Name: Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato e caracterização por RNA-seq. Este método permite estudar biologia epidérmica e perfis de expressão gênica.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bolsa da Universidade Radboud (H.Z.); e bolsa do Conselho de Bolsas chinês 201406330059 (J.Q.).

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<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
<li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li>
<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li>
<li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1%2FK10+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li>
<li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li>
<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
<li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li>
<li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).</li>
<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019).</li>
<li>Doyle, K. aM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+KaM+%22Protocols+and+applications+guide%22">Protocols and applications guide</a>. , Promega Corporation. Madison. (1996).</li>
<li>Roche. Hyperprep Kit. , Available from: 
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<li>Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: 
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<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOrilla%3A+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho descreve um método para induzir a diferenciação de queratinócitos humanos e a caracterização subsequente utilizando análises de RNA-seq. Na literatura atual, muitos estudos sobre diferenciação de queratinócitos humanos utilizam dois outros métodos, com alta concentração de cálcio ou com soro como métodos para induzir diferenciação2,3,23. Um relatório anterior comparou cuidadosamente esses três métodos diferentes<su...

Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme1,2,3,4. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift2,3,5,6,7. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais importantes para avaliar a estrutura e a função epidérmica, os modelos de diferenciação 2D ainda são amplamente utilizados, devido à sua conveniência e à possibilidade de gerar um grande número de células para análises.
Várias condições têm sido aplicadas para induzir a diferenciação de queratinócitos em 2D, incluindo adição de soro, alta concentração de cálcio, menor temperatura e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico2,3. Cada um desses métodos foi validado por uma série de genes marcadores de diferenciação de queratinacitos e mostrou-se eficaz na avaliação da diferenciação de queratinócitos, inclusive em condições patológicas. No entanto, essas condições de indução também mostram diferenças em sua eficiência de diferenciação e cinética quando painéis específicos de genes marcadores são examinados2,3.
Um desses métodos envolve a inibição do contato queratinócito e o esgotamento dos fatores de crescimento no meio da cultura8. Foi demonstrado que os queratinócitos podem se diferenciar espontaneamente quando as células atingem a densidade máxima.  A exclusão dos fatores de crescimento no meio da cultura pode aumentar ainda mais a diferenciação. O método que combina inibição de contato e esgotamento dos fatores de crescimento tem se mostrado para gerar queratinócitos diferenciados com padrões de expressão genética semelhantes à epiderme estratificada normal ao usar vários marcadores epidérmicos3,sugerindo que este modelo é adequado para estudar a diferenciação normal de queratinócitos. Recentemente, duas análises abrangentes de expressão genética da diferenciação de queratinócitos utilizando este modelo foramrelatadas 9,10. Os pesquisadores validaram esse modelo a nível molecular e mostraram que ele pode ser usado para estudar a diferenciação normal e doente do queratinócito.
Este protocolo descreve o procedimento para o método de diferenciação in vitro e análise molecular de células diferenciadas usando RNA-seq. Também ilustra a caracterização do transcriptome das células no dia 0 de diferenciação (estágio de proliferação), dia 2, dia 4 e dia 7 (diferenciação precoce, média e tardia, respectivamente). É mostrado que que queratinócitos diferenciados exibem padrões de expressão genética que se assemelham em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Para examinar se esse método pode ser usado para estudar a patologia da pele, aplicamos o mesmo pipeline experimental e de análise para investigar queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 derivados de pacientes com displasia ectodérmica e fissura/fissura (CEE)síndrome 11,12. Este protocolo se concentra na diferenciação in vitro de queratinócitos, bem como na análise bioinformática subsequente do RNA-seq. Outras etapas do procedimento completo, como extração de RNA, preparação de amostras de RNA-seq e construção de biblioteca, são bem documentadas e podem ser facilmente seguidas, especialmente quando se usa muitos kits comerciais comumente usados. Portanto, essas etapas são descritas apenas brevemente no protocolo. Os dados mostram que este gasoduto é adequado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de hipófise bovina (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte do bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Sistema em tempo real</td> Máquina de <td>qPCR</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte do bulletKit</td></tr><tr><td>Etanolamina >= 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Chips de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte do bulletKit Insulina</td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte do bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA synthesis</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Kit de medição de baixa concentração</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit com RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>Kit RNAseq</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (modelo)</td> <td>Nanodrop e Qbit para medições de DNA e RNA</td></tr><tr><td>Códigos de barras NEXTflex DNA -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp longos primers</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do rna-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Os queratinócitos primários humanos são frequentemente usados como modelos in vitro para estudos sobre diferenciação epidérmica e doenças relacionadas. Métodos têm sido relatados para diferenciação in vitro de queratinócitos cultivados em modos submersos (2D) bidimensionais (2D) usando várias condições de indução. Descrito aqui é um procedimento para método de diferenciação de queratinócito in vitro 2D por inibição de contato e subsequente caracterização molecular por RNA-seq. Resumindo, os queratinócitos são cultivados em meio de queratinócito definido complementado com fatores de crescimento até que estejam totalmente confluentes. A diferenciação é induzida por contatos próximos entre os queratinócitos e estimulada pela exclusão dos fatores de crescimento no meio. Utilizando análises de RNA-seq, mostra-se que ambos os queratinócitos diferenciados exibem assinaturas moleculares distintas durante a diferenciação e 2) o padrão dinâmico de expressão genética se assemelha em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Quanto à comparação com a diferenciação normal de queratinócitos, os queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 apresentam morfologia alterada e assinaturas moleculares, consistentes com seus defeitos de diferenciação. Em conclusão, este protocolo detalha as etapas para a diferenciação de queratinócitos in vitro 2D e sua caracterização molecular, com ênfase na análise bioinformática dos dados RNA-seq. Como a extração de RNA e os procedimentos de RNA-seq foram bem documentados, não é o foco deste protocolo. O procedimento experimental de diferenciação de queratinócito in vitro e pipeline de análise bioinformática pode ser usado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

Diferenciação normal de queratinócitos e análise RNA-seq Neste experimento, foram utilizadas linhas de queratinócitos derivadas de cinco indivíduos para diferenciação e análises de RNA-seq. A Figura 1 resume o procedimento experimental de diferenciação e os resultados da análise do RNA-seq. Uma visão geral dos procedimentos de diferenciação in vitro de queratinócitos normais e mudanças de morfologia celular durante a diferenciação são ilustradas na Fi...

Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

Neste protocolo, descrevemos um procedimento contendo duas partes. Primeiro, um método de diferenciação de queratinócito 2D monocamado in vitro por inibição de contato. Em segundo lugar, sua caracterização molecular por RNA-seq.O método de diferenciação in vitro 2D é simples e fácil de executar. Pode ser usado para estudar a diferenciação epidérmica, especialmente quando um grande número de células são necessárias. Por exemplo, na análise epigenômica.O detalhado pipeline de análise RNA-seq é claro e transparente para pesquisadores com habilidades básicas de bioinformática, e pode ser usado para qualquer análise rna-seq em massa. Ao executar o protocolo de diferenciação pela primeira vez, tenha em mente que a densidade de semeadura pode ser complicada. Experimente várias densidades de semeadura para descobrir qual funciona melhor com sua linha celular.Comece por preparar meio de crescimento de queratinócitos ou KGM e 500 mililitros cada um de meio de proliferação e meio de diferenciação de acordo com as instruções do manuscrito. Os queratinócitos primários de sementes a uma densidade de 5 a 20.000 células por centímetro ao quadrado e adicionam meio de proliferação suficiente para cobrir as células. Dois dias após a semeadura, refresque as células com o meio de proliferação.Verifique as células regularmente sob o microscópio e atualize o meio a cada dois dias. Quando as células atingem 90% de confluência, induz a diferenciação alterando o meio para o meio de diferenciação. Para coletar células para novas análises de RNA, lave as células duas vezes com DPBS e, em seguida, adicione o tampão de lise.Recolher células nos dias de diferenciação zero, dois, quatro e sete. Após o isolamento do RNA, o CDNA de dupla-encalha será convertido e as bibliotecas RNA-seq estarão preparadas para o sequenciamento da próxima geração. Após o sequenciamento, as leituras da sequência serão baixadas e mapeadas para o genoma humano.Depois de baixar e instalar pacotes R, gere tabela de conta a partir do readspergene.out. tab files e escreva um arquivo de dados de amostra contendo todos os nomes de arquivos, o dia da diferenciação e outros dados de amostra relevantes. Consulte os arquivos de codificação suplementar para um exemplo.Em seguida, use a tabela de contagem e os dados da amostra para gerar um objeto deseq2 contendo os dados contáveis e amostrais. Para normalização da expressão genética, normalize a tabela de contagem no objeto deseq2 usando a normalização deseq2RLD ou VST. Embora a normalização do RLD seja preferida, a normalização do VST é muito mais rápida.Use a função dist em R para traçar a distância amostral com base nas intensidades de contagem de leitura normalizadas e, em seguida, realizar o agrupamento de hclust com base na distância da amostra. Em seguida, plote o mapa de calor usando a função pheatmap. Finalmente, gere uma análise de componentes principais ou gráfico PCA das intensidades de contagem de leitura normalizadas usando a função plotPCA do deseq2.O PCA atua como uma ferramenta na análise exploratória de dados e pode ser usado para visualizar distância e conexão entre diferentes amostras. Realize uma análise de expressão genética altamente variável com a função rowVars que extrai os 500 genes altamente variáveis, ordenando a variância entre amostras de diferentes pontos de tempo. Esses genes têm o maior desvio padrão de sua intensidade normalizada em dias de diferenciação.Realize agrupamento k-means nos genes altamente variáveis para agrupar-los por diferentes padrões de expressão. Visualize os genes em um mapa de calor com o pacote de featmap. A intensidade traçada no mapa de calor é a intensidade normalizada do deseq2 com o valor mediano subtraído.Gere uma lista de genes de fundo expressos que inclui todos os genes com mais de 10 contagens em uma única amostra e faça uma lista com genes de cada cluster. Finalmente, realize a análise de Ontologia genética usando GOrilla. Use a lista de genes de fundo como conjunto de fundo e a lista dos genes altamente variáveis em clusters como o conjunto de destino e clique nos termos GO enriquecidos da pesquisa.Alternativamente, usuários de R mais avançados podem usar o cluster de pacoteProfiler para automatizar a análise de enriquecimento de termos GO. Linhas de queratinócitos derivadas de cinco indivíduos foram utilizadas para diferenciação nas análises de RNA-seq. A análise dos componentes principais mostrou que os queratinócitos submetidos à diferenciação tinham perfis de expressão genética conectados, mas distintos.Genes altamente variáveis foram agrupados para visualizar dinâmicas e padrões de expressão genética durante a diferenciação. Cada conjunto de genes foi representado pelos genes de diferenciação de queratinócitos e a anotação da Ontologia genética mostrou uma clara diferença nas funções genéticas. No segundo experimento, as diferenças de morfologia celular e expressão genética foram comparadas entre queratinócitos de controles saudáveis e linhas celulares derivadas de pacientes portadores de mutações P63.A análise dos componentes principais mostrou que as linhas celulares de controle seguiram claramente um padrão de diferenciação, mas o padrão de expressão genética das células mutantes durante a diferenciação permanece em grande parte semelhante ao das células proliferadoras ou indiferenciadas. Na análise de agrupamento, os genes no cluster um foram regulados em células de controle e parcialmente regulados em células pacientes portadoras de mutações R204W e R279H, mas permaneceram altos em células portadoras de R304W. Esses genes provavelmente desempenham papéis na proliferação celular, como mostrado pela análise gene ontologia.Os genes do cluster dois foram introduzidos pela primeira vez e, posteriormente, regulados em células de controle. Esses genes provavelmente estão envolvidos na diferenciação de queratinócitos, pois as funções de diferenciação epidérmica e queratinização foram altamente enriquecidas para este aglomerado. Genes no aglomerado três foram induzidos apenas no final da diferenciação nas células de controle, o que indica que eles podem desempenhar um papel na camada mais externa da epiderme.Ao analisar os dados do RNA-seq, é importante saber de antemão o que esperar. Isso ajudará você tanto na interpretação do controle de qualidade quanto no enredo do PCA e na avaliação se seus resultados estão fazendo sentido. Nossos métodos podem ser usados para estudar a transcrição genética tanto na biologia epidérmica quanto em outros sistemas biológicos.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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