Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

Descrevemos um método eficiente de purificação e cultura de células de linhagem oligodendroglial. Isso permite abordar os mecanismos moleculares que controlam a diferenciação dos oligodenrócitos e suas interações com os neurônios durante o processo de mielinização. Esta técnica de agitação não é cara e é ideal para obter alta quantidade de oligodendrocitos.

Tais culturas permitem a produção de médias e co-culturas conditróprias de oligodendrocytes com neurônios. A esclerose múltipla é uma doença causada pela desmielinação focal no sistema nervoso central, secundária à perda de oligodendrócitos. A cultura dos oligodendrócitos fornece uma ferramenta para entender melhor como promover a remielinação.

Apenas a cultura celular oligodendroglial poderia fornecer insights sobre mecanismos intrínsecos que regulam desenvolvimentos e biologia de oligodendrocitos. Co-culturas com neurônios permitem obter uma visão de seus impactos na fisiologia neuronal. Para começar, use fórceps curvos para manter a cabeça do animal no nível dos olhos.

Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar o crânio seguindo a linha média cerebral. Use fórceps para retirar suavemente as duas partes do crânio da linha média. Use uma pequena colher cirúrgica para remover o cérebro da cavidade da cabeça.

Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo glicose pbs gelada no gelo. Visualizando sob um microscópio estéreo, use fórceps finos para remover o cerebelo, o tronco cerebral e as lâmpadas olfativas dos hemisférios cerebrais. Use fórceps finos para separar os dois hemisférios cerebrais.

Use fórceps finos para descascar as meninges. Coloque os cortices cerebrais em uma placa de Petri de 60 milímetros no gelo. Em uma capa de fluxo laminar, use um bisturi afiado para cortar finamente os cortices cerebrais.

Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mililitros contendo meio de digestão enzimática. Incubar por 30 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois disso, use uma pipeta para remover suavemente o meio de digestão da enzima, certificando-se de que o tecido cortical permaneça na parte inferior do tubo.

Use uma micropipette P1000 para adicionar um mililitro de soro de bezerro fetal DMEM 10% e triturar suavemente o tecido. Use um filtro de 70 mícrons e o pistão de uma seringa de um mililitro para filtrar o tecido cortical em um tubo de 50 mililitros. Enxágüe o tecido residual na parede interna do tubo do tubo de 50 mililitros várias vezes com soro de bezerro 10% fetal DMEM.

Encha o tubo de 50 mililitros com DMEM 10% de soro fetal da panturrilha. Centrifugar a 423 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota celular com dois mililitros de soro de bezerro 10% fetal DMEM.

Triturar suavemente a pelota celular com a micropipette P1000 e, em seguida, com a micropipette P200. Diluir a suspensão celular com o volume apropriado de soro de bezerro fetal DMEM 10%. Placa de cinco mililitros da suspensão celular em um frasco T-150 a uma densidade de uma vez 10 para as quintas células por centímetro quadrado.

Adicione 20 mililitros de DMEM quente 10% de soro fetal ao cada frasco T-150. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois de agitar a amostra durante a noite a 250 rpm e 37 graus Celsius, colher o supernatante no frasco contendo principalmente células de linhagem oligodendrocyte, mas também, algumas células microgliais, e emplaca-lo em pratos petri não revestidos de 100 milímetros.

Incubar as placas de Petri por 15 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Isso permite a remoção de células microgliais através da adesão diferencial rápida na superfície do prato. Enquanto isso, encha cada frasco T-150 com 25 mililitros de cultura quente e recém-preparada e incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob dióxido de carbono de 5% até o segundo tremor.

Em seguida, transfira o supernante das placas de Petri para novas placas de Petri não revestidas de 100 milímetros para permitir a adesão de células microgliais residuais. Incubar as placas de Petri por 15 minutos em uma incubadora umidificada a 37 Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Remova o supernatante de cada duas placas de Petri, que contêm células de linhagem oligodendrocyte não aderentes, e transfira-o para um tubo de 50 mililitros.

Descarte as placas de Petri banhadas com microglia. Centrifugar os tubos por cinco minutos a 423 vezes g. Remova cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota celular com um mililitro do meio Bottenstein-Sato.

Acumule todas as pelotas em um tubo comum de 50 mililitros e ajuste o volume para 20 ou 30 mililitros, dependendo da densidade celular com o meio Bottenstein-Sato. Placa dois ou três pratos petri pré-revestidos com 10 milimetros com 10 mililitros da suspensão da célula. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono.

Duas horas depois, limpe os destroços das placas de Petri refrescando todo o meio Bottenstein-Sato. Incubar por dois dias no meio em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois de dois dias, examine a cultura sob um microscópio.

Em uma coifa de fluxo laminar, em condições estéreis, renove o meio de cultura com 10 mililitros de médio médio aquecido MPB-27. Incubar por dois dias em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Para colher o OCM, colete o supernatante contendo fatores secretados de oligodendrócitos.

O filtro esteriliza o OCM usando um filtro de 0,22 mícron. Neste protocolo, as células de linhagem oligodendrocyte foram purificadas a partir de culturas gliais, sacudindo osstrócitos e microglia. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas oligodendrocytes eram principalmente pré-oligodendrocitos com 90 mais ou menos 4% das células positivas O4, 85 mais ou menos 7%NG2 células positivas, e 4,7 mais ou menos 2,1% das células positivas PLP, enquanto 7,2 mais ou menos 2,5% das células eram astrócitos positivos GFAP.

OCM produzido a partir de tais culturas foram adicionados em três dias in vitro para culturas purificadas de neurônios hipocampais. Este tratamento promove o agrupamento de proteínas notais. A mielinação dos neurônios hipocampais foi estudada através da adição de oligodendroctyes aos 14 dias in vitro.

De 20 a 24 dias in vitro, a coloração imuno de marcadores de mielina, como a proteína básica da mielina, permitiu a visualização dos segmentos de mielina e nódulos de Ranvier. O núcleo pbs é importante para a remoção de meninges. A limpeza rápida é fundamental para a viabilidade dos oligodendroctyes e a realização dos pontos fortes do fluxo aplicado com a pipeta.

O meio-condicionado ao oligodendrocyte pode ser adicionado às culturas neuronais para obter uma visão sobre o impacto dos fatores secretados dos oligodendroctyes na fisiologia neuronal. Co-culturas de oligodendroctyes com neurônios também podem ser realizadas para estudar o processo de mielinação.