Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding
26 de julho de 2021
Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.
Este protocolo permite a simples geração de redes de nanotubos lipídes em larga escala em que os nanotubos individuais exibem comportamento de separação de fase semelhante ao da vesícula dos pais. A principal vantagem dessa abordagem é que cooptamos o trabalho feito pelos motores moleculares para auto-montar os nanotubos lipídicos de forma altamente paralela e sem intervenção humana. Para configurar um ensaio de motilidade deslizante, primeiro, afixe três conjuntos de tiras de fita de dois lados em um deslizamento de vidro a cinco milímetros de distância.
Pressione suavemente um deslizamento de tampa sobre a fita e adicione 30 microliters de uma solução de cinesina de um micromolar na célula de fluxo preparada. Após cinco minutos, adicione 30 microlitrais de uma solução de microtúbulo de 10 microgramas/mililitros na célula, pressionando um limpador de laboratório suavemente contra a extremidade oposta do canal de fluxo para facilitar a troca da solução. Após mais cinco minutos de incubação, lave a célula de uma a três vezes com 50 microliters de solução de motilidade de temperatura ambiente por lavagem antes de adicionar 30 microliters de 10 microgramas/mililiter streptavidin solução à célula de fluxo.
Após 10 minutos, adicione 30 microliters de uma solução GUV de 10X para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione dois microliters de uma solução AMP-PNP de 100 milimões e feche a câmara com selante. Transfira a câmara de fluxo para um microscópio invertido para imagens e selecione o conjunto de filtros apropriado.
Use um objetivo de óleo 100X para focar primeiro a superfície do deslizamento da tampa antes de adquirir uma imagem de uma rede de interesse. Em seguida, abra a imagem no ImageJ e clique em Imagem, Cor e Composto para sobrepor os canais vermelho e verde para criar uma imagem composta. Após a imagem, abra a imagem de interesse e clique em Analisar e Definir escala para calibrar a escala para o microscópio.
Preencha os pixels para o fator de conversão de micrômetros e clique em OK. Use a ferramenta de linha de vários pontos para rastrear os nanotubos a partir do GUV pai e pressione e segure Control e M para medir o comprimento. A ferramenta de processamento de imagens salvará cada nova medição na janela de resultados. Quando todos os tubos tiverem sido medidos, selecione Imagem, Ajuste e Limiar e clique em Aplicar o limiar.
Em seguida, desenhe um retângulo de comprimento conhecido sobre o tubo desejado. Para medir a densidade integrada da área, clique em Analisar e Medir Para determinar o particionamento lipídide nos nós do nanotubo líquido, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o nó de interesse e medir a intensidade do nó nos canais verde e vermelho. Nesta análise representativa, foram fabricadas redes de nanotubos líquidos como demonstrado para gerar fases desordenadas e ordenadas por líquidos, bem como vesículas separadas em fase.
Por exemplo, vesículas sintetizadas com lipídios 45% saturados e lipídios 55% insaturados resultam em vesículas que se separam em fases coexistitárias e sólidas. Se o colesterol for incluído, no entanto, a coexistência líquido-líquido pode então ser observada, criando GUVs que se separam em fases coexistitárias de líquidos e desordenados líquidos. Além disso, os nós podem ser observados dentro das misturas separadas de fase.
A coisa mais importante a se lembrar é escolher o tempo de exposição adequado e o filtro ND definido para ser capaz de visualizar os nanotubos lipídides sem branquear fotos os fluoroforos. A adaptação da composição do comportamento de fase dos nanotubos lipídicos nos permite usar um sistema de modelo minimalista para começar a estudar a biofísica dos nanotubos de tunelamento que conectam as células.
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Visão Geral
Este protocolo permite a geração simples de redes de nanotubos lipídicos em larga escala utilizando a motilidade de quitinesa deslizante. Os nanotubos individuais exibem comportamento de separação de fases semelhante ao das vesículas progenitoras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Biologia Celular
Antecedentes
- Os nanotubos lipídicos são importantes para o estudo da dinâmica da membrana.
- Os motores quitinina facilitam a auto-organização de estruturas lipídicas.
- A separação de fases em sistemas lipídicos pode revelar informações sobre processos celulares.
- Este método melhora a escalabilidade da produção de nanotubos.
Objetivo do Estudo
- Para fabricar redes de nanotubos lipídicos de forma eficiente.
- Para utilizar motores moleculares na autoagregação sem intervenção humana.
- Para explorar o comportamento de fase de nanotubos lipídicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de um ensaio de motilidade deslizante utilizando quinesina e microtúbulos.
- Uso de fita adesiva dupla face para criar uma câmara de fluxo em uma lâmina de vidro.
- Adição sequencial de soluções de quinesina e microtúbulos.
- Lavagem e adição de estreptavidina para facilitar a formação de nanotubos.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de redes de nanotubos lipídicos.
- Demonstração do comportamento de separação de fases nos nanotubos.
- Alta escalabilidade do método devido ao uso de motores moleculares.
- Aplicações potenciais no estudo da dinâmica de membranas e processos celulares.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para fabricar nanotubos lipídicos.
- A utilização de motores quitésicos permite uma automontagem eficiente.
- Essa abordagem pode avançar a pesquisa em biologia lipídica e dinâmica de membranas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A fabricação rápida de redes de nanotubos lipídicos multicomponentes utilizando o ensaio de motilidade de quitinesa deslizante permite modelos in vitro escalonáveis e reprodutíveis para transporte associado à membrana e biofísica lipídica. Esta abordagem apóia a descoberta em estágios iniciais ao fornecer sistemas ajustáveis e biologicamente relevantes que imitam a complexidade dos túbulos lipídicos celulares. O método aumenta a confiança preditiva para estudos mecanicistas e triagem de portfólios em pesquisas terapêuticas direcionadas à membrana.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de mecanismos de transporte de membrana em um sistema controlado e ajustável.
- Apóia a validação funcional de alvos moleculares envolvidos na dinâmica e no transporte de lipídios.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao modelar comportamentos de separação de fases e particionamento de lipídios.
- Oferece uma plataforma para testes de hipóteses sobre interações lipídio-proteína relevantes para vias de doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece preparação reprodutível e escalonável de redes de nanotubos lipídicos para ensaios subsequentes.
- Permite a medição quantitativa do comprimento, largura e particionamento lipídico dos nanotubos, para padronização do ensaio.
- Permite a geração rápida de sistemas lipídicos complexos utilizando equipamentos de laboratório convencionais.
- Permite a triagem de compostos que afetam a estrutura da membrana ou os processos de transporte.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Oferece um modelo relevante para a doença no estudo de nanotúbulos de tunelamento implicados na comunicação intercelular.
- Alinha-se à descoberta translacional de biomarcadores ao permitir a análise do comportamento de fase lipídica e do particionamento.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de intervenções direcionadas à membrana.
- Reduz a ambiguidade biológica na seleção de modelos pré-clínicos para compostos ativos sobre membranas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde estudos mecanicistas iniciais até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para alvos associados à membrana.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias envolvidas no transporte e sinalização mediados por lipídios.
- Triagem: Fornece redes de nanotubos lipídicos prontas para ensaios, reprodutíveis e com propriedades ajustáveis.
- Análises: Permite a medição quantitativa das dimensões dos nanotubos e da partição de lipídios para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta informações mecanicistas obtidas in vitro a fenômenos de membrana relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e escalável, adaptável a diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de biologia de membranas.
- Valor Operacional: Agiliza a fabricação, padronização e reprodutibilidade de sistemas lipídicos complexos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital em portfólios direcionados a membranas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos ativos sobre membranas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em biofísica de lipídios e microscopia de fluorescência para análise quantitativa.
- Requer instrumentação laboratorial padrão para montagem de câmara de fluxo e obtenção de imagens.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de aquisição de imagens e medições.
- Adaptável a diversas composições lipídicas e sistemas modelo para atender diferentes necessidades de pesquisa.
- Depende do controle cuidadoso dos parâmetros de imagem para evitar o desbotamento do fluoróforo.
