Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila
12 de março de 2020
Drosophila é um modelo experimental amplamente utilizado adequado para o rastreamento de medicamentos com aplicações potenciais para a terapia do câncer. Aqui, descrevemos o uso de fenótipos de cor dos olhos variegated drosophila como um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina.
Atualmente não existem drogas bem estabelecidas na promoção da formação de heterocromatina. Aqui apresentamos um método simples e eficiente para identificar pequenos compostos de moléculas que promovem esse processo. Nosso protocolo de triagem fornece um sistema in vivo simples, barato e fácil de seguir para identificação de medicamentos que promove a heterocromatina.
Identificar compostos que promovem a formação da heterocromatina pode levar à descoberta de mecanismos de câncer que consertam e terapia contra o câncer. Este custo-benefício foi medido para identificar compostos promotores de heterocromatina em Drosophila também poderia ser usado para contar golpes de forma, pois é uma medida preventiva para uma maior piscina celular de triagem celular. Nosso protocolo de triagem também pode ser útil para telas piloto rápidas, pois este sistema Drosophila TranSheet produz um fenótipo de cor dos olhos variegated que está inversamente correlacionado com a quantidade de heterocromatina presente na mosca.
Ajudando a demonstrar o procedimento será Kenny Dao, um estudante de graduação do nosso laboratório. Depois de identificar e preparar uma biblioteca de drogas para uma triagem usando um solvente apropriado, e a concentração desejada, cruze três moscas machos com três ou mais moscas fêmeas virgens em um frasco de comida de 25 por 95 milímetros. Com nove milímetros de média alimentar Drosophila padrão.
Configure três frascos de réplica para cada droga. Adicione um frasco de controle para a tela. E permitir que as moscas coloquem ovos por dois dias em temperatura ambiente.
No segundo dia da cruz, anestesiar as moscas com uma pequena explosão de dióxido de carbono. E descarte as moscas dos pais em uma garrafa contendo 70% de etanol. Em seguida, diluir cada composto de droga do estoque inicial para atender à concentração final do micro molar em 33% DMSO na água.
E adicione 60 microliters da droga, ou o controle 33% DMSO sozinho, em cima da comida de mosca. Então confirme que nenhuma mosca dos pais está presente dentro dos frascos. E adicione a solução de droga aos frascos apropriados.
Dois dias após as moscas da F1 emergirem, transfira moscas anestesiadas de um frasco de cada vez para uma almofada de dissecação porosa com filtragem de dióxido de carbono por baixo do papel filtro. Sob um microscópio dissecando, examine cada mosca inteira, identificando todos os machos heterozigos pela falta do fenótipo de asa encaracolada e encaracolada. Marque a cor dos olhos de cada macho heterozigo em uma escala de um a cinco.
Com uma pontuação única sendo atribuída a uma área de superfície total de olho disperso inferior a 5%. Adicione uma pontuação de dois para moscas com uma área de superfície total de olho de 6 a 25% de mancha vermelha. Um três para voar com uma área de superfície total de olho de 26 a 50% de manchas vermelhas.
Um quatro para voar com uma área de superfície total de olho de 51 a 75% de mancha vermelha. E um cinco moscas com uma área de superfície total de olho de 75% vermelha. Em seguida, calcule o índice médio de cor de todos os machos de cada frasco pontuado em triplicado.
Para confirmar que os compostos realmente promovem a formação de heterocromatina, uma técnica de validação diferente, como a mancha ocidental, pode ser realizada. Neste experimento representativo, uma pequena biblioteca de medicamentos de moléculas, o conjunto oncológico 3, que é composto por 97 medicamentos de oncologia autorizados pela FDA, foi examinado usando a cepa DX1 de Drosophila Melanogaster. De acordo com o ensaio de triagem, o metotrexato, codificado como E7 na biblioteca, causou a maior variação dentro da cepa Dx1.
Sugerindo que o metotrexato pode ser o medicamento mais promissor para a heterocromatina para futura terapia direcionada ao câncer. Para confirmar ainda mais que este composto promove a transformação da heterocromatina, foram realizados dados de manchas ocidentais. Demonstrando a regulação da heterocromatina formatina associada à proteína, trimetilação H3K9 e validação dos resultados de triagem.
O passo crítico é marcar a cor dos olhos de cada um dos 11-18 DX1 heterozigos machos brancos em uma escala de um a cinco, de acordo com uma rota de estudo predeterminada. Podemos usar manchas ocidentais ou imunossagens para confirmar os golpes. A descoberta de compostos suspeitos de promover a formação de heterocromatina também pode levar à descoberta de mecanismo genético IV de desenvolvimento do câncer e ensaios clínicos em pacientes humanos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina utilizando Drosophila. A abordagem utiliza fenótipos de cor variegada dos olhos como indicador dos níveis de heterocromatina, fornecendo um sistema simples e eficiente in vivo para identificação de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Triagem de Fármacos
- Genética
Antecedentes
- A heterocromatina desempenha um papel crucial na regulação gênica e na função celular.
- Os métodos atuais para promover a formação de heterocromatina são limitados.
- Drosophila serve como um organismo modelo eficaz para estudos genéticos.
- Fenótipos de cor dos olhos variegados podem indicar níveis de heterocromatina in vivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método economicamente viável para identificar compostos que promovam a formação de heterocromatina.
- Utilizar Drosophila como modelo para triagem de fármacos com potencial terapêutico contra o câncer.
- Estabelecer um protocolo fácil de seguir e de baixo custo.
Métodos Utilizados
- Triagem de compostos de baixa massa molecular em Drosophila.
- Avaliação de fenótipos de cor dos olhos como medida da presença de heterocromatina.
- Implementação de um protocolo simples de triagem in vivo.
- Avaliação da correlação entre a cor dos olhos e os níveis de heterocromatina.
Resultados Principais
- O protocolo de triagem identificou com sucesso compostos que promovem a formação de heterocromatina.
- Os fenótipos de cor dos olhos variegados correlacionaram-se com a quantidade de heterocromatina.
- O método revelou-se eficiente e economicamente viável para a identificação de fármacos.
- Foram discutidas implicações potenciais para a terapia do câncer.
Conclusões
- Este estudo fornece uma abordagem inovadora para triagem de fármacos na pesquisa de câncer.
- Drosophila pode ser efetivamente utilizada para identificar compostos que promovem heterocromatina.
- Os achados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos e terapias do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método fornece um sistema in vivo economicamente viável para identificar compostos que promovem a heterocromatina, preenchendo uma lacuna na descoberta de fármacos epigenéticos para terapias contra o câncer. Ao utilizar a variegância ocular de Drosophila como leitura quantitativa, ele permite a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em mecanismos epigenéticos. A abordagem oferece confiança preditiva na identificação de compostos líderes e na triagem de portfólios para programas de descoberta voltados à oncologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à formação de heterocromatina e regulação epigenética no câncer.
- Valor Operacional: Oferece um sistema simples e de baixo custo in vivo para validação funcional de alvos de modificadores epigenéticos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao associar os efeitos do composto a alterações em proteínas ligadas à heterocromatina, como a trimetilação de H3K9.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera escores quantitativos de cor dos olhos (1–5) que se correlacionam com níveis de heterocromatina para priorização de compostos.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo padronizado e reprodutível utilizando pontuação em frascos triplicados e cálculo do índice médio de cor.
- Prontidão do Ensaio: Permite avaliação confiável de compostos em um sistema relevante para doenças com infraestrutura mínima.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Conecta descobertas em Drosophila a mecanismos de câncer humano por meio de vias epigenéticas conservadas.
- Continuidade Pré-clínica: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao validar alvos com métodos ortogonais, como o western blotting.
- Redução de Riscos Mecanística: Ajuda a elucidar mecanismos epigenéticos do desenvolvimento do câncer por meio de compostos promotores de heterocromatina identificados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se nas fases iniciais de descoberta até a identificação de compostos ativos, fornecendo dados de triagem epigenética que orientam a progressão de acertos para liderança em programas de oncologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses de alvos epigenéticos e a elucidação de vias por meio de leituras da formação de heterocromatina.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos prontos para ensaio com saídas quantitativas e escaláveis para avaliação de bibliotecas de compostos.
- Análises: Permite comparações baseadas em dados por meio do índice médio de cor e análise estatística dos resultados de frascos triplicados.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao confirmar acertos com biomarcadores de proteínas da heterocromatina.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de triagem epigenética para múltiplas classes de alvos em oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na regulação epigenética.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de pontuação in vivo simples e testes com réplicas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos, a eficiência do capital e reduz o risco biológico em estágios avançados na descoberta de fármacos epigenéticos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço de compostos ajustados ao risco com base na atividade de promoção de heterocromatina.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em genética de Drosophila e manipulação de compostos para a preparação da biblioteca.
- Necessita de microscopia de dissecação padrão e ferramentas de análise para fenotipagem da cor dos olhos.
- Exige padronização entre equipes para configuração consistente de frascos, análise e interpretação de dados.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros sistemas modelo ou classes de compostos.
- Inclui limitações práticas, como a subjetividade na análise e a necessidade de validação ortogonal dos acertos.
