Name: Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda técnicas histológicas qualitativas e quantitativas para analisar defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos. Este método padronizado auxilia pesquisadores em cardiologia e biologia do desenvolvimento.

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O Aguirre Lab é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde o número do prêmio K01HL135464 e pela American Heart Association o prêmio número 19IPLOI34660342.

<ol><li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li>
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<li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm divulgações para relatar.

Este protocolo explora as técnicas envolvidas na análise do desenvolvimento cardíaco em corações embrionários. Algumas limitações deste método são a destreza física necessária para as técnicas preparatórias, que podem exigir prática, e habilidade com imagens de microscópio. Se as fatias obtidas no criostato forem bagunçadas, a coloração de hematoxilina e eosina não será clara, ou se as imagens tiradas no microscópio tiverem pouca iluminação, então o método usado com imagej não funcionará. Uma limitação do recurso de limi...

Os CHDs são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos e são a principal causa de mortes relacionadas a defeitos congênitos1,2,3,4,5,6. Embora cerca de 90% das crianças recém-nascidas sobrevivam à Dra, ela é frequentemente associada a significativa morbidade e intervenções médicas ao longo dos anos, impondo um fardo pesado na vida dos pacientes e no sistema de saúde7,8,9,10. Fora fatores puramente genéticos, as causas da DCh são mal compreendidas4. As causas não identificadas representam ~56-66% de todos os casos de CHD de acordo com a American Heart Association e outras fontes2,3,4,11. Fatores bem conhecidos incluem mutações genéticas, CNVs, variantes de novo nucleotídeo único e aneuploidia. Suspeita-se que fatores ambientais e dietéticos também sejam fontes importantes que contribuem para a DCH, como sugerem estudos epidemiológicos que ligam o estilo de vida materno2,12, privação econômica e raça13, e por pesquisas sobre fatores dietéticos como o ácido fólico11,14 e o ácido retinóico lipídico bioativo15,16. Investigar os mecanismos e causas da Doença e outros defeitos cardiovasculares é importante para desenvolver estratégias preventivas e novas opções terapêuticas1,4,17,18,19.
O camundongo em desenvolvimento é um modelo fundamental para estudar CHD em mamíferos. No entanto, alguns dos métodos e análises empregados, como dissecções que preservam a morfologia cardíaca, análise de estágios de desenvolvimento e identificação de defeitos associados à ChD, podem ser assustadores para os cientistas que são novos na análise de corações murina. O objetivo dos métodos descritos neste protocolo é oferecer diretrizes qualitativas e quantitativas para esses processos. Assim, neste protocolo explicamos como realizar acasalamentos cronometrados para produzir embriões do estágio gestacional desejado, dissecar fêmeas grávidas para recuperação cardíaca intacta (incluindo tecidos associados, como o trato de saída), fixação cardíaca e preparação para secção criostato, métodos básicos de histologia, análises quantitativas de defeitos cardíacos comuns e análise qualitativa da compactação muscular cardíaca, um fenótipo precursor comum para alguns tipos de CHD.

<table><tbody><tr><td>Tubo(s) cônico(s) de 15 mL</td> <td>Fisher Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Ratos</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - estoque 000664</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de coloração Coplin (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prato(s) de DissecaçãoFisher</td> <td>Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinça Fina (x2)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Eosina Y</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico (Puro, 200 provas)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td> <td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td> <td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Fluorescente Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Millipore Sigma</td> <td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td> <td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Software Graphpad Prism 8</td><td>Software Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina de Mayer</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ponta(s) de micropipeta - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>Microsoft ExcelMicrosoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus CkX53</td> Pincéis <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(pelo menos 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>Faça em solução a 4% (dissolvido em PBS)</td></tr><tr><td>Pipeta(s) Pasteur Scientific</td><td></td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Diluir de 10x a 1x antes de usar</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Molde quadrado</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Para moldes OCT</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo descartáveis Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Balança de viagem</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Os defeitos cardíacos congênitos (DCh) são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos, afetando até 1% de todos os nascidos vivos. No entanto, as causas subjacentes à DCh ainda são pouco compreendidas. O camundongo em desenvolvimento constitui um modelo valioso para o estudo da ChD, porque os programas de desenvolvimento cardíaco entre camundongos e humanos são altamente conservados. O protocolo descreve em detalhes como produzir embriões de camundongos do estágio gestacional desejado, métodos para isolar e preservar o coração para processamento a jusante, métodos quantitativos para identificar tipos comuns de CHD por histologia (por exemplo, septal ventricular defeitos, defeitos septos atrial, patente ductus arteriosus) e métodos quantitativos de histomormormetria para medir fenótipos comuns de compactação muscular. Esses métodos articulam todas as etapas envolvidas na preparação, coleta e análise da amostra, permitindo aos cientistas medir corretamente e reprodutivelmente a CHD.

O índice de compactação muscular foi comparado entre os corações em desenvolvimento em dois ambientes diferentes, um controle e um grupo experimental. Esses protocolos foram utilizados para analisar quantitativamente a compactação do tecido muscular, o que permitiu a análise estatística. A compactação muscular mostrou-se significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões que se desenvolveram em condições não experimentais.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Este protocolo padroniza novas técnicas de análise de tecidos para que possam ser mais amplamente utilizadas por outros grupos que também estudam defeitos cardíacos congênitos. Como tanto as técnicas de análise qualitativa quanto quantitativa têm seus prós e contras, essa metodologia utiliza tanto para abordar a mais ampla gama de questões experimentais. Essas técnicas podem ter um impacto positivo nos métodos de diagnóstico de cardiologia.Por exemplo, os patologistas poderiam aplicar nossas técnicas de análise de tecido cardíaco microscópico para diagnosticar doenças cardíacas humanas a partir de amostras de biópsia. Este protocolo pode ser usado para pesquisa de cardiologia de desenvolvimento ou cardiologia geral. No entanto, esses métodos também fornecem várias técnicas úteis que podem ser aplicadas para qualquer análise tecidual.Para coletar corações embrionários de 15 a 15,5 corações, fixar os membros de uma represa grávida e começar ao redor da uretra até o esterno, cuidadosamente fazer uma incisão em forma de I ao longo do tronco. Usando fórceps em um movimento de colher, levante suavemente o útero da cavidade abdominal segurando os tecidos superficiais do útero conforme necessário com fórceps finos para ajudar na extração. Use uma tesoura para soltar o útero do abdômen.Depois de absorver o útero em PBS gelado, fixe o órgão em um prato de dissecção. Usando uma tesoura, corte o útero em seções individuais, cada uma contendo um embrião separado. Usando dois pares de fórceps finos, retire suavemente os embriões do tecido uterino e coloque-os em uma nova placa de Petri contendo quatro graus Celsius PBS-EDTA.Para coletar os corações, coloque o prato sob um microscópio dissecando e use dois pares de fórceps finos para posicionar o embrião na posição supina. Após estabilizar o acesso ao peito, use o ponto afiado de um segundo par de fórceps finos para fazer uma incisão ao longo do esterno do embrião estendendo-se entre as clavículas até o umbigo. Fazer incisões muito finas e superficiais enquanto trabalha gradualmente em direção ao interior da cavidade torácica, abra o abdômen do embrião.Quando o coração se tornar visível, use um par de fórceps para espremer o tronco ligeiramente preso à caixa torácica para descascar as costelas abertas. Usando as laterais de um par de fórceps, pegue suavemente os vasos sanguíneos pulmonares sem separar o tecido e puxe o coração para fora da cavidade. Limpe o coração em PBS-EDTA fresco por um a dois minutos antes de fixar o tecido em 4% Paraformaldeído por 45 a 60 minutos.Em seguida, lave o coração três vezes por 5 a 10 minutos por lavagem em PBS complementado com glicina. Antes de armazenar os corações na PBS a quatro graus Celsius. Para preparar o coração para a crioseção, coloque as amostras em um tubo de 30% de sacarose e PBS a quatro graus Celsius por 24 a 40 horas.Quando os corações tiverem afundado na parte inferior do tubo, use uma Pasta de Pipeta com uma ponta modificada para transferir cuidadosamente cada coração para um pedaço de lenço livre de fiapos. Após uma breve secagem do ar, coloque cada amostra em moldes de temperatura de corte ideais individuais nas orientações desejadas para secção. Submergir os tecidos em meio de temperatura de corte ideal sem bolhas.Em seguida, armazene os moldes a 20 graus Celsius por até alguns dias antes de congelar os tecidos a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de criosectioning. Para obter seções criostatas das amostras, use um meio de corte de temperatura ideal fresco para anexar o bloco de tecido de interesse ao mandril do criostat e permitir que o meio congele até que seja branco opaco. Insira uma nova lâmina e ajuste a distância entre o bloco tecidual e a lâmina para permitir que seções sejam obtidas.Corte o bloco em fatias de 10 micrômetros até que o ponto de interesse seja atingido. Quando o tecido puder ser observado, use um pequeno pincel plano para puxar suavemente a fatia contra o suporte em um movimento de corte contínuo. Uma vez que o tecido tenha sido completamente cortado, use a escova de detalhes para acariciar a fatia plana contra o palco.Mantenha a seção no lugar por aproximadamente 20 a 30 segundos antes de remover o pincel detalhado e terminar a fatia. Use ambas as pincéis para achatar suavemente a fatia contra o palco impedindo qualquer rolamento e segure a seção do tecido contra o palco. Após 20 a 30 segundos, gire a seção e achate-a contra o palco novamente antes de colocar um slide eletroessalticamente carregado perto o suficiente para que a fatia seja atraída e adere ao slide sem ter que tocar o slide para o palco.Para avaliar as seções do tecido cardíaco para a presença de defeitos cardíacos comuns, utilizando um microscópio equipado com uma câmera, obtenha imagens a 5 a 10X e ampliações de 40X. Para análise de compactação muscular cardíaca, abra um tecido de interesse em um programa de análise de imagem apropriado e defina a imagem para 8 bits. Para definir o limiar da imagem, clique em Imagem, Ajuste e Limiar e mova a barra superior para ajustar o limiar até que apenas os pixels para o plano de fundo sejam selecionados.Em seguida, use a ferramenta de seleções de polígonos para desenhar uma região de interesse em torno do tecido e, em seguida, clique em Analisar, Definir Medidas, Área e Limite ao limiar. Clique em Analisar e Medir para medir a área dos pixels destacados para obter o valor da área do espaço negativo. Para medir a área de toda a região de interesse, clique em Analisar, Definir Medidas e desmarcar Limite para limite.Em seguida, selecione Analisar e Medir para medir toda a área da região selecionada de interesse. Para calcular a Área de tecido muscular, subtraia a Área de Espaço Negativo da Área da Região de Interesse. Em seguida, divida a Área do Tecido Muscular pela Área da Região de Interesse para calcular a compactação muscular e X.A coloração de fatias de tecido de corações embrionários colhidos, proporciona contraste suficiente para ver as bordas teciduais, mas não é tão escura a ponto de tornar as características celulares indistinguíveis.Nesta análise representativa, observou-se que a compactação muscular foi significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões desenvolvidos em condições não experimentais. Essas amostras são valiosas e requerem muito tempo para serem criadas. Durante a necropsia e a seção criostate especificamente, certifique-se de ser intencional sobre cada ação que você executar.A preservação dos tecidos em Paraformaldeído mantém a atividade de antígeno permitindo que as amostras sejam usadas para testes como a coloração de Aminofluoresceína que ajudam a identificar causas patológicas encontradas durante a avaliação da morfologia. Em nosso laboratório, obtivemos representação quantitativa de tratamentos experimentais que podem nos ajudar a identificar até que ponto diferentes tratamentos afetam nossas amostras. Paraformaldeído pode consertar qualquer tecido que toque.Tome cuidado para sempre usar luvas para minimizar a pele exposta e trabalhar em um capuz de filme sempre que trabalhar com este produto químico.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Ecocardiografia Fetal murino

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Imagem de ultra-som de alta frequência do mouse fetal melhorou a resolução de imagem e pode fornecer precisa caracterização não-invasivo do desenvolvimento cardíaco e defeitos estruturais. O protocolo descrito neste documento é projetado para executar em tempo real de ratos fetal ecocardiografia na vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

Este artigo detalha os métodos diagnósticos de cardiopatia congênita murina (DCC) usando ecocardiografia fetal, necropsia e captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando microscopia confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrução tridimensional (3D).

Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

Aqui relatamos rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos usando enxerto de intraespécie do tubo neuralGFP combinado com injeção intra-vascular diI. Esta técnica experimental nos permite visualizar e estudar simultaneamente o desenvolvimento do sistema nervoso derivado do NCC (entérico) e do sistema vascular, durante a organogênese.

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar agentes de contraste de microbolhas de ultra-som de estar, isoladas de fim de gestação de embriões palco murino. Este método permite o estudo de parâmetros de perfusão e de marcadores moleculares vasculares dentro do embrião usando de alta freqüência ultra-sonografia com contraste.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Aprenda técnicas histológicas qualitativas e quantitativas para analisar defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos. Este método padronizado auxilia pesquisadores em cardiologia e biologia do desenvolvimento.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

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