Name: Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a purificar oligodendrócitos e produzir meio condicionado para estudos de mielina e interações neuronais. Esta técnica eficiente de cultura celular auxilia pesquisas em neurociência e esclerose múltipla.

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Os autores gostariam de agradecer a Rémi Ronzano por seu sábio conselho na edição de manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo ICM, INSERM, bolsa de fundação ARSEP à NSF e preço bouvet-labruyère.

O cuidado e o uso de ratos neste experimento estão em conformidade com políticas e diretrizes institucionais (UPMC, INSERM e Diretiva do Conselho Comunitário Europeu 86/609/CEE). O seguinte protocolo é estabelecido para uma ninhada padrão de 12 filhotes.
1. Preparação dos frascos (~5 min)
NOTA: Realize as seguintes etapas no dia anterior à dissecção em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>Cubra os frascos de 150 cm2 (T150) com tampa de filtro (1 frasco para 2 filhotes) utilizando 5 mL de polietileimina (PEI, 100 mg/L, consulte protocolo no Arquivo Complementar 1).</li>
	<li>Armazene os frascos a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Frascos revestidos de enxágue 3 vezes com água destilada estéril no dia da dissecção.</li>
</ol>2. Preparação da mídia (~10 min)
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>Prepare 500 mL de meio cultural, composto pelo meio de Águia modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% do soro fetal de bezerro (FCS) e penicilina-estreptomicina (100 UI/mL).</li>
	<li>Prepare 20,6 mL do meio de digestão enzimática em um tubo de 50 mL, composto por 20 mL de DMEM, 200 μL de DNase (50 μg/mL), 200 μL de mamão (30 U/mL) e 200 μL de L-cysteine (0,24 mg/mL).</li>
	<li>Filtrar-esterilizar a mídia usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Mantenha a mídia no capô de fluxo laminar à temperatura ambiente (RT) até dissecção.</li>
</ol>3. Preparação para dissecção (~10 min)
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>Prepare 100 mL de sálina tampão de fosfato sem cálcio e magnésio (PBS; 1x). Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Prepare 50 mL de solução PBS gelada 1x complementada com 750 μL de 45% de glicose. Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Encha uma placa de petri de 100 mm com 1x PBS para instrumentos de limpeza e três pratos petri de 60 mm com pbs-glicose gelada para colheita de tecidos. Coloque as placas de petri no gelo até dissecar.</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: A dissecação é realizada entre filhotes de rato Wistar masculino e feminino no dia pós-natal (P) 2.
<ol><li>Para proporcionar um ambiente estéril, certifique-se de limpar o banco com 100% de etanol. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas com 100% de etanol.</li>
	<li>Pulverizar suavemente o pescoço do filhote com 70% de etanol.</li>
	<li>Use uma tesoura cirúrgica grande para decapitar o animal e colocar a cabeça em uma placa de Petri de 100 mm contendo pbs-glicose gelada.</li>
	<li>Use fórceps curvos para manter a cabeça do animal no nível dos olhos. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão na base do crânio e corte o crânio seguindo a linha média cerebral.</li>
	<li>Use fórceps para retirar suavemente as duas partes do crânio da linha média.</li>
	<li>Use uma pequena colher cirúrgica para remover o cérebro da cavidade da cabeça. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 60 mm contendo pbs-glicose gelada no gelo.</li>
	<li>Visualizando um steromicroscópio, use fórceps finos para remover o cerebelo, o tronco cerebral e lâmpadas olfativas dos hemisférios cerebrais.</li>
	<li>Use fórceps finos para separar os dois hemisférios cerebrais. Use fórceps finos para descascar as meninges. Coloque os cortices cerebrais em uma placa de petri de 60 mm no gelo. NOTA: O PBS gelado é fundamental para a remoção correta de meninges.</li>
</ol>5. Dissociação tecidual
NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>Use um bisturi afiado para cortar finamente os cortices cerebrais. Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo meio de digestão enzimática.</li>
	<li>Incubar por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Use uma micropipeta p1000 para remover suavemente o meio de digestão da enzima, certificando-se de que o tecido cortical permanece na parte inferior do tubo de 50 mL.</li>
	<li>Use uma micropipette p1000 para adicionar 1 mL de DMEM-10% FCS e triturar suavemente o tecido.</li>
	<li>Use um filtro de 70 μm e um pistão de uma seringa de 1 mL para filtrar o tecido cortical em um tubo de 50 mL. NOTA: Pode-se enxaguar tecido residual na parede interna do tubo várias vezes com DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Encha o tubo de 50 mL com DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente a supernatant e resuspenda a pelota celular com 2 mL de DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Triturar suavemente a pelota celular com uma micropipeta p1000 e, em seguida, com uma micropipeta p200. Diluir a suspensão celular com o volume apropriado de DMEM-10%FCS. NOTA: Dois cérebros = um T150 = 5 mL de DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Placa 5 mL da suspensão celular em um T150 a uma densidade de 1 x 105 células/cm2. Adicione 20 mL de DMEM-10%FCS quente a cada T150. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Renovar metade do meio cultural após 6 dias in vitro (DIV) com DMEM-10%FCS quente.</li>
</ol>6. Preparação de agitação
<ol><li>Realize a preparação agitada no dia anterior ao tremor em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.</li>
	<li>Renovar metade do meio cultural adicionando meio de cultura quente fresca ao frasco e incubaa a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
</ol>7. Tremendo
<ol><li>Cubra três pratos petri de 100 mm com PEI. Guarde-os a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Cubra o boné com filme de parafina e coloque os frascos em um saco plástico. Frascos de shake contendo células gliais durante a noite a 250 rpm a 37 °C. NOTA: Primeiro tremor é realizado em 8 DIV e pode-se realizar até três tremores diferentes (ver Figura 1 para cronometragem).</li>
</ol>8. Colagem de células de linhagem e cultura
NOTA: Essas etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>No dia seguinte ao tremor, prepare o meio Bottenstein-Sato (BS) de acordo com a Tabela 1.</li>
	<li>Enxágüe pratos de Petri revestidos 3 vezes com água destilada estéril.</li>
	<li>O supernatante de frascos de colheita contendo principalmente células de linhaGem OL, mas também algumas células microgliais e emplaca-o em pratos petri não revestidos de 100 mm. NOTA: Esta etapa permite a remoção de células microgliais através de adesão rápida diferencial na superfície do prato.</li>
	<li>Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Encha cada frasco T150 com 25 mL de meio de cultura quente e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2 até o segundo tremor.</li>
	<li>Transfira o supernatante das placas de Petri para novas placas de Petri não revestidas de 100 mm para permitir a adesão de células microgliais residuais.</li>
	<li>Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Remova o supernatant, que contém células de linha OL não aderentes, e transfira-o para tubos de 50 mL (supernatante de 2 pratos petri para um tubo de 50 mL). Descarte pratos petri banhados com microglia.</li>
	<li>Centrífuga o supernatante por 5 min a 423 x g. Remova cuidadosamente a pelota de célula e resuspenda a pelota celular com 1 mL de meio BS. Pool todas as pelotas em um tubo comum de 50 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio BS.</li>
	<li>Determine a densidade celular contando células um microscópio. NOTA: Deve ser obtida uma densidade celular entre 3 x 105/mL e 5 x 105/mL.</li>
	<li>Adicione 20 mL de BS se a densidade celular for maior ou igual a 4 x 105/mL para obter um volume final de 30 mL, ou adicionar apenas 10 mL de BS se a densidade celular for inferior a 4 x 105/mL para obter um volume final de 20 mL.</li>
	<li>Placa de dois ou três pratos de petri pré-revestidos de 100 mm com 10 mL de suspensão celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Limpe os detritos das placas de Petri refrescando todo o meio BS 2 h depois. NOTA: Examine a cultura o microscópio antes e depois da limpeza para verificar a densidade celular e a eficiência da remoção dos detritos.</li>
	<li>Incubar por 2 dias em meio BS em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2. NOTA: Examine a cultura o microscópio. A confluência deve ser de 70% a 80%.</li>
</ol>9. Produção de OCM
NOTA: Realize estas etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
<ol><li>Prepare nb-B27low médio de acordo com a Tabela 2.</li>
	<li>Renovar o meio cultural com 10 mL de meio NB-B27low quente. Incubar por 2 dias em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Colher o OCM, ou seja, supernatante contendo fatores secretos oL. Filtrar o CM-esterilizador usando um filtro de 0,22 μm. NOTA: Armazene OCM a 4 °C por máxima de 2 meses.</li>
</ol>10. Adição de OCM
NOTA: As etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. O CM pode ser adicionado às culturas de neurôniohipocampais purificadas preparadas de acordo com o seguinte protocolo14, e obtidas adicionando, 24 h após o isolamento, os agentes anti-mitocóticos uridine e 5-fluorodeoxyuridina (5 μM) por 36 h.
<ol><li>A 3 DIV, remova todo o meio de cultura do neurônio contendo agentes antimitóticos e adicione 500 μL de OCM fresco quente.</li>
	<li>Renovar metade do meio a cada 3 dias com RN-B27 recém-feito quente. NOTA: Tais culturas podem ser mantidas até 21 DIV.</li>
</ol>11. Adição de OL à cultura purificada do neurônio hipocampal
NOTA: Realize as seguintes etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. OLs podem ser adicionados às culturas hipocampais purificadas obtidas da mesma forma descrita acima.
<ol><li>Prepare o meio de cocultura de acordo com a Tabela 3.</li>
	<li>Recupere a cultura OL em 70% a 80% de confluência. Enxágüe com 2 mL de PBS quente 1x.</li>
	<li>Para separar as células, adicione 2 mL de 0,25% de trypsin a uma placa de Petri de 100 mm.</li>
	<li>Incubar por 5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Adicione 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear a reação enzimática. Colher o supernatante contendo células de linhagem OL.</li>
	<li>Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota celular em meio de cocultura quente para obter uma concentração de 1,25 x 105 células/mL.</li>
	<li>Adicione OL à cultura purificada dos neurônios hipocampais removendo 200 μL do meio de cultura do neurônio e adicionando 200 μL de suspensão celular por poço (2,5 x 104 células/poço) de uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Refrescar metade do meio de cocultura a cada 2-3 dias. NOTA: As coculturas podem ser mantidas até 24 DIV.</li>
</ol>

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</ol>

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou interesses conflitantes.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para obter culturas de linhagem oligodendroglial altamente enriquecidas a partir de culturas gliais mistas, adaptadas de um método16publicado anteriormente , e a produção subsequente de meio sedél condicionado. Esta técnica de agitação não é cara, pode ser repetida três vezes e é ideal para obter alta quantidade de OLs purificados, como células cultivadas em bottenstein-Sato (BS) meio contendo PDGFα proliferam. As células gliais são preparadas usando cortice...

Oligodendrocytes (OLs) são células gliais do sistema nervoso central (CNS) que geram embalagem de mielina em torno de axônios. Os OLs são originários de células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) que proliferam dentro das zonas ventriculares do CNS embrionário e depois migram e se diferenciam em OLs totalmente maduros (ou seja, células formadoras de mielina)1. Os OPCs são abundantes durante o desenvolvimento precoce, mas também persistem no cérebro adulto, onde representam a maior população de células proliferativas2. Um único OL enshea vários axônios em seções não excitáveis (ou seja, internodes), e a borda de cada alça de mielina se conecta ao axônio formando o domínio paranodal que é crucial para as propriedades isolantes da mielina1,3. Entre os desfiles estão pequenas lacunas immielinizadas chamadas os nós de Ranvier. Esses nós são ricos em canais de sódio fechados por tensão (Nav), permitindo a regeneração e rápida propagação de potenciais de ação através da condução saltatória4. Essa interação apertada também permite o suporte à energia axonal através da captação neuronal de lactato de OLs5,6.
O amadurecimento das células de linhagem oligodendroglial e o processo de mielinação são fortemente regulados por suas interações com neurônios7. De fato, OLs e OPCs, também chamados de células NG2, expressam uma série de receptores para neurotransmissores, e podem receber entrada de neurônios excitatórios e inibitórios, permitindo que eles detectem atividade neuronal que pode desencadear sua proliferação e/ou diferenciação em células mielinantes2. Por sua vez, opcs/OLs secretam microvesicles e proteínas no espaço extracelular que sozinho ou sinergicamente mediam funções neuromodulativas e neuroprotetoras8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam os múltiplos modos de interações entre células de linhagem oligodendroglial e neurônios ainda não foram totalmente decifrados.
Além disso, em várias condições patológicas do CNS, os OLs são afetados principalmente, perturbando assim sua interação com os neurônios. Por exemplo, na Esclerose Múltipla (EM), a disfunção neurológica é causada pela desmistelinação focal no CNS, secundária à perda de OLs que pode levar a danos axonais e acúmulo de incapacidade relacionada. A remielinização pode ocorrer, embora insuficientemente na maioria dos casos13. O progresso na última década, devido ao desenvolvimento de imunoterapias, reduziram a taxa de recaída, mas promover a remielinização permanece até o momento uma necessidade não atendida. Como tal, uma melhor compreensão do papel, funções e influências das OLs é de particular interesse para o desenvolvimento de novas terapias para um amplo espectro de condições de CNS.
Aqui, descrevemos os métodos de purificação e cultura das OLs. Isso permite o exame preciso de mecanismos intrínsecos que regulam seu desenvolvimento e biologia. Além disso, tais culturas altamente enriquecidas de OLs permitem a produção de meio com condições de oligodendrocito (OCM), que pode ser adicionado às culturas de neurônios purificados para obter uma visão do impacto de fatores secretos do OLs na fisiologia neuronal e conectividade. Além disso, descrevemos como implementar um sistema de co-cultura in vitro onde oligodendrocitos purificados e neurônios são combinados, permitindo abordar os mecanismos que regulam (re)mielinação.

<table><tbody><tr><td>5-fluorodesoxiuridina</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>solução de D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Desoxirribonuclease I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>VWR Produtos Químicos</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal de Bezerro</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino sem cálcio e magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenonimina (PEI)</td> <td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato decahidratado</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin humano</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumina de Soro Bovino)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3 ', 5-Triiodo-L-tilonina sal de sódio)</td> <td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-tiroxina)</td> <td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > meios de co-cultura< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>apo-transferrina suplemento humano</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina de soro bovino)</td> <td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmina</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td></td><td>Sigma P5780</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante CNTF</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-tireonina sal de sódio)</td> <td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td><forte>Ferramentas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Filtro M</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>1611127 Placa de</td><td></td></tr><tr><td>Petri de 100 mm</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & Micro; filtro m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps curvo</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinças finas</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras cirúrgicas grandes</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Colher cirúrgica pequena</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm<>2 frasco com tampa de filtro</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar rato</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de oligodendrocytes e oligodendrocyte-conditioned medium para experimentos de cocultura

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

No sistema nervoso central, os oligodendrocytes são bem conhecidos por seu papel na mielinação de axon, que acelera a propagação de potenciais de ação através da condução saltatória. Além disso, um número crescente de relatórios sugere que os oligodendrocitos interagem com neurônios além da mielinização, notadamente através da secreção de fatores solúveis. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a purificação de células de linhagem oligodendroglial de culturas células gliais também contendo astrócitos e células microgliais. O método conta com tremores noturnos a 37 °C, o que permite o desprendimento seletivo das células oligodendrólais e células microgliais, e a eliminação da microglia por adesão diferencial. Descrevemos então a cultura dos oligodendrocytes e a produção de meio climatizado pelo oligodendrocyte (OCM). Também fornecemos as cinéticas do tratamento oCM ou oligodendrocytes, além de neurônios hipocampais purificados em experimentos de cocultura, estudando interações oligodendrocyte-neurônio.

Neste protocolo, as células de linhagem OL são purificadas das culturas gliais, sacudindo astrócitos e microglia. Pureza e exame adesivo das culturas OL podem ser avaliados por imunomanchas com marcadores gliais15. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas ol eram principalmente pré-OLs com 90% ± 4% das células O4+, 85% ± 7% NG2+ células, e 4,7% ± 2,1% das células PLP+, enquanto 7,2% ± 2,5% das células ...

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Descrevemos um método eficiente de purificação e cultura de células de linhagem oligodendroglial. Isso permite abordar os mecanismos moleculares que controlam a diferenciação dos oligodenrócitos e suas interações com os neurônios durante o processo de mielinização. Esta técnica de agitação não é cara e é ideal para obter alta quantidade de oligodendrocitos.Tais culturas permitem a produção de médias e co-culturas conditróprias de oligodendrocytes com neurônios. A esclerose múltipla é uma doença causada pela desmielinação focal no sistema nervoso central, secundária à perda de oligodendrócitos. A cultura dos oligodendrócitos fornece uma ferramenta para entender melhor como promover a remielinação.Apenas a cultura celular oligodendroglial poderia fornecer insights sobre mecanismos intrínsecos que regulam desenvolvimentos e biologia de oligodendrocitos. Co-culturas com neurônios permitem obter uma visão de seus impactos na fisiologia neuronal. Para começar, use fórceps curvos para manter a cabeça do animal no nível dos olhos.Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar o crânio seguindo a linha média cerebral. Use fórceps para retirar suavemente as duas partes do crânio da linha média. Use uma pequena colher cirúrgica para remover o cérebro da cavidade da cabeça.Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo glicose pbs gelada no gelo. Visualizando sob um microscópio estéreo, use fórceps finos para remover o cerebelo, o tronco cerebral e as lâmpadas olfativas dos hemisférios cerebrais. Use fórceps finos para separar os dois hemisférios cerebrais.Use fórceps finos para descascar as meninges. Coloque os cortices cerebrais em uma placa de Petri de 60 milímetros no gelo. Em uma capa de fluxo laminar, use um bisturi afiado para cortar finamente os cortices cerebrais.Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mililitros contendo meio de digestão enzimática. Incubar por 30 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois disso, use uma pipeta para remover suavemente o meio de digestão da enzima, certificando-se de que o tecido cortical permaneça na parte inferior do tubo.Use uma micropipette P1000 para adicionar um mililitro de soro de bezerro fetal DMEM 10% e triturar suavemente o tecido. Use um filtro de 70 mícrons e o pistão de uma seringa de um mililitro para filtrar o tecido cortical em um tubo de 50 mililitros. Enxágüe o tecido residual na parede interna do tubo do tubo de 50 mililitros várias vezes com soro de bezerro 10% fetal DMEM.Encha o tubo de 50 mililitros com DMEM 10% de soro fetal da panturrilha. Centrifugar a 423 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota celular com dois mililitros de soro de bezerro 10% fetal DMEM.Triturar suavemente a pelota celular com a micropipette P1000 e, em seguida, com a micropipette P200. Diluir a suspensão celular com o volume apropriado de soro de bezerro fetal DMEM 10%. Placa de cinco mililitros da suspensão celular em um frasco T-150 a uma densidade de uma vez 10 para as quintas células por centímetro quadrado.Adicione 20 mililitros de DMEM quente 10% de soro fetal ao cada frasco T-150. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois de agitar a amostra durante a noite a 250 rpm e 37 graus Celsius, colher o supernatante no frasco contendo principalmente células de linhagem oligodendrocyte, mas também, algumas células microgliais, e emplaca-lo em pratos petri não revestidos de 100 milímetros.Incubar as placas de Petri por 15 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Isso permite a remoção de células microgliais através da adesão diferencial rápida na superfície do prato. Enquanto isso, encha cada frasco T-150 com 25 mililitros de cultura quente e recém-preparada e incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius sob dióxido de carbono de 5% até o segundo tremor.Em seguida, transfira o supernante das placas de Petri para novas placas de Petri não revestidas de 100 milímetros para permitir a adesão de células microgliais residuais. Incubar as placas de Petri por 15 minutos em uma incubadora umidificada a 37 Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Remova o supernatante de cada duas placas de Petri, que contêm células de linhagem oligodendrocyte não aderentes, e transfira-o para um tubo de 50 mililitros.Descarte as placas de Petri banhadas com microglia. Centrifugar os tubos por cinco minutos a 423 vezes g. Remova cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota celular com um mililitro do meio Bottenstein-Sato.Acumule todas as pelotas em um tubo comum de 50 mililitros e ajuste o volume para 20 ou 30 mililitros, dependendo da densidade celular com o meio Bottenstein-Sato. Placa dois ou três pratos petri pré-revestidos com 10 milimetros com 10 mililitros da suspensão da célula. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono.Duas horas depois, limpe os destroços das placas de Petri refrescando todo o meio Bottenstein-Sato. Incubar por dois dias no meio em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Depois de dois dias, examine a cultura sob um microscópio.Em uma coifa de fluxo laminar, em condições estéreis, renove o meio de cultura com 10 mililitros de médio médio aquecido MPB-27. Incubar por dois dias em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Para colher o OCM, colete o supernatante contendo fatores secretados de oligodendrócitos.O filtro esteriliza o OCM usando um filtro de 0,22 mícron. Neste protocolo, as células de linhagem oligodendrocyte foram purificadas a partir de culturas gliais, sacudindo osstrócitos e microglia. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas oligodendrocytes eram principalmente pré-oligodendrocitos com 90 mais ou menos 4% das células positivas O4, 85 mais ou menos 7%NG2 células positivas, e 4,7 mais ou menos 2,1% das células positivas PLP, enquanto 7,2 mais ou menos 2,5% das células eram astrócitos positivos GFAP.OCM produzido a partir de tais culturas foram adicionados em três dias in vitro para culturas purificadas de neurônios hipocampais. Este tratamento promove o agrupamento de proteínas notais. A mielinação dos neurônios hipocampais foi estudada através da adição de oligodendroctyes aos 14 dias in vitro.De 20 a 24 dias in vitro, a coloração imuno de marcadores de mielina, como a proteína básica da mielina, permitiu a visualização dos segmentos de mielina e nódulos de Ranvier. O núcleo pbs é importante para a remoção de meninges. A limpeza rápida é fundamental para a viabilidade dos oligodendroctyes e a realização dos pontos fortes do fluxo aplicado com a pipeta.O meio-condicionado ao oligodendrocyte pode ser adicionado às culturas neuronais para obter uma visão sobre o impacto dos fatores secretados dos oligodendroctyes na fisiologia neuronal. Co-culturas de oligodendroctyes com neurônios também podem ser realizadas para estudar o processo de mielinação.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais...

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

O vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em oligodendrócitos e induzir mielinização em uma co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). As OPCs são transduzidas com vetores lentivirais que codificam uma proteína sinalizadora que regula a mielinização. Os OPCs transduzidos são co-cultivados com neurônios DRG para avaliar a diferenciação em oligodendrócitos e a mielinização induzida por proteína de sinalização.

Um ensaio de mielinização induzida por transdução in vitro para células precursoras de oligodendrócitos

Este vídeo demonstra a produção de meio condicionado por oligodendrócitos (OCM) a partir de células de linhagem de oligodendrócitos, enfatizando-as para aumentar sua liberação molecular no meio. Este meio, que é rico em fatores de crescimento, citocinas e outras moléculas bioativas, pode ser adicionado a culturas de neurônios para obter informações sobre o impacto dos fatores secretados por oligodendrócitos na fisiologia e conectividade neuronal.

Um método para gerar meio condicionado por oligodendrócitos

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) do córtex cerebral de filhotes de camundongos.

Isolando e cultivando células precursoras de oligodendrócitos do córtex cerebral de filhotes de camundongos

As células globóides são uma característica patológica definidora da doença de Krabbe, uma leucodistrofia que atualmente carece de uma terapia eficaz a longo prazo. Desenvolvemos um modelo de cultura de células para estudar a biologia inata e o potencial patogênico da microglia ativada e sua transformação em células globóides.

Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

As interações neurônio-glial na neurodegeneração não são bem compreendidas devido a ferramentas e métodos inadequados. Aqui, descrevemos protocolos otimizados para obter neurônios induzidos, células precursoras de oligodendrócitos e oligodendrócitos de células-tronco pluripotentes humanas e fornecemos exemplos dos valores desses métodos na compreensão das contribuições específicas do tipo celular na doença de Alzheimer.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

Aprenda a purificar oligodendrócitos e produzir meio condicionado para estudos de mielina e interações neuronais. Esta técnica eficiente de cultura celular auxilia pesquisas em neurociência e esclerose múltipla.

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

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