Name: Observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a visualizar dinâmica vascular hepática em camundongos usando microscopia multifotônica com corante Rhodamine B isothiocyanate–dextran. Esta técnica permite imagem 3D em tempo real de vasos sanguíneos em tecido vivo.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772133, 81902444), o Fundo de Ciência Natural de Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), o Projeto de Pesquisa em Ciência e Tecnologia em Saúde Cidadã de Guangzhou (201803010034, 201903010072) e o Projeto de Inovação Médica Militar (17CXZ008).

Todos os cuidados e procedimentos de animais estavam de acordo com as políticas do Hospital China Nanfang para saúde e bem-estar (aplicação NFYY-2019-73).
1. Preparação do rato
<ol><li>Anestesiar o rato.<ol>
<li>Prepare pentobarbital de sódio (50 mg/kg) em uma seringa.</li>
		<li>Pegue o mouse (C57BL/6 masculino de 8 semanas de idade) com a mão esquerda para que sua barriga esteja virada para cima e sua cabeça fique mais baixa que sua cauda. Desinfete a pele abdominal com 75% de álcool.</li>
		<li>Segurando a seringa na mão direita, fure a linha branca do abdômen com a agulha ligeiramente para o lado direito da pele por 3-5 mm. Certifique-se de que a agulha da seringa e a pele estão em um ângulo de 45°, injete o pentobarbital lentamente na cavidade abdominal.  Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.</li>
		<li>Verifique se a anestesia foi bem sucedida pela falta de um reflexo de direito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete isothiocyanato-dextran de Rhodamine B na veia caudal.<ol>
<li>Prepare 100 μL de 10 mg/mL Rhodamine B isothiocyanato-dextran em uma seringa.</li>
		<li>Limpe a cauda do rato com 75% de álcool.</li>
		<li>Segure a cauda com a mão esquerda, segure a seringa na mão direita com a agulha paralela à veia e injete o corante de 100 μL.</li>
		<li>Pare o sangramento com um cotonete depois da injeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe a pele abdominal do rato com gaze molhada com água estéril, e raspe o abdômen do rato usando uma navalha, fazendo traços na direção da pele. Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.</li>
	<li>Depois de limpar uma almofada de aquecimento com 75% de álcool, abra a almofada de aquecimento e coloque o mouse de costas na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.</li>
</ol>2. Fixação do fígado do rato com a estrutura de imagem do órgão corporal
NOTA: O quadro de imagem do órgão comercial ainda não foi divulgado.
<ol><li>Coloque uma ventosa limpa em uma posição fixa.</li>
	<li>Instale uma luminária de imagem de órgão(Figura Suplementar 1) e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com 75% de álcool.</li>
	<li>Conecte a ventosa (5 mm de diâmetro) à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba de vácuo.</li>
	<li>Em uma mesa estéril esterilizada com 75% de álcool, desinfeta ao redor do local de incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, usar tesoura cirúrgica para cortar 2 cm de pele da borda severa inferior do rato e expor o fígado.</li>
	<li>Coloque o mouse junto com a almofada de aquecimento na base do suporte.</li>
	<li>Ajuste a luminária de imagem do órgão para que a ventosa segure o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30-35 kPa para sucção para que o fígado se anexe ao copo de sucção(Figura Suplementar 2).</li>
</ol>3. Ajustando o microscópio de varredura a laser multifotônio
<ol><li>Ligue o microscópio multifotono e selecione o objetivo de 60x/1.00 W.</li>
	<li>Fixar o quadro e o mouse sob a lente objetiva.</li>
	<li>Adicione uma gota de soro fisiológico normal que pode cobrir toda a lente, que é o centro da ventosa, e ajustar a lente objetiva para apenas tocar o soro fisiológico normal.</li>
	<li>Clique duas vezes no ícone do computador para ativar o software laser e ativar o interruptor. Em seguida, pressione e segure o botão de alimentação e o obturador por 3 s.</li>
	<li>Defina o comprimento de onda para 800 nm.</li>
	<li>Inicie o software operacional do microscópio usando o computador.</li>
	<li>Para a Configuração de Aquisição,ajuste Laser 800.</li>
</ol>4. Observação usando microscópio de varredura a laser multifotônio
<ol><li>Para controle de aquisição deimagens, clique no interruptor fluorescente.</li>
	<li>Certifique-se de que as luzes da sala e do equipamento estão desligadas. Para reduzir os níveis de ruído, use o microscópio em um ambiente escurecido.</li>
	<li>Abra o obturador do caminho de luz no microscópio.</li>
	<li>Gire o filtro de fluorescência para a quarta marcha e puxe as duas alavancas do interruptor óptico.</li>
	<li>Olhando através da ocular, use os quasispirals de foco grosseiro e fino para ajustar a distância focal, e use os eixosX/Y para ajustar o campo de visão para encontrar a área alvo.</li>
</ol>5. Micrografia de varredura a laser multifotônio
<ol><li>Desligue o interruptor fluorescente no software, troque o filtro fluorescente para a segunda marcha (a segunda marcha é RXD1) e empurre as duas alavancas do interruptor óptico.</li>
	<li>Clique em Focus ×2 para visualizar a área de destino e ajustar a configuração de aquisição e os parâmetros de controle de aquisição de imagens (resolução de imagem: 1024).</li>
	<li>Pressione o controle + C e ajuste a alta tensão, ganho e deslocamento (para reduzir os níveis de ruído).</li>
	<li>Clique em Parar para interromper a visualização, clique no botão XY para digitalizar em duas dimensões e salvar após a conclusão(Figura 1).</li>
	<li>Selecione uma região, clique em Profundidadee, em seguida, visualize para selecionar o conjunto final e o conjunto de início (veja a parte completa necessária do vaso sanguíneo) na configuração do microscópio. Digitalize imagens 3D e salve após a conclusão(Figura 2).</li>
	<li>Selecione uma região, clique em Timee ajuste outros parâmetros de configuração de aquisição e controle de aquisição de imagens (Tamanho da etapa: 1 μm; Fatias: 10; Número de varredura de tempo: 40). Digitalize diferentes fatias e salve após a conclusão para obter imagens em movimento(Vídeo 1). NOTA: Tenha alguém cuidando dos ratos durante o exame e adicione anestesia em conformidade.</li>
	<li>Sacrifique o rato por dissecção do pescoço.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
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<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Observar um tecido vivo específico é um meio eficaz de compreender as mudanças, localização e efeitos biológicos do material dentro do tecido17. Neste experimento, os passos importantes são a fixação do fígado com uma fixação de imagem de órgão, que pode resolver o problema dos artefatos de movimento devido à respiração e batimentos cardíacos, e o uso de um microscópio multifotônio para observação. Usando este método, os tecidos internos do fígado in vivo são observados através de um microscópio m...

Os vasos sanguíneos podem fornecer nutrientes para vários tecidos de órgãos do corpo humano, e trocar substâncias. Ao mesmo tempo, muitas citocinas, hormônios, drogas e células também funcionam através do transporte vascular para locais específicos. Observar alterações vasculares no tecido hepático pode ajudar na compreensão do fluxo sanguíneo no tecido hepático e no transporte de substâncias, e auxiliar na análise de certas doenças vasculares1,2.
Há muitas maneiras de observar os vasos sanguíneos do fígado em camundongos. Entre elas, a microscopia óptica tem muitas limitações na observação do tecido vascular opaco3. A microscopia multifotúna pode ser usada para imaginar os vasos sanguíneos de fígados vivos com alta resolução não invasiva4. Não só podem ser obtidas imagens tridimensionais dos vasos sanguíneos, mas a técnica também pode ser usada para ajudar a organizar o tecido para observar efeitos biológicos; além disso, todo o tecido pode ser imageado em vez de apenas os microvexis como na tomografia computadorizada e ressonância magnética5.
A microscopia multifotônio pode ser usada para detectar efetivamente sinais fluorescentes dispersos em tecido vivo profundo, com menos fototoxicidade6. Portanto, a atividade do tecido vivo pode ser garantida, e a quantidade de dano pode ser reduzida. A microscopia multifotônio tem melhor poder penetrante do que a microscopia confocal, permitindo que camadas mais profundas sejam observadas7, fornecendo imagens 3D únicas. A microscopia multifotônio é agora frequentemente usada na imagem dos nervos cranianos8 e foi estendida ao estudo da dinâmica neuronal em camundongos vivos9,10,11.
Neste experimento, após a rotulagem fluorescente dos vasos sanguíneos do rato, o fígado é fixado em uma estrutura, e a dinâmica dos vasos sanguíneos no tecido hepático vivo pode ser vista usando microscopia multifotítica. Este experimento demonstra como marcar substâncias específicas, usar microscopia multifotônica para ajudar a observar um local dentro do tecido, observar eventos celulares no tecido intercelular, fazer medições fotoquímicas12,13,14, e observar a dinâmica material dentro do tecido vivo15. Por exemplo, o marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) foi identificado como um novo marcador de superfície regulado nos vasos sanguíneos e estroma em muitos tumores sólidos, marcando fragmento variável de cadeia única (scFv) 78 contra TEM1, e então microscopia multifotona pode ser usada para localização de hemangioma de camundongos e avaliação de tumores16.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL x 2</td><td>Hunan Pinan Medical Devices Technology</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>5 W almofada de aquecimento</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol absoluto</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Bola de algodão absorvente</td><td>Healthy Sanitation Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse instrumento cirúrgico</td><td>RWD Life Science</td><td>SP0001-G</td><td>Incluindo tesouras e pinças</td></tr><tr><td>Microscopia multifotônica</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imagem de órgãos</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td>Incluindo ventosa, mangueira, bomba de pressão negativa e suporte</td></tr><tr><td>Isotiocianato de rodamina B&ndash; Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de barbear</td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sódio</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Observar a dinâmica intravascular do tecido hepático do camundongo nos permite realizar observações e estudos mais aprofundados sobre doenças relacionadas ao tecido do fígado de camundongos. Um rato é injetado com um corante que pode manchar vasos sanguíneos. Para observar o fígado do rato in vivo, ele é exposto e fixado em uma moldura. Imagens bidimensionais dos vasos sanguíneos no tecido hepático são obtidas usando um microscópio multifotono. As imagens dos tecidos nos locais selecionados são adquiridas continuamente para observar alterações a longo prazo; as mudanças dinâmicas dos vasos sanguíneos nos tecidos hepáticos também são observadas. Microscopia multifotítica é um método para observar a função celular e celular em seções de tecido profundo ou órgãos. A microscopia multifotônica tem sensibilidade à microestrutura tecidual e permite a imagem de tecidos biológicos em alta resolução espacial in vivo, proporcionando a capacidade de capturar as informações bioquímicas da organização. A microscopia multifotônio é usada para observar parte do fígado, mas fixar o fígado para tornar a imagem mais estável é problemático. Neste experimento, uma ventosa especial é usada para consertar o fígado e obter uma imagem mais estável do fígado sob o microscópio. Além disso, este método pode ser usado para observar alterações dinâmicas de substâncias específicas no fígado, marcando tais substâncias com corantes.

A distribuição dos vasos sanguíneos no fígado pode ser vista na Figura 1,obtida por meio de microscopia multifotona. O vaso sanguíneo é dividido em uma pluralidade de ramos emanando de um tronco e distribuídos para o espaço circundante. A circunferência externa do vaso sanguíneo é vermelha, a cavidade interna é escura, e há muitas coisas dentro. Quanto mais clara a imagem, mais perto do plano de observação ela é. Há também algumas manchas vermelhas ao redor, provavelmente porque o corante pe...

Neste experimento, um rato é injetado em sua veia traseira com isotocianato Rhodamine B-dextran que pode manchar vasos sanguíneos. Depois que o fígado é exposto e fixo, uma parte específica do fígado pode ser selecionada para observar o tecido profundo no corpo vivo usando microscopia multifotícula.

Observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Este método pode nos ajudar a visualizar os movimentos dos vasos sanguíneos dentro do fígado do rato ao longo da evolução da dinâmica do fígado em múltiplas dimensões. Usando este método, podemos visualizar a dinâmica dos vasos sanguíneos dentro do fígado em três dimensões. Demonstramos o uso de corante vascular, mas você pode realizar a coloração do vaso com sua substância de interesse antes da visualização microscópica.Depois de confirmar a falta de reflexo de direito em um anesthetizado macho C 57 preto seis rato. Limpe a cauda do rato com 75% de álcool e use uma seringa de um microliter equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar 10 miligramas por mililitro de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran em 100 microlitres de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran na veia caudal da cauda. Quando toda a solução tiver sido entregue use um cotonete para aplicar pressão no local da punção e use gaze molhada com água estéril para absorver a pele abdominal.Use uma navalha para raspar o abdômen, fazendo traços na direção da pele, e coloque o rato em uma almofada de aquecimento desinfetada de 37 graus Celsius. Para fixar o fígado do rato com uma estrutura de imagem de órgão corporal, primeiro coloque um copo de sucção de cinco milímetros limpo em uma posição fixa e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com 75% de álcool. Conecte a ventosa à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba.Em uma mesa esterilizada de 75% de álcool use uma tesoura cirúrgica para cortar dois centímetros de pele da borda severa inferior do camundongo e expor o fígado. Coloque o mouse e a almofada de aquecimento sobre a base do suporte da estrutura corporal e ajuste a fixação de imagem do órgão para que o copo de sucção possa segurar o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30 a 35 quilopascals para sucção para que o fígado se apegue ao copo.Para configurar o microscópio de varredura a laser multifotônio, ligue o Microscópio e selecione o objetivo de 60 X. Fixar o quadro e o mouse sob o objetivo e adicionar uma gota de soro fisiológico normal ao copo grande o suficiente para cobrir a lente. Ajuste o objetivo para que a lente toque o soro fisiológico normal e ligue o software laser.Ligue o laser e pressione e segure o botão de alimentação e o obturador por três segundos. Em seguida, inicie o software operacional do microscópio e defina o laser para 800 nanômetros. Para definir o controle de aquisição de imagens clique no interruptor fluorescente e desligue as luzes da sala e do equipamento.Abra o obturador do caminho de luz no microscópio e gire o filtro de fluorescência para a quarta marcha. Puxe as duas alavancas do interruptor óptico e olhando através da peça do olho, use o curso e focando finamente quase espirais para ajustar a distância focal. Em seguida, use os eixos X Y para ajustar o campo de visão para localizar a área alvo.Para a imagem, desligue o interruptor fluorescente no software e mude o filtro fluorescente para a segunda marcha. Empurre as duas alavancas do interruptor óptico e clique em foco vezes duas para visualizar a área de destino ajustar as configurações de aquisição e os parâmetros de controle de aquisição de imagem e o controle de pressão mais C para ajustar o ganho e deslocamento de alta tensão. Clique em parar para interromper a visualização, clique no botão X Y para digitalizar em duas dimensões e clique em salvar.Selecione uma região e clique em profundidade e visualização para selecionar os conjuntos finais e iniciar nas configurações do microscópio. Digitalize imagens 3D e salve. Após a digitalização, selecione uma região clique em tempo e ajuste as outras configurações de aquisição e parâmetros controlados de aquisição de imagens.Em seguida, digitalize as diferentes fatias e salve para obter o filme de imagem resultante. Aqui pode ser observada a visualização da distribuição dos vasos sanguíneos dentro do fígado usando microscopia multifótons, conforme demonstrado. Este vaso sanguíneo é dividido em uma pluralidade de ramos emanando de um tronco e distribuídos para o espaço circundante.A circunferência externa do vaso sanguíneo pode ser observada em vermelho enquanto a cavidade interna é escura, como observado no vídeo objetos não vermelhos movendo-se dentro dos vasos podem ser células. A escuridão do tecido observado neste vídeo é provavelmente devido ao fígado não ter sido bem fixado ao longo do tempo. É importante lembrar que como o fígado sem cicatrizes é fixado, afeta a estabilidade da imagem.Essa metodologia também pode ser aplicada à posição de outras estruturas dentro do fígado para a observação direta da distribuição ou mudanças em estruturas específicas de trabalho de interesse.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com FITC e para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos com laser assistida phosphorimetry. Este método pode ser usado para investigar os mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, o diâmetro, a velocidade de fluxo de sangue, e tensão de oxigénio.

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Este vídeo descreve um procedimento de imagem para observar e estudar a dinâmica intravascular de um tecido hepático de camundongo usando microscopia multifotônica após a estabilização do órgão. A microscopia multifotônica permite a imagem de tecido biológico em alta resolução espacial in vivo.

Estágio de fígado de camundongo com suporte de dispositivo de imagem para visualização vascular baseada em microscopia multifotônica: uma técnica de imagem assistida por dispositivo de estabilização para obter imagens multidimensionais de vasos sanguíneos no fígado de camundongo

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

A imagem intravital estável de alta resolução de células imunes no fígado é um desafio. Aqui, fornecemos um método altamente sensível e confiável para estudar a migração e as interações célula-célula de células imunes no fígado de camundongo por longos períodos (cerca de 6 horas) por microscopia de varredura a laser multifotônica intravital em combinação com monitoramento de terapia intensiva.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico para realizar a quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar para tecido pulmonar de camundongos inteiros usando coloração única de Isolectina B4.

Quantificando a densidade microvascular pulmonar em camundongos através de lóbulos

A ultrassonografia Doppler ultrarrápida (UFUS) com alta resolução espacial (100 μm) e sensibilidade representa uma modalidade de imagem não invasiva adequada para obter uma visão qualitativa abrangente da vasculatura hepática. O UFUS também facilita as medições quantitativas da microvasculatura, com o objetivo de melhorar nossa compreensão dos mecanismos das doenças vasculares.

Imagem e quantificação da vasculatura hepática de camundongos usando ultrassom Doppler ultrarrápido

Aprenda a visualizar dinâmica vascular hepática em camundongos usando microscopia multifotônica com corante Rhodamine B isothiocyanate–dextran. Esta técnica permite imagem 3D em tempo real de vasos sanguíneos em tecido vivo.

Observação microscópica multifotípica de vasos em tecido hepático de rato

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