Infusão e Estimulação Combinada com Voltammetry Cíclica de Varredura Rápida (CIS-FSCV) para avaliar a regulação do receptor da área tegmental ventral da dopamina fástica

Essa abordagem pode ajudar a elucidar o papel da área tegmental ventral específica, receptores somatodendríticos e liberação fásica de dopamina no núcleo accumbens. A principal vantagem dessa abordagem é que questões sobre o controle da função do receptor sobre a liberação fásica de dopamina podem ser abordadas no cérebro intacto. Otimizar a localização do microeletrodo de fibra de carbono e do estimulador bipolar pode ser um desafio, e alguns conselhos para iniciantes são começar a gravar no estriado dorsal.

Devido ao uso e manipulação de vários tipos de eletrodos, incluindo eletrodos de gravação, referência e estimulação, um guia visual de quando e onde esses eletrodos são implantados será útil. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal, limpe o couro cabeludo de um rato anestesiado com três esfoliantes sequenciais de iodopovidona e etanol a 70%. Após a última esfrega, use uma pinça de nariz esterilizada e uma tesoura cirúrgica para cortar tecido do couro cabeludo suficiente para abrir espaço para os eletrodos implantados.

Limpe suavemente a superfície exposta do crânio com aplicadores de ponta de algodão esterilizados antes de aplicar duas a três gotas de peróxido de hidrogênio a 3% para ajudar a identificar lambda e bregma. Em seguida, use uma broca de um milímetro ajustada para aproximadamente 20.000 rotações por minuto para fazer um furo de 1,5 milímetro de diâmetro, 2,5 milímetros anterior e 3,5 milímetros lateral ao bregma. Implante um parafuso de 1,59 milímetro de diâmetro externo e 3,2 milímetros de comprimento na metade do orifício até que o parafuso esteja firmemente no lugar.

Em seguida, faça um orifício de eletrodo de referência de um milímetro de diâmetro no hemisfério esquerdo, 1,5 milímetros anterior e 3,5 milímetros laterais ao bregma. Insira aproximadamente dois milímetros de fio de referência no orifício enquanto enrola o fio ao redor e sob a cabeça do parafuso implantado. Em seguida, implante totalmente o parafuso, prendendo o eletrodo de referência no lugar.

No hemisfério direito, faça um furo de 1,5 milímetro de diâmetro, 1,2 milímetros anterior e 1,4 milímetros lateral ao bregma, e use uma pinça para remover cuidadosamente a dura-máter. Para o eletrodo estimulador, faça um orifício quadrado de dois milímetros ântero-posterior e cinco milímetros médio-lateral centrado em 5,2 milímetros posterior e um milímetro lateral ao bregma. Usando barras de braço estereotáxicas, abaixe a cânula guia do eletrodo estimulante bipolar cinco milímetros abaixo da dura-máter.

Usando as barras de braço estereotáxicas, abaixe o microeletrodo de fibra de carbono quatro milímetros abaixo da dura-máter na porção mais dorsal do estriado e conecte o fio de referência e a fibra de carbono a um potenciostato. Em seguida, aplique uma forma de onda triangular de menos 0,4 a 1,4 volts, 400 volts por segundo por 15 minutos a 60 Hertz, seguida por um estímulo de 10 minutos a 10 Hertz. Para otimizar a localização do eletrodo de estimulação, configure o estimulador para produzir uma forma de onda elétrica bipolar com frequência de 60 Hertz, 24 pulsos, corrente de 300 microamperes e largura de pulso de dois milissegundos por fase.

Abaixe suavemente o estimulador em incrementos de 0,2 milímetros de 5 a 7,8 milímetros abaixo da dura-máter, estimulando o VTA a cada incremento. Continue a abaixar a cânula guia do eletrodo de estimulação bipolar até que uma estimulação produza liberação fásica de dopamina no microeletrodo de fibra de carbono dentro do estriado dorsal. Uma vez observada a liberação de dopamina, abaixe o microeletrodo de fibra de carbono até que esteja pelo menos seis milímetros abaixo da dura-máter na parte mais dorsal do núcleo accumbens.

Quando o eletrodo estiver em posição, estimule o VTA e registre a amplitude do pico do pico de dopamina, depois abaixe ou eleve o microeletrodo de fibra de carbono até o local que produz a maior liberação de dopamina, certificando-se de que o pico da resposta da dopamina seja representado como um pico de oxidação claro em 0,6 volts e um pico de redução em menos 0,2 volts. Uma vez otimizada a localização da cânula guia de fibra de carbono e eletrodo estimulante, estimular o animal a cada três minutos por 20 a 30 minutos. Depois de atingir uma linha de base estável, abaixe suavemente a cânula interna manualmente na cânula guia pré-encaixada no estimulador bipolar e obtenha dois a três registros de linha de base adicionais para confirmar que a inserção da cânula não causou uma alteração no sinal evocado.

Uma vez estabelecida uma resposta basal, use uma bomba de seringa e uma microsseringa para infundir 0,5 microlitros da solução do medicamento de interesse no VTA durante um período de dois minutos. Após a infusão, deixe a cânula interna no lugar por pelo menos um minuto antes da remoção, continuando a registrar a resposta a cada três minutos para medir os efeitos pós-infusão. Conforme demonstrado nesses gráficos de cores representativos, a infusão de solução salina não altera a liberação de dopamina fásica estimulada.

A infusão de NMDA produz um aumento robusto na liberação de dopamina fásica estimulada, enquanto o antagonista competitivo do receptor NMDA, AP5, produz uma diminuição robusta. Tanto o antagonista do receptor nicotínico de acetilcolina não competitivo mecamilamina quanto o antagonista competitivo não seletivo do receptor de acetilcolina muscarínico escopolamina produzem uma diminuição robusta na liberação de dopamina fásica estimulada. Neste gráfico, pode-se observar um resumo dos efeitos dos medicamentos testados ao longo do tempo.

A cânula de infusão deve ser cuidadosamente inserida no eletrodo estimulante bipolar. Caso contrário, podem ocorrer danos excessivos, levando a mudanças artificiais na liberação fásica de dopamina. Essa abordagem permitiu que os investigadores abordassem com mais precisão os mecanismos específicos do receptor pelos quais a liberação fásica de dopamina é regulada in vivo.