Name: In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a avaliar a eficiência de transdução de peptídeos de penetração celular usando imagem in vivo e ex vivo em camundongos CD1. Este protocolo otimiza a coleta de dados de um único animal, reduzindo o número de animais necessários para estudos de biodistribuição tecidual.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.Z. e K.S.F. são apoiados pelo American Heart Association Scientist Development Award 17SDG3341180, e por uma bolsa concedida sob o Pitt Innovation Challenge (PInCh®), através do Instituto de Ciência Clínica e Translacional da Universidade de Pittsburgh.

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh aprovou todos os protocolos de animais especificados nesta publicação antes de realizar qualquer um desses experimentos em animais.
NOTA: Este protocolo detalha como realizar estudos de biodistribução ex vivo utilizando imagens fluorescentes ópticas ex vivo seguidas de estudos de biodistribução in vivo incorporando os órgãos em parafina, secção e realização de microscopia fluorescente. Embora o CTP seja usado como exemplo, este método pode ser aplicado a qualquer CPP rotulado fluorescentemente.
1. Imagem in vivo
<ol><li>Sintetizar CTP utilizando técnicas de síntese de fase sólida9,10 de uma instalação de síntese de peptídeos usando L-aminoácidos com um N-terminus rotulado com Cy5.5 e C-terminus amide-capped para maior estabilidade. NOTA: Todos os CPPs sintetizados devem ser caracterizados por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) antes do uso11.</li>
	<li>Faça uma solução de estoque de 1 mM ou 10 mM de CTP em sulfóxido de dimetila (DMSO), aliquot e armazene a -80 °C, protegido por luz. NOTA: Os peptídeos são entregues como pó liofilizado. O pó linofilizado pode ser armazenado a longo prazo (6 meses-2 anos) em -20 °C, protegido pela luz e sob condições higroscópicas. Quando aliquoso em DMSO e armazenados, os ciclos de congelamento devem ser evitados.</li>
	<li>Pesar e anestesiar camundongos cd1 de 6 semanas de idade usando 2 μL/g de peso tecidual de uma solução de cetamina/xilazina (100 mg/kg de cetamina e 20 mg/kg xylazine) administrados intramuscularmente (perna traseira) ou intraperitoneal (quadrante inferior esquerdo). NOTA: As soluções de cetamina/xilazina devem ser feitas frescas no dia do uso. A cetamina/xilazina não utilizada deve ser eliminada adequadamente e os volumes utilizados versus volumes descartados em um tronco, uma vez que a cetamina é uma substância controlada. O nível adequado de anestesia será alcançado em 5-7 min, conforme avaliado pela falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo.</li>
	<li>Calcule uma dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, dilua com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para não mais de 200 μL, e injete retro-orbitalmente ou através da injeção da veia traseira usando uma seringa de insulina(Figura 1A).</li>
	<li>Deixe que o peptídeo circule pelo tempo pré-especificado, variando de 15 min-6 h.</li>
	<li>Eutanize o camundongo utilizando o método inalatório de CO2 elevado, conforme especificado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e abra a cavidade torácica usando uma tesoura(Figura 1B).</li>
	<li>Use uma tesoura para colocar um pequeno corte na parede lateral e livre do átrio direito e injetar 3 mL de fosfato formalina tamponado de 10% usando uma agulha de 26 G para o duplo propósito de fixação dos órgãos do mouse e descarga de glóbulos vermelhos(Figura 1C).</li>
	<li>Disseque coração, pulmão, fígado, rins, baço, intestino grosso, intestinos delgados, bexiga, ovários/testículos, e cérebro e coloque em poços individuais de uma placa de 12 poços para imagem óptica ex vivo(Figura 1D).</li>
	<li>Inicie o software de aquisição de imagens e clique no botão Iniciar para preparar o sistema para amostras de imagens. Abra o assistente de imagem, selecione fluorescência e, em seguida, estruca o corante Cy5.5 da lista de corantes para aplicar 580 nm excitação e filtros de emissão de 620 nm. Selecione as configurações manuais para parâmetros de exposição e, em seguida, defina a posição do palco para B, defina o tempo de exposição para 1 segundo, defina o F/stop para 8 e defina a binning para pequena. NOTA: Os filtros de emissão de excitação variam dependendo do rótulo utilizado. A excitação e a emissão do rótulo utilizado podem ser introduzidos manualmente para que o software atribua filtros de excitação e emissão. Certifique-se de que as contagens estão entre 600-60.000 para evitar a saturação. Dependendo do sistema que está sendo utilizado, a otimização automática de aquisição pode estar disponível. Se o sistema tiver compensação para comparar imagens adquiridas com diferentes configurações, as configurações automáticas podem ser usadas. Se não houver compensação disponível, as configurações precisarão ser determinadas, salvas e usadas consistentemente entre as amostras.</li>
	<li>Quando o sistema estiver completamente inicializado, organize os órgãos de interesse em uma placa de 12 poços e coloque-o dentro da câmara de imagem óptica, garantindo que as amostras sejam organizadas conforme desejado para as imagens. Selecione a aquisição e selecione um local de salvamento para as imagens. Informações sobre o mouse podem ser escritas na janela pop-up de etiquetas de imagem de edição.</li>
	<li>Após a imagem, remova as amostras da câmara e armazene em fosfato de formalina 10% tamponado em um volume pelo menos 20 vezes o volume do tecido em frascos de cintilação com proteção luminosa à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Quantifique as imagens definindo unidades para A Eficiência Radiante, selecionando o ROI 4x3 e ajustando-se para encaixar cada poço em um quadrado do ROI uniformemente, seguido pela medida de clique. Abra a guia de medição do ROI da grade, selecione a exportação e salve as medidas como um arquivo .cvs.</li>
</ol>2. Histologia
NOTA: Siga as etapas 1.1-1.8 para obter diferentes órgãos. Alternativamente, os mesmos órgãos que foram imageados podem ser colocados em formalina imediatamente e usados para secção conforme detalhado abaixo.
<ol><li>Armazene cada órgão individualmente em fosfato de formalina tamponada de 10% por um mínimo de 48 h antes de processar para histologia.</li>
	<li>Quando os órgãos estiverem suficientemente fixos após 48h, transfira os órgãos para o processamento tecidual e incorpore e coloque em uma máquina de processamento de tecidos(Figura 1E).</li>
	<li>Defina a máquina de processamento para desidratar o tecido em 70% de etanol por 30 min, seguido de 80% de etanol para 30 min, 95% de etanol para 30 min, 95% de etanol por 30 min, 100% etanol por 15 min, 100% etanol por 20 min e, finalmente, 100% etanol por 20 min.</li>
	<li>Limpe o tecido em xileno 2x, com 30 minutos para cada tratamento de xileno.</li>
	<li>Infiltrar-se no tecido limpo com cera de parafina 4x a 60 °C por 30 minutos a cada tratamento.</li>
	<li>Incorporar em parafina usando moldes de metal. Encha o molde com parafina derretida (mantida a 65 °C) e transfira para uma placa fria. À medida que a parafina na parte inferior do molde começa a se solidificar, coloque o órgão na parafina(Figura 1F).</li>
	<li>Coloque uma fita adesia rotulada em cima do molde como apoio e enchimento com parafina derretida. Deixe esfriar até ficar sólido. Em seguida, armazene o bloco em um congelador de -20 °C durante a noite, permitindo que a cera encolha ainda mais para fácil remoção dos moldes. NOTA: Os blocos agora podem ser armazenados em RT com proteção contra luz.</li>
	<li>Prepare um banho de água de 38 °C com água destilada. Configure o microtome com um ângulo de lâmina de 6° e uma espessura de seção de 10 μm.</li>
	<li>Monte os blocos teciduais no microtoma e comece a cortar até que seções que contenham tecido sejam obtidas. Em seguida, coloque os blocos de frente para baixo na água por 5 minutos ou até que o tecido tenha absorvido alguma umidade (por exemplo, quando um contorno branco fino do tecido aparece no bloco [Figura 1G]). NOTA: A lâmina deve ser substituída com frequência para garantir a qualidade das seções.</li>
	<li>Coloque o tecido sobre um bloco de gelo plano por 10 minutos, depois devolva-o ao microtome na mesma orientação que na etapa 2.9. Comece a tomar seções e permita que seções truncadas formem fitas longas de 6 a 10 seções cada. Descarte fitas de parafina subótimas até que uma fita de alta qualidade de comprimento suficiente para cobrir um slide seja produzida. Otimize a secção ajustando as velocidades de corte, a hidratação dos tecidos e a temperatura do banho de água, a fim de evitar o corte ou rugas das seções teciduais. NOTA: Devem ser descartadas seções que tenham orifícios onde o tecido caiu, rasgos no tecido ou rugas apertadas e dobras no tecido.</li>
	<li>Escolha cuidadosamente a fita de qualidade escolhida com fórceps de borda sem corte e flutue na superfície do banho de água de 38 °C. Deixe as seções sentarem na superfície até que suavizem, tomando cuidado para não deixá-las muito tempo para evitar que a parafina se desinte com a separação e despedaçasse a seção.</li>
	<li>Flutue as seções achatadas para a superfície de lâminas de vidro limpas. Coloque os slides em um forno de 65 °C por 30 minutos para derreter a cera. NOTA: Estes slides podem ser armazenados em RT com proteção contra luz.</li>
	<li>Desparafinar os slides em xileno 3x, 10 min para cada tratamento.</li>
	<li>Reidratar o tecido em 100% etanol por 5 min, seguido por 95% de etanol por 5 min, 70% etanol por 5 min, 50% etanol por 5 min, e finalmente 1x soro fisiológico tris-tampão (TBS) por 5 min (Figura 1H). Deixe os slides secarem durante a noite. NOTA: Estes slides podem ser armazenados a longo prazo no RT, desde que estejam protegidos pela luz.</li>
	<li>Monte os slides com tampas usando 125 μL de mídia de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI), uma sonda fluorescente nuclear(Figura 1I). Lâminas secas durante a noite no RT, protegidas pela luz. NOTA: As lâminas secas podem ser armazenadas a longo prazo a 4 °C, protegidas por luz.</li>
	<li>Slides de imagem usando microscopia fluorescente. NOTA: Imagens saturadas devem ser evitadas, pois não são quantitativamente úteis. O ajuste das configurações de exposição e ganho pode ser reduzido para evitar a saturação. Tenha o cuidado de usar as mesmas configurações em todas as amostras que estão sendo comparadas. Evite branqueamento do tecido limitando os tempos de exposição.</li>
</ol>

<ol><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+functional+domains+of+chemically+synthesized+human+immunodeficiency+virus+tat+trans-activator+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.</a> Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+penetrating+peptides%3A+therapeutic+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges.</a> Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tissue-specific+protein+transduction+domains+using+peptide+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display.</a> Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cardiac+specific+protein+transduction+domain+by+in+vivo+biopanning+using+a+M13+phage+peptide+display+library+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice.</a> PLoS One. 5 (8), e12252(2010).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Targeting+Peptide%2C+a+Novel+Cardiac+Vector%3A+Studies+in+Bio-Distribution%2C+Imaging+Application%2C+and+Mechanism+of+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction.</a> Biomolecules. 8 (4), E147(2018).</li>
<li>Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+of+modern+solid+phase+Peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis.</a> Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).</li>
<li>Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+peptides+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of peptides on solid phase.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).</li>
<li>Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Synthetic+Peptides+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).</li>
<li>Arms, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+Limitations+of+Current+Techniques+for+Analyzing+the+Biodistribution+of+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 802(2018).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+your+label+wisely%3A+water-soluble+fluorophores+often+interact+with+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
<li>McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Ex+Vivo+Whole-organ+Imaging+and+Quantitative+Tissue+Histology+to+Determine+the+Bio-distribution+of+Fluorescently+Labeled+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

M.Z. e Paul D. Robbins (Universidade de Minnesota, Minnesota, MN, EUA) possuem uma patente sobre o uso de peptídeo de alvo cardíaco como vetor cardíaco (domínio de direcionamento de proteínas específicas para o coração, Série de Patentes dos EUA nº 9.249.184). M.Z. também atua como Chief Scientific Officer e está no Conselho de Administração da startup Vivasc Therapeutics Inc. e detém um patrimônio futuro substancial nele.

Modelos animais são essenciais para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos em todas as etapas do processo, desde a identificação de novos CPPs, estudos de biodistribução, mecanismo de transdução, até, em última instância, testes para a eficácia da carga entregue usando esses novos CPPs como vetores. Existem muitos métodos comumente usados disponíveis para avaliar a biodistribução, como histologia, imagem de medicina nuclear (SPECT e PET), e imagem óptica in vivo12. Os métodos de imagem nuclear podem ser complicados devido à disponibilidade limitada de pequenos sistemas SPECT e PET animais, bem como a capacidade de produzir conjugados radiolabel-droga, que requerem a experiência de um radioquímico. Em contraste, os rótulos fluorescentes são muito mais simples e podem ser econômicos para trabalhar. O protocolo descrito neste artigo permite uma análise rápida da biodistribução utilizando múltiplos métodos. A imagem óptica fluorescente de órgãos ex vivo permite a comparação imediata da fluorescência em diferentes tecidos e grupos de tratamento e pode identificar a captação de órgãos e o tempo para o pico de captação de órgãos de interesse de forma semiquantitativa. A histologia quantitativa do tecido requer processamento mais extenso para tratar, seção, imagem e analisar tecidos, mas fornece mais dados sobre o nível microscópico e é uma técnica padrão atual. Vale ressaltar que a comparação direta e quantitativa entre as duas técnicas não é possível, pois a autofluorescência observada com cada técnica para diferentes órgãos e comprimentos de onda de excitação varia significativamente.
Uma parte importante deste protocolo é selecionar o fluoróforo certo para rotular CPPs candidatos para experimentos. Um problema em potencial é a sobreposição de espectros, o que pode ser problemático quando são necessários fluoroforos múltiplos. A mídia de montagem fluorescente DAPI e cy5.5 não têm espectros sobrepostos. No entanto, para certas aplicações onde são necessários fluoroforos múltiplos, o risco de sobreposição espectral precisa ser cuidadosamente considerado. Dependendo do sistema que está sendo utilizado, a seleção fluorófora pode ser limitada. Portanto, o conhecimento das capacidades do sistema é fundamental. Sistemas ópticos fluorescentes são melhor utilizados com fluoroforos vermelhos ou quase infravermelhos devido à alta absorção tecidual de comprimentos de onda mais curtos13. Fluoroforos na gama de proteína fluorescente verde aumentada têm uma grande limitação, porque há autofluorescência significativa de órgãos vistas em seu comprimento de onda de excitação, especificamente no cérebro e tecido hepático. Dependendo das condições de um experimento, alguns fluoroforos são melhor evitados. Alguns fluoroforos orgânicos solúveis em água têm uma forte interação com bicamadas lipídicas, o que pode causar falsos positivos. Assim, tomar medidas para determinar se um fluoróforo tem forte afinidade com o tecido de interesse é aconselhável14. Outro fator a considerar é selecionar o método apropriado de conjugação fluorófora, que pode ser um parâmetro importante que afeta os resultados. Os CPPs podem ser rotulados fluorescentemente no n- ou C-terminus através de uma ligação covalente entre o N-terminus do peptídeo e o grupo carboxyl do corante como Cy5.5-NHS. Deve-se tomar cuidado, pois o mecanismo de transdução da maioria das CPPs não é compreendido em detalhes e a conjugação em uma extremidade pode afetar mais o mecanismo de absorção do que na outra extremidade. Outra possibilidade de rotular CPPs é através da biotininging do N-terminus para conjugação para streptavidina fluorescentemente rotulado. O uso dessa estratégia tem a conveniência de permitir que diferentes conjugados fluorescentes de streptavidina sejam utilizados. No entanto, uma possível limitação dessa estratégia é que um complexo biotina-streptavidina é uma grande construção, que poderia potencialmente interferir na transdução.
Sistemas de imagem óptica fluorescente são uma estratégia eficaz para gerar comparação da fluorescência entre diferentes órgãos e tratamentos de forma eficiente, mas são incapazes de produzir uma medida quantitativa de concentrações absolutas no tecido. Isso se deve aos efeitos de dispersão da luz dentro do tecido, que é ainda mais agravado pela variedade natural em tamanhos e densidades teciduais, e diferenças na vascularização, com dispersão variável de fluorescência. A autofluorescência tecidual também pode ser um fator, devido a fontes bioquímicas de ocorrência natural, como colágeno, ou fontes dietéticas como clorofila nos alimentos13.
A histologia é o método mais usado para medir a biodistribução e pode potencialmente ser usado para medir e comparar com precisão a absorção entre diferentes tecidos ao longo do tempo. Problemas de dispersão de luz são evitados usando este método porque todos os tecidos são seccionados para a mesma espessura15. Uma grande vantagem deste método é a capacidade de incluir rótulos fluorescentes adicionais para a imunohistoquímica. Embora a adição de outro fluoróforo possa tornar a imagem mais desafiadora, o uso de rótulos fluorescentes pode ser útil para a localização de um CPP para compartimentos intracelulares particulares, como lysosomes ou mitocôndrias. Um anticorpo poderia ser usado em um experimento de microscopia confocal para determinar se um CPP candidato transduzido coloca com uma estrutura de interesse, o que pode mostrar o potencial de um CPP como agente de entrega. Uma limitação deste método é que a preparação de slides a partir de amostras de órgãos pode ser demorada, trabalhosa intensiva e propensa a erro humano12,15. Ao deslizar de imagem, deve-se tomar cuidado para não imaginar o mesmo local por muito tempo para evitar fotobleaching. Algumas fotos serão inevitáveis, dependendo da sensibilidade do fluoróforo. Deve-se tomar cuidado em cada etapa deste protocolo para proteger as amostras da luz ambiente e armazená-las adequadamente16. Recomendamos que os slides sejam armazenados a 4 °C, protegidos por luz, para imagens futuras.
Existem uma variedade de métodos disponíveis para medir a biodistribução de um CPP candidato que requerem equipamentos especializados e podem produzir resultados comparáveis, embora possam exigir rotulagem CPP mais complexa. O protocolo descrito neste artigo utiliza dois métodos compatíveis para produzir dados de biodistribução eficientemente no contexto de um sistema vivo, permitindo a aquisição de informações mais aprofundadas sobre a internalização do peptídeo dentro das células da mesma amostra, reduzindo pela metade o número de animais necessários para um estudo. Esses métodos foram utilizados para gerar os dados acima, que demonstram que ambos os métodos podem ser utilizados sequencialmente no mesmo animal, e a qualidade dos dados gerados por cada um. Nossos resultados também destacam a incapacidade de correlacionar diretamente os resultados entre as duas técnicas de forma quantitativa.

A membrana plasmática celular é uma barreira semipermeável que é essencial para a integridade e sobrevivência celular e serve para regular o interior da célula controlando o movimento das substâncias para dentro da célula. Embora vital para a sobrevivência, também apresenta uma barreira para a entrega de carga para a célula. Em 1988, o trans-ativador da proteína de transcrição (Tat) do vírus da imunodeficiência humana foi mostrado para entrar em células cultivadas e promover a expressão genética viral1,,2, com os domínios responsáveis por essa transdução limitada a uma região rica em arginina e liinoácidos da terceira hélice3 Estes foram assim chamados peptídeos penetrantes de células (CPPs). Isso foi seguido por pesquisas que mostram a capacidade do peptídeo Tat de transportar β-galactosidase funcional em múltiplos tipos de células4. Desde a descrição inicial, o número de peptídeos penetrantes por células aumentou dramaticamente. Esses domínios de transdução são peptídeos curtos naturais ou sintéticos, tipicamente de 6 a 20 aminoácidos de comprimento, que são capazes de transportar cargas funcionais através de membranas celulares. Essas cargas podem variar de outros pequenos peptídeos, proteínas de comprimento total, ácidos nucleicos, nanopartículas, partículas virais, moléculas fluorescentes e radioisótopos5. Os CPPs iniciais descritos não eram específicos de células, com Tat sendo tomada por vários tipos de células e até mesmo cruzando a barreira hemencefálica4, limitando assim seu potencial terapêutico. Para identificar CPPs específicos para células, os investigadores realizaram uma exibição de phage utilizando grandes bibliotecas de phage disponíveis comercialmente6. Nosso próprio trabalho utilizando uma metodologia combinatória de exibição in vitro e in vivo phage levou à identificação de um CPP chamado peptídeo de alvo cardíaco (CTP)7, um peptídeo de 12 aminoácidos, que ocorre nonnaturalmente (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) que tem como alvo o coração com pico de captação de 15 minutos após uma injeção intravenosa periférica8. Utilizando a colocalização imunofluorescente com actina, um marcador intracelular, e exclusão de laminina, um marcador de membrana celular, mostramos que a CTP é internalizada em cardiomiócitos de camundongos após uma injeção intravenosa7. Além disso, incubamos cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos por humanos com CTP de dupla rotulação, rotulado com 6-carboxyfluoresceína em seu C-terminus e rhodamina em seu n-terminus através de uma ligação ester que só poderia ser cortada por esterases intracelulares. O rápido acúmulo de rhodamina em cardiomiócitos de espancamento foi observado dentro de 15 minutos na microscopia confocal8.
Neste artigo, apresentamos duas metodologias complementares que podem ser utilizadas para rastrear a biodistribução e confirmar a internalização específica do tecido das CPPs usando CTP como exemplo. Para essas metodologias, a CTP foi sintetizada, fluorescentemente rotulada no N-terminus com cianeto5.5 (CY5.5), e com amida-tampada no C-terminus para maior estabilidade do peptídeo. As duas metodologias utilizadas são sistemas de imagem óptica fluorescente in vivo e microscopia fluorescente de seções teciduais. Ambos os métodos são muito úteis no estudo da biodistribução, absorção e eliminação de CPPs fluorescentes rotulados. A vantagem de avaliar a biodistribução usando esses métodos em relação a outros, como tomografia de emissão de fótons único (SPECT) ou tomografia de emissão de pósitrons (PET), é que não há necessidade de rotulagem de radiolacção intensiva de CPPs em comparação com a rotulagem fluorescente, que é relativamente fácil e em uso rotineiro em todas as instalações de síntese de peptídeos. O uso de imagens in vivo produz rapidamente dados de biodistribução no contexto de um sistema vivo, enquanto a secção fornece maior informação aprofundada sobre a absorção de peptídeos e a localização dentro das células através da preservação de detalhes morfológicos. Este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de órgãos e tecidos como coração, pulmão, fígado, rim, cérebro, baço, estômago, intestino grosso, intestino delgado, músculo esquelético, osso, testículos/ovários e olhos.

<table><tbody><tr><td>Fosfato de formalina tampolado a 10%</td><td>ThermoFisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2471-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 12 poços</td><td>ThermoFisher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS Solução</td><td></td><td></td><td>10x TBS é diluído 1:10 com água deionizada. Esta solução pode ser armazenada em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de 20 mL</td><td>Wheaton</td><td>334173</td><td></td></tr><tr><td>26G Agulhas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>28G 0,5ml Seringas de insulina</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td>6 a 12 semanas de idade albino, camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Tampa de vidro</td><td>ThermoFisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-CTP-amida</td><td></td><td></td><td>Preparado por síntese peptídica, conjugado com fluoróforo Cy5.5 e purificado usando HPLC. O pó liofilizado é reconstituído em DMSO na concentração de 10mM. Após a reconstituição, armazene a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina HCl 100mg / mL</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td> <td>de Cetamina / Xilazina</td><td>A cetamina HCl é misturada com xilazina 1:1 para produzir uma solução estoque contendo 50mg/mL de cetamina e 10mg/mL de xilazina. Esta solução é feita fresca antes de cada uso.</td></tr><tr><td>Leica RM2235 Micrótomo Rotativo</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>ThermoFisher</td><td>B9992000TN</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Sigma</td><td>P3808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Lumina S5 IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>Sparkle Optical Lens Cleaner</td><td>ThermoFisher</td><td>NC0090079</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Processing/ de Incorporação</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9499605</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP Máquina de processamento</td><td>Tissue-Tek</td><td>VIP 5A-F1</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 20 mg/mL</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>ThermoFisher</td><td>X5-4</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagem de eficiências de transdução de peptídeo de direcionamento cardíaco

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Desde a descrição inicial dos domínios de transdução de proteínas, também conhecidos como peptídeos penetrantes celulares, há mais de 25 anos, tem havido intenso interesse no desenvolvimento desses peptídeos, especialmente os específicos de células, como novos vetores para a entrega de materiais diagnósticos e terapêuticos. Nosso trabalho anterior envolvendo exibição de phage identificou um novo, nonnaturally ocorrido, 12 peptídeos de aminoácidos de comprimento que chamamos de peptídeo de alvo cardíaco (CTP) devido à sua capacidade de transdufar tecido cardíaco normal in vivo com captação máxima vista em apenas 15 minutos após uma injeção intravenosa. Realizamos estudos detalhados de biodistribução injetando CTP rotulado com cianeina fluorofora5.5, permitindo que ele circule por vários períodos de tempo, e eutanásia, fixação e secção de múltiplos órgãos seguidos de imagens de microscopia fluorescente. Nesta publicação, descrevemos esses processos, bem como ex vivo de imagens de órgãos colhidos utilizando um sistema de imagem in vivo em detalhes. Fornecemos metodologias e práticas detalhadas para a realização de estudos de transdução, bem como estudos de biodistribução utilizando o CTP como exemplo.

Usando este protocolo, tratamos três camundongos com uma dose de 10 mg/kg de Cy5.5-CTP através de uma injeção retro-orbital(Figura 1A). Depois de permitir que o peptídeo circulasse por 15 minutos, os camundongos foram eutanizados usando uma câmara de CO2, o peito aberto através de uma incisão de esternotomia mediana, o átrio direito foi cortado, e a perfusão de camundongos fixada usando 3 mL de formalina tamponada de fosfato de 10%(Figura 1B,C). Após a fixação, o coração, pulmões, fígado, rim, baço e cérebro foram dissecados e dispostos em uma placa de 12 poços para imagem fluorescente óptica ex vivo(Figura 1D e Figura 2A). Três camundongos de controle sem injeções também foram perfundidos, dissecados e imageados(Figura 1B-D e Figura 2B). Os dados de fluorescência adquiridos para cada conjunto de órgãos podem ser comparados devido à contagem sendo convertida em eficiência radiante, a unidade relativa de fluorescência do software de imagem. Esses dados podem ser quantificados para produzir imagens qualitativas e dados quantitativos para cada órgão em questão (Figura 2C) em diferentes pontos de tempo para estudos de biodistribução. A autofluorescência de diferentes órgãos em resposta a diferentes comprimentos de onda de excitação é demonstrada na Figura 3A−E. Comprimentos de onda de excitação mais curtos, como o aumento da proteína fluorescente verde (EGFP), estão associados com maior autofluorescência, especialmente no fígado e no cérebro, do que os comprimentos de onda de excitação de vermelho-distante (Cy5.5) ou próximos (Cy7)(Figura 3). Os órgãos de imagem foram fixados em formalina tamponada de fosfato de 10% na RT por um mínimo de 48 h, seguida de transferência para processamento tecidual e incorporação de(Figura 1E). Os órgãos foram processados e parafinados em uma máquina de processamento de tecidos, posicionados em moldes cheios de parafina, congelados em um estágio de -20 °C, e armazenados durante a noite a -20 °C (Figura 1F). As amostras foram seccionadas(Figura 1G) e tratadas com trocas de solução para reidratar o tecido(Figura 1H). Os slides preparados foram então montados com meio de montagem fluorescente DAPI(Figura 1I). Uma vez secos, geralmente durante a noite, os slides foram imagens usando microscopia fluorescente. Imagens representativas de cada órgão de um rato são mostradas na Figura 4A. As imagens de diferentes órgãos foram adquiridas utilizando configurações idênticas para permitir a comparação entre camundongos e permitir quantificação(Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig1.jpg"> Figura 1: Colhendo órgãos de camundongos para imagem fluorescente óptica ex vivo e secção. (A) Rato tipo selvagem injetado retro-orbitalmente com CTP-Cy5.5. (B) Mouse dissecado com peito aberto, átrio direito cortado, para fixação de perfusão. (C) Coração injetado com 3 mL de fosfato formalina tamponado de 10% para fixação de perfusão do animal. (D) Órgãos de interesse colhidos e dispostos em uma placa de 12 poços para imagem óptica fluorescente. (E) Coração carregado em um e processado usando um processador de tecido. (F) Coração embutido na parafina. (G) Coração seccionado em um microtome. (H) Slides desparaffinizados através de uma série de trocas de soluções. (I) Seções montadas com deslizamentos de tampas utilizando DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2.jpg"> Figura 2: Imagens representativas de órgãos tratados e de controle. (A) Órgãos de um rato tratado com 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Órgãos de um rato de controle não tratado. (C) Quantificação da fluorescência para cada conjunto de órgãos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2.jpg"> Figura 3: Órgãos de camundongos não tratados retratados em diferentes comprimentos de onda de emissão de excitação para demonstrar como comprimentos de onda mais longos produzem menos autofluorescência. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig4.jpg"> Figura 4: Transdução de coração, pulmão, fígado e rim após injeção intravenosa em camundongos. Os camundongos do tipo selvagem foram injetados com 10 mg/kg de Cy5.5-CTP, ou um peptídeo aleatório (RAN-Cy5.5), e eutanizados nos pontos de tempo indicados. (A) A transdução de pico do tecido cardíaco foi observada em 15 min com diminuição constante da fluorescência ao longo do tempo. Alguma captação capilar foi notada nos pulmões com transdução robusta no fígado, bem como nos capilares glomerulares renais, este último implicando um mecanismo renal de excreção. (B) Quantificação da intensidade fluorescente mostra aumento significativo da absorção cardíaca de CTP-Cy5.5 sobre RAN-Cy5.5. Barra de escala = 500 μm. Este número foi modificado de Zahid et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Nosso protocolo nos permite rastrear a bioco distribuição e confirmar a internalização específica do tecido de um peptídeo de interesse usando duas metodologias separadas, mas complementares. Podemos usar este protocolo para maximizar os dados obtidos de um único animal e adquirir dados quantitativos de imagem de fluorescência axial. Além disso, podemos obter imagens qualitativas de microscópio.Depois de adquirir CTPs de mide cap de fase sólida sintetizadas com um termo N-terminus rotulado com Cy5.5 de uma instalação de síntese de peptídeos, faça uma alíquota de solução de um ou 10 milmolares de CTP em sulfóxido de dimetil para armazenamento a menos 80 graus Celsius protegido da luz. No dia do experimento, carregue uma dose de 10 miligramas por quilograma de Cy5.5 CTP em 200 microliters de PBS em uma seringa de insulina. Pesar um rato e entregar o peptídeo intravenosamente no rato CD1 feminino anestêmido de seis semanas de idade.Permita que o peptídeo circule pelo período experimental pré-especificado antes de eutanásia do mouse usando uma câmara de CO2 de alto fluxo e usando uma tesoura para abrir a cavidade torácica e fazendo um pequeno corte na parede livre lateral do átrio direito. Use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha calibre 26 para permear três mililitros de fosfato formalina 10% tamponado através do ápice ventricular esquerdo para fixar os tecidos e para expelir quaisquer glóbulos vermelhos. Em seguida, colete o coração, pulmão, fígado, rins, baço, intestinos grandes e pequenos, bexiga, ovários ou testículos, e cérebro em poços individuais de uma placa de 12 poços para imagem óptica ex vivo.Para imagens in vivo das imagens transduzidas ctp, inicie o software de aquisição de imagens e clique em Iniciar para preparar o sistema para imagem. Abra o assistente de imagem e selecione Fluorescência e Pares de filtros. Clique em Nomes, Corantes, Cianeto e Cy5 para definir os parâmetros de excitação e emissão.E clique em Configurações Manuais para definir a exposição em um segundo, o binning para pequeno, o F/Stop para oito e o campo de visão para 15 centímetros. Clique em Adquirir e defina a pasta para salvar as amostras. Adicione as informações experimentais apropriadas na janela de etiquetas de imagem de edição e clique em OK. A imagem adquirida aparecerá.Defina as unidades para uma eficiência radiante. Clique duas vezes na imagem e clique em Correções e Subtração de Fundo Fluorescente Adaptável. Ajuste o limiar para cobrir apenas os órgãos de interesse com roxo.Alternativamente, clique com o botão direito do mouse e selecione Área de Cultura para desenhar uma caixa contendo todas as amostras de interesse. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, transfira as amostras para frascos de cintilação contendo fosfato formalina 10% tamponado em um volume de pelo menos 20 vezes o do tecido e armazene os tecidos à temperatura ambiente protegidos da luz por pelo menos 48 horas. Para quantificar as imagens, defina as unidades como eficiência radiante e a região de interesse para quatro por três.Ajuste a caixa de interesse da região para cobrir uniformemente todos os poços e clique em Medir Regiões de Interesse. Em seguida, clique em Grades Região de Interesse para corresponder às células da região de interesse e clique em Exportar para salvar os dados em um texto ou arquivo CSV. Quando os órgãos estiverem suficientemente fixos após um mínimo de 48 horas, transfira as amostras para o processamento de tecidos e incorpore e carregue as fitas em uma máquina de processamento de tecidos.Defina o processador para desidratar o tecido com etanol como indicado, seguido de compensação com dois tratamentos de xileno de 30 minutos e infusão de parafina com quatro tratamentos de parafina de 30 minutos. Após o último tratamento de parafina, remova os tecidos da máquina de processamento. Coloque os tecidos em moldes metálicos individuais e forque cada molde com parafina derretida.Coloque os moldes em uma placa fria. À medida que a parafina no fundo do molde começa a se solidificar, coloque os órgãos na parafina. Quando todos os órgãos tiverem sido colocados, coloque uma fita rotulada em cima do molde como apoio e enchia demais os moldes com parafina derretida.Deixe a parafina esfriar até ficar sólida antes de armazenar os blocos a menos 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, configure um microtómeo com um ângulo de lâmina de seis graus e uma espessura de seção de 10 micrômetros e monte os blocos de tecido no microtome. Comece a cortar até que as seções que contenham o tecido sejam obtidas e coloque os blocos de frente para baixo em um banho de água destilado de 38 graus Celsius por cinco minutos ou até que o tecido tenha absorvido alguma umidade.Quando um contorno branco fino do tecido aparecer no bloco, coloque o tecido em um bloco de gelo plano por 10 minutos antes de devolvê-lo ao microtome na mesma orientação que estava apenas carregado. Comece a obter fatias permitindo que seções truncadas formem fitas longas de seis a 10 seções cada. Para garantir uma aquisição bem sucedida da seção de tecidos, mantenha o bloco hidratado.Devolva o bloco ao gelo se a qualidade da seção estiver ruim ou começar a declinar. Descarte fitas de parafina subótimas até que uma fita de alta qualidade de comprimento suficiente para cobrir um slide seja produzida. Use uma borda sem corte para transferir fitas de qualidade para um banho de água de 38 graus Celsius e deixe as seções sentarem na superfície da água destilada até que elas simplesmente sualizem.Flutue as seções achatadas sobre a superfície de um escorregador de vidro limpo e derreta a cera em um forno Celsius de 65 graus por 30 minutos. Para desparafinar os slides, trate as amostras três vezes com xileno por 10 minutos por tratamento. Após o último tratamento de xileno, reidratar os tecidos com imersões de etanol descendente de cinco minutos, como indicado, seguido de uma imersão de cinco minutos em soro fisiológico tris-tampão.Depois de permitir que os slides sequem durante a noite, monte as seções com tampas e 125 microliters de meio de montagem complementados com DAPI e seque os slides durante a noite protegidos da luz antes da imagem por microscopia de fluorescência. Após a fixação, o coração, pulmões, fígado, rim, baço e cérebro de animais experimentais e de controle são dispostos em uma placa de 12 poços para imagem fluorescente óptica ex vivo. Após a conversão das contagens para eficiência radiante, os dados de fluorescência podem ser quantificados para cada conjunto de órgãos.É importante notar que diferentes órgãos demonstram auto-fluorescência em resposta a diferentes comprimentos de onda de excitação. Comprimentos de onda de excitação mais curtos, como a proteína fluorescente verde aprimorada, estão associados a níveis mais altos de auto-fluorescência especialmente no fígado e no cérebro do que comprimentos de onda de excitação muito vermelhos ou quase infravermelhos. A fixação formalina e a incorporação de parafinas de seções teciduais de cada órgão permitem a análise imunofluoroquímica de marcadores celulares de interesse, bem como a quantificação de células imunes ou estromicanas de interesse dentro de cada tecido.Ajuste as configurações de imagem para evitar saturação e acompanhe suas configurações e, em seguida, aplique as mesmas configurações de aquisição a outras amostras no mesmo experimento para consistência e precisão. A imunohistoquímica também pode ser realizada nas seções teciduais se um peptídeo penetrante de células candidato co-localiza com uma estrutura ou proteína de interesse.

in-vivo-imaging-transduction-efficiencies-cardiac-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas usando cardiomiócitos neonatais primários de ratos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia de disco giratório confocal. Isso permite observações detalhadas dos processos celulares em cardiomiócitos vivos.

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

A terapia gênica miocárdica para cardiopatia isquêmica é uma grande promessa para futuras terapêuticas. Aqui, apresentamos um modelo animal de grande porte para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico.

Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

O presente protocolo descreve três métodos de administração de agentes terapêuticos cardioativos em modelo suíno. Suínas crioulas receberam tratamento através de: (1) toracotomia e injeção transepicárdica, (2) injeção transendocárdica por cateter ou (3) infusão intravenosa via minibomba osmótica da veia jugular.

Aplicação da Terapêutica Cardioativa em Modelo de Infarto do Miocárdio Porcino

O folículo piloso é um apêndice altamente complexo da pele contendo uma multiplicidade de tipos de células. O folículo sofre ciclismo constante através da vida do organismo, incluindo o crescimento e reabsorção com crescimento dependente das células-tronco específicas. O direcionamento do folículo por genes e células-tronco para alterar suas propriedades, em particular, a natureza do eixo do cabelo é, discutidos. Sistemas de cabelo do folículo de entrega são descritos, tais como lipossomas e...

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

Aprenda a avaliar a eficiência de transdução de peptídeos de penetração celular usando imagem in vivo e ex vivo em camundongos CD1. Este protocolo otimiza a coleta de dados de um único animal, reduzindo o número de animais necessários para estudos de biodistribuição tecidual.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Explorar mais vídeos