenos no Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Austrália Ocidental). Todos os experimentos foram realizados seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Harry Perkins de Pesquisa Médica. Foram utilizados camundongos BALB/c de 8 a 12 semanas de idade nesses experimentos. A linha de células fibrossarcoma WEHI 164 foi obtida do CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inoculação de células
<ol><li>Preparação de células e animais<ol>
<li>Certifique-se de que a linha celular está mantida na mídia recomendada. Por exemplo, manter a linha celular WEHI 164 no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% soro bovino fetal, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 penicilina U/mL e 100 μg/mL estreptomia. NOTA: Células de passagem pelo menos 3 e até 5 vezes após serem removidas do armazenamento criogênico. Para garantir uma viabilidade celular ideal, as células devem ser divididas quando estiverem entre 70-80% confluentes. As linhas de células tumorais devem ser testadas para o micoplasma, pois a infecção pode alterar o crescimento celular e influenciar a resposta imune in vivo.</li>
		<li>Um dia antes da inoculação, raspe ratos no flanco inferior direito usando cortadores. NOTA: Foram utilizados camundongos BALB/c femininos, com idade entre 8 e 12 semanas, de peso normal (16 -22 gramas) neste experimento.</li>
		<li>No dia da inoculação, colher WEHI 164 células quando 70-80% confluentes pela tripoizatização.<ol>
<li>Aspire o meio de cultura dos frascos de cultura tecidual e, em seguida, adicione solução tamponada de fosfato estéril (1x PBS), para remover vestígios remanescentes de soro bovino fetal (FBS).</li>
			<li>Aspire o PBS dos frascos de cultura tecidual. Adicione 3 mL de trippsina de 0,05% (para um frasco T75) e, em seguida, gire o frasco para que toda a superfície de frasco com células seja coberta por trippsina.</li>
			<li>Incubar o frasco a 37 °C, 5% de incubadora de CO2 por 3 min. Verifique as células periodicamente, tocando nas laterais do frasco para ver se as células se desalojaram.</li>
			<li>Remova frascos da incubadora de cultura celular e adicione 5 mL de mídia suplementada com FBS para neutralizar a trippsina. NOTA: Não deixe as células na trippsina por mais tempo do que o necessário, pois isso pode danificar as células e levar à baixa viabilidade celular.</li>
			<li>Suspensão de tubulação várias vezes para obter uma única suspensão celular. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica.</li>
			<li>Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave as células três vezes em 1x PBS.<ol>
<li>Células resuspendas em 50 mL de PBS 1x estéreis e lavam células por suspensão de células tubulações para cima e para baixo. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.</li>
			<li>Aspire as células supernascidas e resuspend em 15 mL de PBS 1x estéril. Lave as células por suspensão de células tubulações para cima e para baixo. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.</li>
			<li>Aspire as células supernascidas e resuspend em exatamente 10 mL de PBS 1x estéril. Lave as células como na etapa 1.1.4.2 e transfira uma pequena quantidade (aproximadamente 100 μL) de suspensão celular para um tubo de centrífuga para contagem. Células de pelota girando a 350 x g por 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determine o número da célula usando o método de exclusão azul Trypan usando um hemocitómetro ou um contador automatizado de células. Células resuspendas em 1x PBS estéreis a uma concentração de 5 x 106 células/mL. Mantenha a suspensão celular no gelo. NOTA: A viabilidade das células tumorais deve ser igual ou superior a 80 % para garantir o crescimento do tumor reprodutível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculação subcutânea<ol>
<li>Misture bem a suspensão celular e encha uma seringa com uma agulha de 26 G com 100 μL de suspensão celular (5 x 105 células) em 1x PBS estéril. Repita a mistura de células antes de carregar a próxima seringa. NOTA: Mantenha as células no gelo durante todo o procedimento para manter a viabilidade.</li>
		<li>Contenha o mouse adequadamente, garantindo o acesso ao flanco inferior direito. Inocular o rato subcutâneamente no flanco inferior direito raspado. NOTA: Certifique-se de que a inoculação não está no peritônio levantando ligeiramente a agulha, que deve ser visível sob a pele. Um nódulo parecido com uma bolha deve se formar sob a pele após a inoculação.</li>
		<li>Monitore os camundongos conforme exigido pela aprovação ética aplicável e realize a ressecção cirúrgica quando os tumores crescerem para um tamanho de cerca de 50 mm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ressecção cirúrgica parcial do tumor
NOTA: Este protocolo requer dois pesquisadores; um para procedimentos cirúrgicos (CIRURGIÃO) e outro para monitoramento de camundongos (ASSISTENTE).
<ol><li>Configuração da cirurgia<ol>
<li>No dia 12 pós-inoculação, quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 mm2, dose de camundongos com 100 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina s.c. no pescoço, 30 minutos antes da cirurgia.</li>
		<li>Configure a área cirúrgica com uma almofada de calor coberta com casaco de banco e configure um cone de nariz para anestesia. Esterilize ferramentas cirúrgicas antes do uso, e entre cada animal usando um esterilizador de contas de calor, permitindo que as ferramentas esfriem antes do uso. Tenha os seguintes equipamentos cirúrgicos limpos e de fácil acesso: clorexidina, cotonete, gaze, gel ocular, dois fórceps curvos, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipe, recargas de clipe(Figura 2A, 2B).</li>
		<li>Aqueça a câmara de aquecimento a 37 °C e configure outra almofada de aquecimento para recuperação(Figura 2C). Coloque ferramentas esterilizadas em uma superfície estéril, como almofadas autoclavadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia<ol>
<li>Coloque o mouse na câmara de indução e anestesia o mouse com 4% de isoflurane (4% em 100% de oxigênio a uma taxa de fluxo de 1 L/min) até que a taxa de respiração desacelere para aproximadamente 60 respirações por minuto (1 por segundo) (isso geralmente leva <1 min). NOTA: Não deixe o rato na câmara por muito tempo, pois isso pode levar à asfixia e à morte. Só tem um rato sob anestesia de cada vez.</li>
		<li>Transfira o mouse para a almofada de calor na mesa de cirurgia, coloque o rato com o nariz no cone do nariz e mantenha o estado anestésico com isoflurane de 3-4% em 100% oxigênio a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min. Monitore a taxa de respiração para garantir que a profundidade da anestesia seja mantida. NOTA: O ASSISTENTE deve monitorar a respiração do camundongo durante toda a cirurgia para garantir que o nível correto de anestesia seja mantido. Abaixe a concentração anestésico se a respiração ficar muito lenta ou aumentar a concentração se a profundidade da anestesia for muito rasa. Se o mouse começar a ofegar, retire o rato do cone do nariz, diminua a concentração anestésico e espere até que a respiração se normaliza antes de colocar no cone do nariz novamente.</li>
		<li>Realize um "teste de pinça" e "teste de reflexo córnea"14 para garantir que o rato esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia. NOTA: O movimento de qualquer parte do mouse é uma indicação de que o mouse não está totalmente anestesiado. O animal deve receber imediatamente anestésico adicional aumentando a concentração anestéstica.</li>
		<li>Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento cirúrgico (CIRURGIÃO)<ol>
<li>Limpe a área cirúrgica 3 vezes com clorexidina alcoólica. Usando fórceps e um par de tesouras, faça uma incisão reta de 1 cm ao longo do lado dorsal, 3 mm de distância do tumor(Figura 3A, 3B). NOTA: Padronizar a incisão para 1 cm em cada rato (usando uma régua) permite até mesmo a avaliação da cicatrização de feridas entre camundongos. Localizar a incisão a 3 mm do tumor permite a terapia adjuvante intratumoral subsequente sem vazamento da ferida.</li>
		<li>Usando pinças, retire a fácia e o tecido gorduroso subcutâneo entre o tumor e o peritônio. O tumor subcutâneo é normalmente ligado ao lado da pele.</li>
		<li>Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado do rolamento do tumor usando pinças, e "inverta" o tumor para que ele fique visível lá fora(Figura 3C, 3D). NOTA: A seção do tumor a ser desprupado deve ser mais próxima da abertura, para ter pele suficiente para fechar a ferida. Tenha cuidado para não cortar a pele ao remover o tumor.</li>
		<li>Usando um par de tesouras, corte a cápsula tumoral da metade para remover, começando da base do tumor mais próximo da abertura.</li>
		<li>Para 50% de cirurgia de debulk, corte no meio do tumor. Usando fórceps curvas, colher a seção do tumor a ser removida (50%); colher quaisquer restos da área desbulhada.</li>
		<li>Para 75% debulk, realize um debulk tumoral de 50% como na parte 2.3.5 acima. Em seguida, corte pela metade os 50% restantes do tumor e retire 25% do tumor, usando fórceps curvos como descrito acima.</li>
	</ol></li>
	<li>Fechando o local cirúrgico<ol>
<li>Coloque o tumor restante de volta sob a pele, e usando fórceps, puxe os retalhos da pele e alinhe a pele ao longo da ferida.</li>
		<li>Segure a pele a 5 mm da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida, começando pelo lado mais próximo dos fórceps. Aplique quantos clipes for necessário para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com lacunas de 2 mm entre os clipes. NOTA: Se algum clipe não estiver bem aplicado, remova-o usando um removedor de clipe e substitua-se por novos clipes.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperação de ratos (ASSISTENTE)<ol>
<li>Deixe que os ratos se recuperem colocando-os na câmara de aquecimento quente (37 °C).</li>
		<li>Coloque a gaiola do mouse na almofada de calor. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que eles se recuperem do anestésico (acordado e andando) e, em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola. Deixe a gaiola na almofada de calor por mais 10 minutos, até que os ratos se tornem mais ativos.</li>
		<li>Dê aos ratos comida molhada e macia. Monitore os camundongos 1 hora após a cirurgia para recuperação e certifique-se de que os clipes permaneçam no local. Certifique-se de que a gaiola está meio on/half fora da almofada de calor para permitir que os animais se autorregularem a temperatura enquanto não estão acompanhados.</li>
		<li>Dose de camundongos com 0,1 mg/kg buprenorfina (100 μL subcutâneamente no pescoço), 6-8 horas após a cirurgia (no final do dia). Monitore os camundongos no início da manhã seguinte, e dose novamente os camundongos com 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 μL subcutânea no pescoço). Dê mais comida molhada conforme necessário.</li>
		<li>Monitore ratos diariamente pelos próximos sete dias. Os clipes podem ser removidos após sete dias usando o removedor de clipe.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento adjuvante ou neoadjuvante<ol>
<li>Trate camundongos peri-operativamente com (neo)terapia adjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse.</li>
		<li>Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 μg de anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) no dia 15 após a inoculação, ou com três doses de 200 μg anti-PD-1 i.p. nos dias 15, 17 e 19 após a inoculação.</li>
	</ol></li>
	<li>Controles experimentais<ol>
<li>Ao utilizar este modelo para avaliar os efeitos da inflamação/cicatrização de feridas, considere usar os seguintes grupos de controle: 1) Controle não cirúrgico (os tratamentos ainda podem ser administrados intratumorally); 2) Controle da cirurgia falsa: Uma incisão cirúrgica é feita na pele; o tumor é manipulado e exposto, mas nenhum tecido tumoral é removido; a ferida está fechada com clipes.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Orosco, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Surgical+Margins+in+the+10+Most+Common+Solid+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5686(2018).</li>
<li>Haas, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+Management+of+Extremity+Soft+Tissue+Sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).</li>
<li>Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+study+of+10%2C000+patients+with+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma.</a> Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+disease+relapse+in+primary+extremity+soft-tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma.</a> British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).</li>
<li>Uramoto, H., Tanaka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+after+surgery+in+patients+with+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recurrence after surgery in patients with NSCLC.</a> Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).</li>
<li>Stojadinovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+prognostic+significance+of+microscopic+margins+in+2%2C084+localized+primary+adult+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas.</a> Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).</li>
<li>Krall, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+response+to+surgery+triggers+the+outgrowth+of+distant+immune-controlled+tumors+in+mouse+models+of+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy.</a> Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).</li>
<li>Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+surgery+and+immunotherapy%3A+turning+an+immunosuppressive+effect+into+a+therapeutic+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86(2018).</li>
<li>Predina, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+surgical+models+of+postoperative+tumor+recurrence+for+preclinical+adjuvant+therapy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment.</a> American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).</li>
<li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).</li>
<li>Khong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+tumor+debulking+surgery+is+improved+by+adjuvant+immunotherapy+using+imiquimod+and+anti-CD40%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40.</a> BMC Cancer. 14, 969(2014).</li>
<li>Broomfield, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial%2C+but+not+complete%2C+tumor-debulking+surgery+promotes+protective+antitumor+memory+when+combined+with+chemotherapy+and+adjuvant+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy.</a> Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).</li>
<li>Predina, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive-margin+resection+model+recreates+the+postsurgical+tumor+microenvironment+and+is+a+reliable+model+for+adjuvant+therapy+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation.</a> Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+and+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverwijk%2C+WW+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).</li>
<li>Predina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+local+tumor+microenvironment+in+recurrent+cancers+may+explain+the+failure+of+vaccines+after+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).</li>
<li>Endo, M., Lin, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+margins+in+the+management+of+extremity+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma.</a> Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37(2018).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Efficacy+of+Neoadjuvant+Compared+to+Adjuvant+Immunotherapy+to+Eradicate+Metastatic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease.</a> Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).</li>
<li>Park, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+release+of+perioperative+immunotherapy+prevents+tumor+recurrence+and+eliminates+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases.</a> Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).</li>
<li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+tumor+model+of+surgical+stress+to+explore+the+mechanisms+of+postoperative+immunosuppression+and+evaluate+novel+perioperative+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51253(2014).</li>
<li>Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Procedures+and+Methodology+for+a+Preclinical+Murine+Model+of+De+Novo+Mammary+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Qiu, W., Su, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+orthotopic+pancreatic+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
</ol>

Sem revelações.

Fornecemos um protocolo para um modelo de rato de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar terapias peri-operatórias. Também padronizamos a incisão cirúrgica para permitir a avaliação da cicatrização de feridas entre camundongos após o tratamento.
A colocação do tumor é uma parte importante deste protocolo. Optamos por um modelo de tumor subcutâneo para permitir fácil acesso cirúrgico ao local do tumor e administração de terapias locais com carga mínima sobre os cam...

A cirurgia continua sendo a principal opção de tratamento para muitos tumores sólidos1, incluindo sarcoma de tecido mole2,3. Apesar das melhorias nas técnicas de cirurgia oncológica e das combinações com terapias (neo)adjuvantes, ainda há um alto risco de recaída e metástase após a ressecção do tumor primário4,5. No sarcoma de tecido mole, as recaídas ocorrem particularmente locoregionalmente, no local da cirurgia, resultando em aumento da morbidade e mortalidade. No cenário clínico, pode ser difícil obter margens largas o suficiente (por exemplo, devido a restrições anatômicas), resultando em ressecção incompleta e recorrência do tumorsubsequente 6. O estresse cirúrgico e o processo subsequente de cicatrização da ferida são conhecidos por criar um microambiente tumoral imunossupressor favorável à recidiva do tumor7,8. Portanto, a descoberta e o desenvolvimento de novas terapias para sarcoma de tecido mole, particularmente imunoterápicos, devem levar em conta a resposta de cicatrização da ferida cirúrgica.
A maioria dos estudos pré-clínicos para terapias adjuvantes são inicialmente realizados utilizando modelos subcutâneos sintéticos ou xenotransplant mouses, sem incorporar o estresse cirúrgico e a resposta de cicatrização da ferida9,,10. Por isso, desenvolvemos um modelo de sarcoma de tecido mole subcutâneo síndico contendo ressecção cirúrgica incompleta. AS células de fibrosarcoma WEHI 164 são inoculadas subcutâneas, e uma vez estabelecidas as tumores, removemos 50-75% do volume tumoral(Figura 1A-E). Tumores consistentemente re-crescer do tumor restante. Este modelo permite testar terapias adjuvantes, considerando o efeito do estresse cirúrgico e da cicatrização das feridas. Modelos cirúrgicos semelhantes de ressecção incompleta têm sido utilizados em uma série de estudos por diversos grupos e constatados ser reprodutíveis e eficazes11,,12,13. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada deste protocolo.

<table><tbody><tr><td>Seringa de insulina de calibre 26 0,5 mL</td><td>Becton Dickinson, Austrália</td><td>326769</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21985023</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Máquina de gás anestésico</td><td>Darvall Vet, Austrália</td><td>SKU: 2848</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Anti-CTLA-4</td><td>BioXcell, EUA</td><td>BE0164</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Anti-PD-1</td><td>BioXcell, EUA</td><td>BP0273</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Injeção de cloridrato de buprenorfina, 0,3 mg / mL</td><td>RB healthcare UK Limited, Reino Unido</td><td>55175</td><td>Pedido de prescrição</td></tr><tr><td>Esfoliação cirúrgica de clorexidina 4%</td> <td>Perigo Austrália, Austrália</td><td>CHL01449F (esfoliação</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>CellSera, Austrália</td><td>AU-FBS-PG</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Fórceps fino 10,5 cm</td><td>Casa cirúrgica, Austrália</td> <td>OcidentalCC74110</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Fórceps Fine 12 cm Serrilhado</td><td>Casa cirúrgica, Austrália Ocidental</td><td>CC74212</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Fórceps Halsted 14 cm</td><td>Casa cirúrgica, Austrália Ocidental</td><td>CD01114</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Câmara de aquecimento</td><td>Datesand Ltd, Reino Unido</td><td>Mini-Thermacage</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15630080</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health, Austrália</td><td>SKU: 29405</td><td>Pedido de prescrição</td></tr><tr><td>Pomada Lubrificante para os Olhos</td><td>Alcon</td><td>n/a</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina 1000X</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15140122</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Solução Tamponada com Fosfato 10x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>70013-032</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Reflexo 7mm Clips</td><td>Capaz científico, Austrália</td><td>AS59038</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Aplicador de clipe de ferida Reflex 7mm</td><td>Capaz científico, Austrália</td><td>AS59036</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Removedor de clipe de ferida Reflex</td><td>Capaz científico, Austrália</td><td>AS59037</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Circuito respiratório de anestesia Qube para roedores</td><td>Darvall Vet, Austrália</td><td>#7885</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Médio + L-glutamina</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21870092</td><td>Nenhuma</td></tr><tr><td>Tesoura Iris STR 11 cm</td><td>Casa cirúrgica, Austrália Ocidental</td><td>KF3211</td><td>Nenhuma</td></tr><tr><td>Tesoura Iris STR 9 cm</td><td>Casa cirúrgica, Austrália Ocidental</td><td>JH4209</td><td>Nenhuma</td></tr><tr><td>Câmara de indução pequena</td><td>Darvall Vet, Austrália</td><td>SKU: 9630</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>TrypLE express 1x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>12604-021</td><td>Nenhum</td></tr><tr><td>Germinador 500 Esterilizador de Contas de Vidro</td><td>Cellpoint Scientific Inc., EUA</td><td>5-1460-DK</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (neo)terapias adjuvantes

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

A cirurgia é frequentemente o primeiro tratamento para muitos tumores sólidos. No entanto, as recaídas locais ocorrem frequentemente após a ressecção do tumor primário, apesar das terapias adjuvantes ou neoadjuvantes. Isso ocorre quando as margens cirúrgicas são insuficientemente livres de tumores, resultando em células cancerígenas residuais. Do ponto de vista biológico e imunológico, a cirurgia não é um evento nulo; o ambiente de cicatrização da ferida é conhecido por induzir vias pró e anti-tumorigênicas. Como consequência, modelos pré-clínicos para o desenvolvimento de medicamentos destinados a prevenir a recaída local devem incorporar a ressecção cirúrgica ao testar novas terapias (neo)adjuvantes, para modelar os cenários clínicos em pacientes tratados com cirurgia.
Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole WEHI 164 que permite o teste de terapias (neo)adjuvantes no cenário de uma resposta de cicatrização da ferida. Nesse modelo, 50% ou 75% do tumor é removido, deixando para trás algum tecido cancerígeno in situ para modelar doença residual bruta após cirurgia no ambiente clínico. Este modelo permite testar terapias no contexto da cirurgia, ao mesmo tempo em que considera a resposta de cicatrização da ferida, o que pode afetar a eficácia dos tratamentos (neo)adjuvantes. A ressecção cirúrgica incompleta resulta em recrescimento reprodutível do tumor em todos os camundongos na ausência de terapia adjuvante. O tratamento adjuvante com bloqueio de ponto de verificação resulta em redução do recrescimento tumoral. Este modelo é, portanto, apropriado para testar terapias no contexto da cirurgia de debulking e sua resposta associada à cicatrização de feridas e pode ser estendido a outros tipos de câncer sólido.

O crescimento do tumor para um tamanho de 50 mm2 é um tamanho ideal para debulk parcial. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 mm2 tumores resulta em 100% (n=5) recrescimento reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante(Figura 4A). Em seguida, usamos o modelo para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra moléculas de checkpoint Citotóxica T Linfócito Associado Proteína 4 (CTLA-4) e Rec...

Neste protocolo, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar (neo)terapias adjuvantes.

Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...

Este protocolo visa imitar o cenário clínico da doença residual após a cirurgia de desesbulação do tumor e, portanto, permite testar novas terapias cancerígenas no contexto da cicatrização de feridas pós-operatórias. A vantagem dessa técnica é que ela permite a padronização da quantidade de ferida infligida e a quantidade de tumor para permanecer. Esta técnica é particularmente importante para estudos pré-clínicos na identificação de novos tratamentos para cânceres, que recaí-lo localmente um exemplo de que é sarcoma de tecido mole.Essa demonstração visual é fundamental para demonstrar a técnica de inversão, que nos permite expor o tumor ligado ao lado da pele. Inicie este procedimento com a inoculação subcutânea de células cancerígenas preparadas em camundongos, conforme descrito no protocolo de texto. No dia 12, pós-inoculação, quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 milímetros quadrados, dose de camundongos com 100 microliters de buprenorfina subcutânea no pescoço, 30 minutos antes da cirurgia.Configure a área cirúrgica com a almofada de calor coberta com casaco de banco e configure um cone de nariz para anestesia. Disponha equipamentos cirúrgicos limpos para que estejam de fácil acesso, incluindo clorhexadina, cotonete, gaze, gel ocular, duas fórceps curvas, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipes e recargas de clipe. Aqueça a câmara de aquecimento a 37 graus Celsius e configure outra almofada de aquecimento para recuperação.Note que este procedimento requer duas pessoas. Um assistente deve monitorar a respiração do mouse de perto durante o procedimento. Depois de anestesiar o mouse como descrito no protocolo de texto, realize um teste de pinça e teste de reflexo córnea para garantir que o rato esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos. Comece esta cirurgia limpando a área cirúrgica com clorhexadina. Usando fórceps e um par de tesouras fazem uma incisão reta de um centímetro ao longo do lado dorsal, a três milímetros do tumor.Não corte a pele diretamente cobrindo o tumor, pois ele não vai curar bem. Evite usar um bisturi para cortar o tumor e use pinças para colher os pedaços. Usando pinças, retire a fáscia e o tecido gorduroso subcutâneo entre o tumor e o peritônio.O tumor subcutâneo é normalmente ligado ao lado da pele. Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado do rolamento do tumor usando pinças e inverta o tumor para que ele fique visível lá fora. Usando um par de tesouras, corte a cápsula tumoral da metade para remover, começando da base do tumor mais próximo da abertura.Para cirurgia de 50%, corte no meio do tumor. Usando fórceps curvas, retire a seção do tumor para ser removida. Pegue qualquer remanescente da área de debulk.Para 75% debulk, comece realizando um debulk tumoral de 50%, depois corte pela metade os 50% restantes do tumor. Pegue 25% do tumor usando fórceps curvos. Para fechar o local cirúrgico, coloque o tumor restante de volta sob a pele e usando fórceps, puxe os retalhos da pele e forra a pele ao longo da ferida.Segure a pele a cinco milímetros da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida começando ao lado, mais perto dos fórceps. Aplique quantos clipes for necessário para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com intervalos de dois milímetros entre os clipes.Permita que os ratos se recuperem colocando-os na câmara de aquecimento quente. Coloque a gaiola do mouse na almofada de calor. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que se recuperem do anestésico.Em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola, deixe a gaiola na almofada de calor por mais 10 minutos até que os ratos se tornem mais ativos. Dê aos ratos comida molhada e macia. Monitore os ratos uma hora após a cirurgia para recuperação.Monitore os ratos novamente no final do dia e na manhã seguinte e garanta que os clipes permaneçam no lugar. Trate camundongos perioperativamente com advento ou terapia neoadjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse. Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 microgramas de anti-CTLA-4 intraperitonealmente no dia 15 após a inoculação.Alternativamente, trate os camundongos com três doses de 200 microgramas de anti-PD-1 intraperitonealmente nos dias, 15, 17 e 19 após a inoculação. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 tumores quadrados, indicado aqui pela linha pontilhada resulta em recrescimento 100% reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante. Portanto, o crescimento do tumor para um tamanho de 50 milímetros quadrados é um tamanho ideal para debulk parcial.O modelo foi então usado para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra módulos de ponto de verificação, proteína associada ao linfócito T citotóxico quatro e receptor de morte programado um. Tratamento de camundongos com anti-CTLA-4, resultou em uma taxa de cura de 80%Enquanto o tratamento de camundongos com anti-PD-1 resultou em uma taxa de cura de 25% A resposta com anti-PD-1 fornece uma oportunidade de testá-lo novas combinações, para melhorar ainda mais a taxa de resposta. É importante que o tumor restante permaneça ligado à pele, caso contrário o suprimento sanguíneo será cortado e o tumor se tornará o necrosado.Após esse procedimento, os tumores podem ser analisados por uma variedade de métodos, como a citometria de fluxo, a fim de avaliar como a cirurgia afeta as células infiltradas de tumores. Este modelo de camundongos nos permitiu explorar como a cicatrização de feridas afeta as imunoterapias cancerígenas.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

Modelos de camundongos com metástase espontânea: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de câncer colorretal injetadas ortotopicamente

Este vídeo ilustra o teste de terapia adjuvante ou adicional em um modelo de camundongo com tumores subcutâneos ressecados de forma incompleta. O camundongo parcialmente ressecado pelo tumor é tratado com um anticorpo direcionado à proteína anticitotóxica das células T reguladoras, reduzindo potencialmente o crescimento do tumor e sugerindo terapia adjuvante eficaz.

Uma terapia adjuvante em um modelo de camundongo com um tumor subcutâneo ressecado incompletamente

Fonte: Alomari, S., et al. Implementação de ressecção minimamente invasiva de tumor cerebral em roedores para coleta de tecidos de alta viabilidade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o uso de um sistema de ressecção minimamente invasivo (MIRS) para extirpar o tecido tumoral de um camundongo anestesiado implantado com um tumor. O procedimento envolve prender o mouse em uma estrutura estereotáxica, reabrir o local cirúrgico anterior para acessar o cérebro e inserir uma cânula especializada...

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Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.

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Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes

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