Name: Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a isolar células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em tecido linfoide mucosal humano. Este método preserva a integridade celular para pesquisas em imunologia.

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Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups "Baustein" da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).

Os espécimes não são coletados especificamente para fins de pesquisa e o estudo não é considerado invasivo. No entanto, a coleta de amígdalas humanas requer aprovação ética das autoridades locais relevantes. No nosso caso, foi aprovado pelo Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Além disso, solicita-se o consentimento de cada paciente ou representante legal para obter dados pessoais dos doadores (por exemplo, sexo, idade, histórico de infecções por ENT) que possam ajudar a interpretar resultados experimentais.
1. Manuseio do tecido tonsilar humano
<ol><li>Coloque amígdalas de cada doador em um frasco estéril de 50 mL contendo 25 mL PBS 1x e transporte à temperatura ambiente (RT) para o laboratório de acordo com as recomendações da autoridade (use três níveis de proteção: frascos, uma caixa de segurança e um saco). NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado em laboratório de segurança biológica nível 2. Todos os espécimes humanos devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos.</li>
	<li>
Limpe todas as ferramentas entre cada uso.
	<ol>
<li>Após o uso, desmonte o coador celular e mantenha com todos os outros instrumentos (por exemplo, pilão, fórceps) em um banho contendo uma solução de detergente (1/10 detergente de volume em H2O) durante a noite.</li>
		<li>Escove cada utensílio para remover o tecido e lave com água limpa.</li>
		<li>Seque bem todas as peças, depois prepare o coador de células (85 mL, 37 mm de diâmetro) colocando uma grade de aço de 60 malha em cima de uma grade de aço de 10 malha e feche firmemente o anel.</li>
		<li>Coloque todas as ferramentas em sacos estéreis e autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissecção do Tecido Tonsilár humano e Isolamento das Células Mononucleares Tonsilares (TMCs)
<ol><li>Coloque o coador de células em um prato de cultura celular de 150 x25 mm 2 (SPL150) e todos os instrumentos em outro SPL150 para mantê-los estéreis.</li>
	<li>Transfira as amígdalas do frasco para o coador celular usando fórceps estéreis. Despeje também toda a PBS, que contém algumas células que egressaram as amígdalas. Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade. NOTA: O tecido deve ser imerso o tempo todo para evitar a proficação.</li>
	<li>Remova tecido cauterizado, ensanguentado e miomado usando fórceps e um bisturi. NOTA: Amígdalas retiradas de crianças não precisam dessa etapa.</li>
	<li>Corte os tecidos em pequenos pedaços de menos de 0,5 cm de diâmetro usando o bisturi e a pinça curva. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.</li>
	<li>Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular e raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.</li>
	<li>Uma vez que todos os tecidos tenham sido espremidos através da grade, use uma pipeta de 10 mL para transferir toda a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular com uma pipeta de 10 mL para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS 1x. Deixe a suspensão da cela descansar por 5 minutos no RT no banco. Esta etapa permite a precipitação e aglomeração do estroma restante, células mortas e qualquer DNA liberado, e facilitará o próximo passo.</li>
	<li>Coloque uma peneira estéril de 70 μm em cima de um novo frasco de 50 mL (retire cuidadosamente do envelope) e transfira suavemente a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Não misture a suspensão, pois uma pelota está frequentemente presente. Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta estéril de 1 mL para arranhar as células da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário.</li>
	<li>Centrifugar as células a 250 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o supernaspe e resuspenque a pelota misturando suavemente o frasco, em seguida, resuspend as células em 35 mL de PBS.</li>
	<li>Em um novo frasco, coloque uma nova peneira de 70 μm por cima e transfira a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Se a peneira estiver entupida, utilize a técnica detalhada na etapa 2.7.</li>
</ol>3. Isolamento dos TMCs por Gradiente de Densidade Celular
NOTA: Os TMCs podem ser usados após a etapa 2.10. No entanto, para obter uma solução celular mais clara e remover outros detritos celulares e quaisquer células vermelhas, é aconselhável realizar um isolamento gradiente de densidade celular das células mononucleares.
<ol><li>Adicione 15 mL do meio gradiente de densidade (d = 1,076 g/mL) em um novo frasco de 50 mL. Despeje a solução TMCs em cima do meio gradiente de densidade, tendo o cuidado de minimizar a mistura da suspensão com o meio gradiente de densidade.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 1.000 x g por 30 min no RT com aceleração e quebra.</li>
	<li>Remova com uma pipeta de 10 mL e descarte a camada superior (contendo principalmente PBS 1x) sem perturbar a interface entre os TMCs e o meio de gradiente de densidade. NOTA: Os TMCs contêm um baixo número de eritrócitos, portanto a solução é clara. Assim, a interface entre a solução de TMCs em PBS e o meio gradiente de densidade pode ser difícil de visualizar. Assim, as células podem ser resuspended em RPMI 1640 suplementado com 20 mM HEPES (sem FBS) antes que o gradiente de densidade seja realizado.</li>
	<li>Remova os TMCs com uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e coloque em um novo frasco de 50 mL.</li>
	<li>Lave as células adicionando 50 mL de PBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 2 mM EDTA e centrífugas do tubo a 250 x g por 10 min a 4 °C para remover as plaquetas restantes.</li>
	<li>Repita o passo 3.5, mas centrífugue o tubo a 400 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Prepare o meio cultura (R10) suplementando rpmi 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 mM L-glutamina e a solução antibiótica (penicillium de 100 U/mL e 100 μg/mL estreptomicina).</li>
	<li>Resuspenque os TMCs em 10 mL de R10 e conte as células. Em média, esta técnica rende 5 x 108-2 x 109 TMCs por par de amígdalas. As células agora podem ser usadas para investigações como PBMCs de sangue inteiro (por exemplo, purificação de tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo, RT-qPCR, congelamento, etc.).</li>
	<li>
Se necessário, congele as células para uso adicional usando técnicas padrão para congelamento celular primário.
	<ol>
<li>Conte o número de células.</li>
		<li>Centrifugar as células e remover o supernante. Dissolva a pelota em 100% FBS suficientes para uma concentração final de 1 x 108 células/mL, em seguida, adicione o mesmo volume de uma solução de 80% FBS + 20% DMSO. As células estarão em 57 x 107 células/mL. Esta etapa deve ser feita a 4 °C e a solução FBS e DMSO deve ser mantida a 4 °C antes de usar.</li>
		<li>Distribua 1 mL da solução celular em criotubos e coloque-os em um recipiente de congelamento lento que esteve a 4 °C durante a noite para controlar a taxa de congelamento celular. Coloque-o a -80 °C.</li>
		<li>Para descongelar as células, coloque os criovias em um banho quente a 37 °C por alguns segundos com agitação constante. Assim que as células começarem a descongelar, transfira-as para 49 mL de R10 e centrífuga para remover o DMSO. Conte as células e use-as como PBMCs. NOTA: Embora o congelamento e o descongelamento dos TMCs removam os detritos, também danificará alguns tipos de células raras. Se aglomerados ou detritos estiverem presentes após o descongelamento, é melhor passar a suspensão da célula através de uma peneira estéril de 70 μm antes de usá-la.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fenotipagem de TMCs por Citometria de Fluxo
<ol><li>Recupere 5 x 106 células da solução anterior para cada painel de mistura de anticorpos que precisa ser testado e coloque em um tubo de citometria de 5 mL. Recupere 1 x 106 células para o controle não manchado.</li>
	<li>Lave as células em PBS e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspensá-los em 500 μL de PBS (1 x 106 células/mL) e incubar com uma mancha de viabilidade por 30 min a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Adicione 5 μL de calor humano inativado ab soro por 100 μL de suspensão celular e incubar por 15 min a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Lave as células em PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenque os TMCs em 500 μL de Wash Buffer contendo os anticorpos conforme detalhado na Tabela 1. Incubar as células por 30 min a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Lave as células em Wash Buffer e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspentive os TMCs em 500 μL de PBS contendo 0,5% de paraformaldeído (PFA). Mantenha-se no escuro a 4 °C até a aquisição por citometria de fluxo. NOTA: PfA é perigoso. Use uma solução comercial pronta para uso para preparar a solução PFA de 0,5%.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorpo</td>
			<td>Clone</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Empresa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Live-Dead</td>
			<td></td>
			<td>BV405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>SP34-2</td>
			<td>V500</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Amcyan</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BW135/80</td>
			<td>VioBlue</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>HI30</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td>
			<td>Bd</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>HD237</td>
			<td>Ecd</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD20</td>
			<td>2H7</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>PE-cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Apc</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16</td>
			<td>3G8</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>MEM188</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD123</td>
			<td>7G3</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-1</td>
			<td>L161</td>
			<td>Azul do Pacífico</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-3</td>
			<td>AD5-14H12</td>
			<td>FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-4</td>
			<td>AD5-17F6</td>
			<td>Apc</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>G646-6</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11c</td>
			<td>3.9</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>ebiociências</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista de anticorpos para caracterização celular por citometria de fluxo.
5. Exemplo de Ativação de TMCs e Medição da Produção de Citocinas
<ol><li>Diluir os TMCs em meio R10 para obter uma concentração de 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Distribua 400.000 TMCs em 200 μL de R10 em uma placa inferior bem redonda de 96.</li>
	<li>Para ativar as células, adicione 5 μg/mL do resiquimod agonista TLR7/8 (R848) durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar as placas e recuperar o supernatante dos TMCs e congelá-lo para análise suplementar. A produção de citocinas será avaliada usando imunoensatórios à base de contas para quantificar várias citocinas solúveis simultaneamente usando um citômetro de fluxo seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Avalie a viabilidade das células usando um ensaio de viabilidade celular luminescente seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, adicione 60 μL de solução de viabilidade celular aos poços e meça luminescência dentro de 10 min (aquisição para 1 s/well).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são iniciadas em tecidos (...

Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa4,,5,6. De fato, um pedaço de tecido ou órgão é altamente heterogênios porque sua composição celular difere dependendo da localização no tecido. Assim, o uso de blocos teciduais requer a análise de muitas réplicas técnicas e biológicas, levando à necessidade de um grande número de doadores ou pacientes.
Os tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) são estruturalmente semelhantes aos linfonodos, mas têm funções únicas, pois seu principal papel é regular a imunidade mucosa7. Ao contrário dos linfonodos, que geralmente estão localizados a alguma distância dos tecidos, o MALT geralmente está localizado imediatamente abaixo do epitélio do tecido mucosal. Histologicamente, eles são compostos principalmente de altas concentrações de células B e T, mas também células que apresentam antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Malt constituem cerca de 50% do tecido linfoide no corpo humano. Malt são subdivididos em nove grupos, dependendo de sua localização: GALT (intestino),BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntivista), LALT (laringe-), SALT (pele-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) e D-MALT (difundido). O O-MALT é composto principalmente pelas amígdalas do anel de amígdalas de Waldeyer e é o MALT8,,9. De fato, as amígdalas localizadas na orofaringe constituem a principal barreira que protege os tratos digestivos e respiratórios dos (potenciais) microrganismos invasivos10. Além disso, as amígdalas são cobertas por um epitélio escânio estratificado estratificado, apoiado por uma cápsula de tecido conjuntivo contendo vasos sanguíneos, nervos e linfáticos, proporcionando fácil acesso às células imunes11,,12. Além disso, a amigdaxia, o ato cirúrgico de remoção de amígdalas, é um procedimento comum realizado em crianças com respiração desordenada do sono, tornando as amígdalas um tecido facilmente disponível13 em ambientes fisiológicos.
As amígdalas permitem o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. De fato, na infecção pelo HIV, como as amígdalas são compostas por uma alta concentração de células imunes, elas são o principal alvo da replicação viral, mas também produzem uma grande quantidade de citocinas que não são detectadas na circulação14,15. Em estados estáveis, populações raras de células inatas estão presentes em vários tecidos mucosas, incluindo as amígdalas, mas estão essencialmente ausentes do sangue.
Assim, as células mononucleares de amígdalas (TMCs) são um modelo mais relevante e complexo do que os PBMCs e podem responder a perguntas mais profundas. Por outro lado, o uso de explants teciduais pode ser complexo e nem sempre relevante para estudos imunológicos inatas. Assim, estabelecemos um modelo para estudar a ativação imunológica mucosa utilizando TMCs16. Aqui, descrevemos um método para o isolamento eficiente dos TMCs de amígdalas humanas frescas. Este método permite a recuperação de um grande número de células imunes, mantendo sua integridade para estudos ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Grade de aço de 10 malhas - 1910 &micro; m</td><td>Dutscher</td><td>198586</td><td>Para colocar no filtro de células Cellector</td></tr><tr><td>60 malhas grade de aço - 230 &micro; m</td><td>Dutscher</td><td>198591</td><td>Para colocar no filtro de células Cellector</td></tr><tr><td>70 &micro; m filtros de células ClearLine brancos</td><td>Dutscher</td><td>141379C</td><td></td></tr><tr><td>Anios Excell D detergente</td><td>Dutscher</td><td>59852</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Solução antibiótica, 100x</td><td>Thermo</td><td>Fisher 15140122</td><td>100 U/mL Penicilium e 100 &mu; g/mL de estreptomicina - para adicionar aos meios de cultura</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo BD FalconTM, tubos</td> BD <td>Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td>de 5 mL</tr><tr><td>Filtro de células Cellector, 85 mL e 37 mm de diâmetro</td><td>Dutscher</td><td>198585</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo (CTG) Ensaio de viabilidade celular luminescente</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos Falcon 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pinças curvas</td><td>Dutscher</td><td>711200</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>EnVision</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Mede a luminescência</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td></td><td></td><td>Para adicionar aos meios de cultura</td></tr><tr><td>Marcadores de fluorescência anticorpos</td><td>Consulte a Tabela 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilão de vidro</td><td>Dutscher</td><td>198599</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630056</td><td>Uso a 20 mM</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEGENDplex Painel de Resposta Antivírus Humano</td><td>BioLegend</td><td>740390</td><td>Imunoensaio baseado em grânulos</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>StemCell</td><td>7801</td><td>Gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>Mr. Recipiente Frosty</td><td>Thermo Fisher</td><td>5100-0001</td><td>Recipiente de congelamento lento</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeído (p/v), sem metanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Resiquimod (R848)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-r848</td><td>TLR7/8 agonista</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Placa</td> de Cultura de Células <td>SPL Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td>Média</tr><tr><td>, 150 mm x 25 mm (SPL150)</td><td>Dutscher</td><td>330009</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica estéril N&deg; 23</td><td>Dutscher</td><td>132523</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Contas de Compensação</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-2222-41</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo</td><td>Fisher 15575020</td><td>Para fazer tampão de lavagem em PBS</td></tr></tbody></table>

isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.

Primeiro caracterizamos o perfil imunológico das células presentes na cultura e analisamos a quantidade de TMCs. Nós fenítipamos os TMCs de amígdalas com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1,todos os principais tipos de células imunes presentes em PBMCs do sangue foram representadores nos TMCs das amígdalas. No entanto, nos TMCs a frequência de todos os tipos de células, exceto as células B, foram menores do que em PBMCs.
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No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.

Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

As células mononucleares tonsilármais são mais relevantes e complexas do que as células sanguíneas, e seu isolamento permite o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. A técnica que estabelecemos permite a recuperação de um grande número de células imunes de um tecido mucosa, mantendo sua integridade para estudos ex vivo. O método é bastante simples, mas as amígdalas precisam ser tratadas rapidamente e com cuidado para maximizar o rendimento.Transporte o tecido amísil humano para o laboratório, conforme descrito no texto do manuscrito. Em seguida, coloque o coador de células em um prato de cultura de 150 por 25 milímetros. Coloque todos os instrumentos de dissecção em outro prato para mantê-los estéreis.Todos os seus principais espécimes devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos. Em seguida, despeje o PBS do frasco em um coador, porque ele conterá algumas células que egressaram as amígdalas. Usando fórceps estéreis, transfira as amígdalas do frasco para o prato de cultura usando fórceps estéreis.Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade. A dissecção levará cerca de 45 minutos por amígdala. É crucial que durante esse tempo as amígdalas estejam submersas para garantir uma boa viabilidade e rendimentos celulares.Remova tecido cauterizado sangrento e miomado usando fórceps e um bisturi. Usando o bisturi e a pinça curva, corte o tecido em pequenos pedaços de menos de meio centímetro de diâmetro. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular. Raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS uma vez, e transfira o PBS para o frasco também.Antes de prosseguir deixe a suspensão do celular descansar no banco por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque uma peneira estéril de 70 micrômetros em cima de um novo frasco de 50 mililitros. Transfira suavemente a suspensão da célula para a peneira com uma pipeta de 10 mililitros.Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta de um mililitro estéril para raspar as células através da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário. Centrifugar as células a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, descarte o supernasce. Suspenda novamente a pelota tocando suavemente o frasco e, em seguida, suspenda novamente as células em 35 mililitros de PBS. Para completar a primeira fase do isolamento celular, coloque uma nova peneira de 70 micrômetros em cima de um novo frasco e transfira a suspensão celular para ele com uma pipeta de 10 mililitros.Para obter uma solução celular mais clara, comece adicionando 15 mililitros de um gradiente de densidade ao novo frasco de 50 mililitros. Despeje a solução TMC em cima do meio de gradiente de densidade, tomando cuidado para minimizar a mistura. Em seguida, centrifufique a solução a 1000 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente com aceleração e freio desligado.Depois de remover o frasco da centrífuga, use uma pipeta de 10 mililitros para remover e descartar a camada superior. Não perturbe a interface entre os TMCs e o meio gradiente de densidade. Em seguida, remova os TMCs com a ponta de pipeta de um mililitro e transfira-os para um novo frasco de 50 mililitros.Para lavar as células, adicione primeiro 50 mililitros de PBS contendo soro bovino fetal de 2% e 2 milimilhas EDTA. Em seguida, centrifugar o tubo a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células novamente, mas desta vez centrifugar o tubo a 400 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Prepare o meio de cultura R10 suplementando o RPMI 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 milimônios L-glutamina e a solução antibiótica. Suspenda os TMCs em 10 mililitros de R10. Então conte as células.As células podem ser usadas imediatamente ou congeladas para uso futuro, conforme descrito no manuscrito. Os TMCs foram manchados, incubados com anticorpos e caracterizados por citometria de fluxo. Os TMCs continham todos os principais tipos de células imunes presentes em células mononucleares periféricas do sangue, abreviado PMBC.No entanto, as frequências de todos os tipos de células, exceto células B, foram menores em TMCs do que em PBMCs. Para estudar a ativação celular na produção de citocinas, os TMCs foram estimulados durante a noite com resiquimod R848. Os TMCs, plotados em azul, produziram todas as citocinas testadas, exceto ifn Lambda 2/3 e IL-8, embora a produção fosse menor do que em PBMCs, plotadas em verde.A dobra aumenta comparando a estimulação R848 com nenhuma estimulação é notada em vermelho. TMCs purificados e isolados, blocos de tecido azul e tonsilar, laranja, foram estimulados por 24 horas com o vírus influenza A, IAV. A produção de IFN foi detectada em TMCs, mas não no sobrenatante dos blocos teciduais indicando que as explantas teciduais não são o melhor modelo para o estudo da secreção de citocinas e ativação celular.Após a pré-incubação com a droga tóxica C1 e estimulação com R848, TMCs e PBMCs foram avaliados para viabilidade. Os TMCs eram mais sensíveis ao C1. Isso sugere que novas drogas em tratamentos futuros devem ser testadas em células a partir de tecidos, não apenas em linhas celulares, PBMCs ou explants teciduais. Este procedimento nos permite usar os TMCs como PBMCs de sangues inteiros e realizar os mesmos experimentos celulares, como purificação de um tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo ou congelamento.Isolamentos de TMCs possibilitam caracterizar melhor, em um modelo relevante, a resposta imune em órgãos linfoides secundários em patologias que envolvem imunidade mucosa.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos para examinar as contribuições dos tecidos da nasofaringe associados linforreticular (NALT) para nasais e sistêmicas respostas imunes de camundongos de vacinas intranasais são descritos. Nós demonstramos um procedimento cirúrgico para estabelecer um modelo de camundongo NALT-dependente...

Analisar o papel dos Nasopharyngeal-associado do tecido linforreticular (NALT) nas respostas do rato para Vacinas

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

As amígdalas palatinas são uma rica fonte de linfócitos B e T. Aqui fornecemos um protocolo fácil, eficiente e rápido para isolar linfócitos B e T de amígdalas palatinas humanas. O método descrito foi adaptado especificamente para estudos da etiologia viral da inflamação das amígdalas conhecida como amigdalite.

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento, caracterização fenotípica e análise funcional de células imunes de gengiva murino.

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Aprenda a isolar células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em tecido linfoide mucosal humano. Este método preserva a integridade celular para pesquisas em imunologia.

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Isolamento de células mononucleares tonsiláres para estudar respostas imunes inatas ex vivo em um tecido linfoide mucosal humano

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