Name: Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprenda a imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubular no meristema apical caulinar de Arabidopsis e sua resposta a forças mecânicas. Este método quantitativo permite analisar diferenças entre genótipos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Crescimento das plantas
<ol><li>Semear sementes arabidopsis expressando domínio de ligação de microtúbulos fundido com proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 no solo e manter-se em longo dia (16 h dia /8 h noite), 20 °C/6 °C condições para 1 semana para germinação.</li>
	<li>Após a germinação, transfira mudas para novos potes com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto. Mantenha as plantas em dias curtos (8h dia /16h à noite), 20 °C/16 °C condições por 3-5 semanas.</li>
	<li>Transfira as plantas para o dia longo (16h dia /8h à noite), 20 °C/16 °C e mantenha até as plantas parafuso (2-3 semanas). Permita que a inflorescência cresça até 2-5 cm de comprimento.</li>
</ol>2. Preparação média
<ol><li>Prepare os pratos de dissecação preenchendo pequenas placas de Petri (aproximadamente 5,5 cm de largura, 1,5 cm de profundidade) para aproximadamente metade de sua profundidade com 2% de agarose. Os pratos dissecando também podem ser usados para imagens de ponto único.</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento.<ol>
<li>Prepare 50 mL de uma solução de estoque de vitaminas de 1.000x com 5 g de mio-inositol, 0,05 g de ácido nicotínico, 0,05 g de cloridrato de piridoxina, 0,5 g de cloridrato de tiamina e 0,1 g de glicerina.</li>
		<li>Prepare o meio de crescimento, composto por 1/2 Murashige e Skoog médio, 1% sacarose, 1,6% ágar, 1x vitaminas, pH = 5,8. Autoclave e deixe esfriar.</li>
		<li>Em um banco estéril e limpo, esterilizar caixas plásticas articuladas (aproximadamente 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) imergindo em 70% de etanol por 15 min.</li>
		<li>Em um banco estéril e limpo, uma vez que o meio esteja em calor suportável, adicione N6-benziladenina a uma concentração final de 200 nM, e 1/1.000 PPM (mistura de conservantes vegetais) e misture bem. Encha as caixas estéreis a aproximadamente metade de sua profundidade com o meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissecção do SAM
<ol><li>Corte a inflorescência e remova os botões de flores mais velhos com fórceps afiados descascando as flores na base dos peduncles até que seja difícil vê-los a olho nu.</li>
	<li>Crie uma fenda na ágarose no prato de dissecação com fórceps e plante a base de inflorescência no ágar grosso. Isso dá um bom suporte sólido para uma dissecação mais fina de flores mais jovens para expor o SAM.</li>
	<li>Remova os botões de flores restantes empurrando-os para baixo com as fórceps começando com os estágios mais antigos e sequencialmente progredindo para os estágios mais jovens sob um microscópio dissecando até que o SAM seja visível. O SAM é geralmente exposto quando flores mais antigas até o estágio 6 a 7 são removidas. Uma vez que o SAM esteja exposto, evite a desidratação da amostra movendo-se rapidamente para o próximo passo.</li>
</ol>4. Transferência e crescimento de SAMs cultivados
<ol><li>Plante a amostra recém-dissecada como detalhada na seção 1 no meio de crescimento na caixa de cultura articulada de plástico retangular com o SAM apenas exposto acima da superfície média. Adicione algumas gotas de água deionizada estéril às bordas das caixas de cultura e feche a tampa para manter a umidade dentro da caixa. Certifique-se de que a água adicionada não cubra o SAM.</li>
	<li>Feche a tampa e enrole a caixa com fita micropora. Coloque a caixa de crescimento em condições diárias longas ou contínuas a 22 °C e cresça por 12-24 h para permitir que o SAM se recupere do procedimento de dissecção e se adapte às condições de cultura.</li>
</ol>5. Imagem do SAM
<ol><li>Encha a caixa de cultura contendo o SAM com água deionizada estéril para cobrir a amostra. Verifique sob o microscópio dissecando e remova quaisquer bolhas de ar pulverizando água direcionada à amostra com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Coloque a caixa de cultura em um estágio de microscópio confocal vertical. Tome cuidado para que a caixa de cultura não entre em contato com os objetivos do microscópio. Use uma lente de mergulho de água de longa distância 40x ou 60x de abertura numérica 0,8-1 que é ideal para imagens sem um copo de cobertura.</li>
	<li>Abaixe o objetivo na água e verifique se há bolhas de ar formadas na lente frontal do objetivo. Remova quaisquer bolhas baixando o palco e limpando suavemente a lente com um tecido óptico e adicionando uma pequena quantidade de água à lente frontal do objetivo com uma pipeta Pasteur antes de reimmersion na água.</li>
	<li>Utilizando o filtro GFP e o módulo de iluminação epi-iluminadora do microscópio confocal, ajuste o controlador XY para localizar a amostra. Ajustando a posição dos oculares, coloque o SAM diretamente sob a fonte de luz e concentre-se ao longo do eixo Z até que o ápice esteja localizado. NOTA: Não olhe diretamente para a luz ultravioleta.</li>
	<li>Uma vez que a amostra seja encontrada, ilumine-a usando um laser capaz de excitante GFP (ou seja, uma fonte laser de 488 nm ou 496 nm). Ajuste o zoom óptico do microscópio para que todo o SAM e o estágio 1 primordia floral estejam no campo de visão. Ajuste ainda mais a potência da saída do laser e obtenha configurações para garantir a relação sinal-ruído ideal. NOTA: A alta intensidade do laser resultará em branqueamento fotográfico da amostra. A paleta de subposição e superexposição ajuda a garantir um melhor ajuste dessas configurações.</li>
	<li>Deixe a amostra se acalmar por 2-5 minutos. Adquira pilhas Z confocal da amostra a intervalos de fatias Z de 0,25 μm-0,5 μm a uma resolução de aproximadamente 0,3 μm de tamanho de pixel. Certifique-se de que o tempo total de imagem necessário para a aquisição de pilhas Z para uma amostra não exceda 10 minutos a partir do momento em que a amostra é imersa em água até a conclusão da aquisição.</li>
	<li>Remova imediatamente a água e transfira a caixa de cultura de volta para a câmara de crescimento. Manter as amostras por muito tempo sob a água influenciará o estado osmótico das células.</li>
</ol>6. Perturbação micromecânica do SAM
<ol><li>Configure as condições de imagem conforme descrito na seção 5 e adquira pilhas de imagens de pré-ablação da organização de microtúbulos corticais.</li>
	<li>Decante a água no prato de cultura. Realize a ablação com uma agulha de seringa limpa (0,4 mm x 20 mm).<ol>
<li>Usando um microscópio dissecando, segure cuidadosamente a agulha e aproxime-se lentamente do SAM. NOTA: Segurar a respiração e manusear a agulha com uma pegada relaxada ajuda a evitar tremer.</li>
		<li>Entre em contato brevemente com a cúpula SAM com a ponta da agulha para confirmar que a ablação está feita. Preferencialmente realizar a ablação na periferia do SAM, o que permite visualização do comportamento e transição de microtúbulos corticais desorganizados na região central da cúpula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reabastecer o prato de cultura com água deionizada estéril e adicionar propidium idodide (10 μg/mL). Além de monitorar o sinal de microtúbulo cortical GFP, visualizar o iodeto propidium usando um canal separado pode marcar claramente regiões de células abladas. O iodeto de propidium é iluminado usando o laser de 561 nm ou qualquer outro laser adequado com emissão registrada entre 600-650 nm.</li>
	<li>Adquira pilhas de imagens logo após a ablação (ver seção 6) e repita o processo de aquisição a cada 2h por um período de 6h. Devolva o prato de cultura junto com a amostra na câmara de incubação após cada ponto de tempo. Certifique-se de que há um pouco de água sobrando na mídia da cultura e enrole o prato de cultura com fita micropora para evitar a profilação.</li>
</ol>7. Visualização e quantificação de dados
<ol><li>Gere projeções de superfície usando softwares livremente disponíveis, como MORPHOGRAPHX11,FIJI12ou macro SurfCut13.</li>
	<li>Realize a extração de anisotropia de microtúbula cortical usando fibrilTool14 macro em FIJI. NOTA: Protocolos detalhados para uso de software podem ser obtidos a partir das respectivas citações.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A avaliação dos eventos de transdução de sinal mecânico é crucial para identificar os reguladores moleculares envolvidos nas vias de mecano-percepção e transdução. O protocolo descrito aqui fornece uma visão quantitativa de tais eventos usando a resposta de microtúbulos corticais como leitura para tal processo em SAMs Arabidopsis. O procedimento descrito aqui é utilizado rotineiramente em diversos estudos em diversos tipos de tecidos16,17,<sup...

As células vegetais são cercadas por uma matriz extracelular de polissacarídeos e glicoproteínas que se assemelha mecanicamente a um material composto reforçado com fibra capaz de mudar dinamicamente suas propriedades mecânicas1. O crescimento das células vegetais é impulsionado pela absorção de água na célula, o que resulta em um acúmulo concomitante de forças de tração na parede celular. Em resposta a tais forças, modificações no estado físico da parede celular permitem a expansão celular. As células com paredes primárias são capazes de sofrer um rápido crescimento em comparação com a parede celular secundária contendo células principalmente devido a diferenças na composição química dos polissacarídeos dentro. As células de parede primárias são compostas de celulose, hemicellulose e pectina, além de glicoproteínas, e falta de lignina, componente presente na parede celular secundária2. A celulose, um polímero de glicose ligado através de β-1,4 ligações, é o principal componente das paredes celulares. É organizado em estruturas fibrilares capazes de suportar altas forças de tração experimentadas durante o crescimento celular3. Além de resistir às forças de tração, o reforço mecânico ao longo de uma direção preferencial resulta em expansão orientada por turgor ao longo de um eixo perpendicular à orientação líquida do microfibril de celulose. A organização dos microfibrilas de celulose é influenciada pelo citoesqueleto de microtubulos cortical, pois orientam o movimento direcional dos complexos de celulose-sintetizadores localizados na membrana plasmática4. Portanto, monitorar a organização de microtúbulos corticais usando uma proteína associada a microtúbulos ou tubulina fundida com uma molécula fluorescente serve como proxy para a observação de padrões de sobrepesca de celulose em células vegetais.
A padronização do citoesqueleto de microtúbulos cortical está sob o controle de forças mecânicas derivadas da morfologia celular e tecidual. A organização de microtúbulos corticais não possui nenhuma organização preferencial ao longo do tempo em células localizadas no ápice do SAM, enquanto as células da periferia e a fronteira entre o SAM e o órgão emergente possuem uma matriz supracelular estável e altamente organizada de microtúbulos corticais5. Várias abordagens foram desenvolvidas para perturbar fisicamente o estado mecânico das células. Alterações no estado osmótico, bem como tratamento com compostos farmacológicos e enzimáticos que influenciam a rigidez da parede celular podem resultar em alterações subsequentes nas forças de tração experimentadas pela célula6,7. O uso de engenhocas que permitem o aumento gradual das forças compressivas experimentadas pelos tecidos é outra alternativa8. A aplicação de forças centrífugas também tem sido demonstrada para influenciar as forças mecânicas sem qualquer contato físico com as células9. No entanto, os meios mais amplamente utilizados de mudança de forças direcionais em um grupo de células se aproveitam do fato de que todas as células epidérmicas estão sob tensão e a ablação física das células eliminará a pressão de turgor localmente, bem como interromperá a adesão célula-celular, modificando assim as forças de tração experimentadas pelas células vizinhas. Isto é realizado tanto visando um laser ultravioleta pulsado de alta potência ou por meio de uma agulha fina.
Aqui elaboramos sobre o processo de imagem e avaliação do comportamento de microtúbulos corticais para perturbação mecânica no SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>fita micropore</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Métodos Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>mio-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benziladenina</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>ácido nicotínico</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>caixa articulada de plástico</td><td>Ciências de microscopia eletrônica</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Mistura de Conservantes de Plantas)</td><td>Tecnologia de Células Vegetais</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de piridoxina</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>cloridrato de tiamina</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da arabidopsis shoot apical meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

A compreensão da regulação do nível celular e tecidual do crescimento e da morfogênese está na vanguarda da pesquisa biológica há muitas décadas. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter insights sobre como os sinais bioquímicos influenciam eventos morfogenéticos. No entanto, é cada vez mais evidente que, além dos sinais bioquímicos, as pistas mecânicas também impactam vários aspectos do crescimento celular e tecidual. A Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) é uma estrutura em forma de cúpula responsável pela geração de todos os órgãos acima do solo. A organização do citoesqueleto de microtúbulo cortical que media a deposição de celulose apoplásica em células vegetais é espacialmente distinta. A visualização e a avaliação quantitativa dos padrões dos microtúbulos corticais são necessárias para entender a natureza biofísica das células no SAM, já que a celulose é o componente mais rígido da parede celular da planta. A forma estereotipada da organização dos microtúbulos cortical também é uma consequência das forças físicas em todo o tecido existentes no SAM. A perturbação dessas forças físicas e o monitoramento subsequente da organização de microtúbulos corticais permitem a identificação de proteínas candidatas envolvidas na mediação da mecano-percepção e transdução. Aqui descrevemos um protocolo que ajuda a investigar tais processos.

A Figura 1 mostra imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas MBD-GFP com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, e células na periferia com uma distribuição circunferencial(Figura 1A,B),enquanto as células de domínio de fronteira contêm microtúbulos corticais alinhados paralelos ao eixo longo da célula. Estas observações mostram diferenças na distribuição espacial d...

Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Este protocolo nos ajuda a entender como o comportamento do Citoesqueleto microtúbulo ocorre nas plantas. Ao mesmo tempo, também nos ajuda a entender como esses componentes estruturais que influenciam a forma celular e do órgão, respondem a mudanças nas forças mecânicas. Embora, este método exija pouca sofisticação, fornece leitura robusta e quantitativa, as diferenças de resposta mecânica entre diferentes genótipos e condições.Comece cultivando sementes arabidopsis expressando domínios de ligação de microtúbulos fundidos com proteína fluorescente verde no solo, a 20 e 6 graus Celsius em condições de longo dia por uma semana. Após a germinação, transfira as mudas para novos vasos com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto, e coloque as plantas em 20 e 16 graus Celsius em condições de curto dia. Após três a cinco semanas, transfira as plantas de volta para condições de longos dias na mesma temperatura até que as plantas fugiam, permitindo que a inflorescência cresça até dois a cinco centímetros de comprimento.Para shoot apical meristem dissection, coloque a inflorescência, e use fórceps afiados para descascar as flores na base dos peduncles, até que seja difícil ver os peduncles a olho nu para remover os botões de flores mais velhos. Use os fórceps para criar uma fenda no agros em um prato de dissecação, e plante a base de inflorescência na grossa Augur. Coloque o prato sob um microscópio dissecando.Começando com o broto de flor mais antigo, empurre com as fórceps para remover o broto de flor da planta. O meristem apical de tiro é geralmente exposto quando flores mais antigas até o estágio seis a sete são removidas. E use as fórceps para empurrar cada broto de flor para baixo até que o meristem apical de tiro seja visível.Assim que o meristem apical de tiro é exposto, deixe a amostra recém-dissecada em meio de crescimento em uma caixa de cultura articulada de plástico retangular esterilizada por etanol com o meristem apical de tiro apenas exposto acima da superfície média. Adicione algumas gotas de água deionizada estéril às bordas da caixa de cultura e feche a tampa para manter a umidade dentro da caixa. Enrole a caixa com fita micropora e coloque a caixa de crescimento em condições diárias longas ou contínuas a 22 graus Celsius por 12 a 24 horas.Quando a planta se recuperar do procedimento de dissecção, cubra a amostra com água deionizada estéril e verifique se há bolhas de ar sob o microscópio dissecador. Transfira a caixa de cultura para um estágio de microscópio confocal vertical e selecione a lente de mergulho de água de 40 ou 60X. Abaixe o objetivo na água e verifique se há bolhas de ar na lente frontal do objeto.Para remover bolhas, abaixe o palco e limpe suavemente a lente com um tecido óptico. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para adicionar um pequeno volume de água à lente frontal do objetivo antes de remermergar a lente na água. Em seguida, use o filtro GFP e o módulo de iluminação epi-iluminadora do microscópio confocal para ajustar o controlador XY para localizar a amostra.Ajustando a posição dos oculares, posicione o meristem apical de tiro diretamente sob a fonte de luz e concentre-se ao longo do eixo Z até que o ápice esteja localizado. Use um laser capaz de estimular o GFP para iluminar a amostra, e ajustar o zoom óptico do microscópio, de modo que toda a filmagem apical meristem e o estágio um primordia floral estão no campo de visão. Em seguida, ajuste a potência da saída do laser e as configurações de ganho para obter uma relação de sinal para ruído ideal.Depois de permitir que a amostra se contente por dois a cinco minutos, adquira pilhas Z confocal da amostra em intervalos de fatias Z de 0,25 a 0,5 micrômetros, adicionando aproximadamente 0,3 m de resolução de tamanho de pixel. Ao final da aquisição, remova imediatamente a água e transfira a caixa de cultura de volta para a câmara de crescimento. Para a Micromecânica Shoot Apical Meristem Perturbation, adquira pilhas de imagens pré-ablação da organização de microtúbulos corticais como apenas demonstrado, e descafete a água da caixa de cultura em um prato de cultura.Transfira o meristem apical de tiro sob um microscópio dissecando, e lentamente se aproximou do meristem apical de tiro com uma agulha de seringa limpa de 0,4 por 20 milímetros. Entre em contato brevemente com a periferia da cúpula do meristem apical com a ponta da agulha para confirmar que a ablação foi concluída. E reabastecer o prato de cultura com água deionizada estéril.Em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de iodeto de propidium ao prato e imediatamente adquira pilhas de imagem como demonstrado a cada duas horas por seis horas, devolvendo o prato de cultura à incubação entre cada ponto de tempo. Para análise de dados, gere projeções superficiais das pilhas de imagens usando um programa de software de análise de imagem apropriado e realize a extração da anisotropia de microtúbulos corticais usando a Macro da Ferramenta Fibril em Fiji. Aqui, imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas GFP de domínio de ligação microtúbula com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, células na periferia, tendo uma distribuição circunferencial e células de domínio de fronteira contendo microtúbulos corticais alinhados paralelamente ao eixo longo da célula podem ser observados.Imagens de lapso de tempo mostram o alinhamento do microtúbulo cortical mudando de uma matriz altamente desordenada para uma matriz mais organizada dentro de seis horas de ablação. Tensores podem ser sobrepostos às imagens de microtúbulos corticais, e as informações extraídas podem ser representadas plotando a anisotropia média ao longo do tempo. Ao ajustar a potência de saída do laser e obter configurações, devemos garantir uma observação clara dos filamentos e tentar evitar a superexposição, pois sinais sobre saturados poderiam distorcer a direção da tração em análise posterior.A microscopia de força atômica também pode ser realizada para avaliar como as mudanças nas forças mecânicas realmente afetam o estado físico da parede celular.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Sinalização de Ca2 + regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal 2 + sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.

Medindo espacial e temporal Ca 2 + Sinais em Arabidopsis Plantas

imagem confocal ao vivo fornece biólogos com uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a imagem confocal ao vivo de desenvolver flores Arabidopsis.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Nós relatamos um método simples e versátil para executar ao vivo-imagem fluorescente de Arabidopsis thaliana folhas durante um período prolongado de tempo. Nós usamos uma Arabidopsis de plantas transgênicas expressando um gene repórter fluorescente sob o controle de um promotor de imunidade-relacionados como um exemplo para ganhar spatiotemporal compreensão das respostas imunes de planta.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Aqui, descrevemos um aprimoramento do método semi-in vitro (SIV) para observação da orientação e recepção do tubo polínico em Arabidopsis thaliana, que aumenta a receptividade dos óvulos. O método SIV cum septum de alto rendimento pode ser acoplado a linhagens de marcadores gametófitos e biossensores codificados geneticamente para monitorar o processo dinâmico de fertilização.

Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum

Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

O movimento cromossômico durante a prófase meiótica é um fenômeno pouco compreendido que é fundamental para a formação de esporos. Este protocolo descreve um método para adquirir, analisar e quantificar os movimentos do centrômero durante a prófase meiótica em meiócitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

Esse processo utiliza microscopia confocal em conjunto com um núcleo e linha marcadora de cromatina marcados fluorescentemente em Arabidopsis thaliana para registrar simultaneamente a dinâmica do núcleo e da cromatina nas raízes de Arabidopsis e investigar mudanças nessas dinâmicas em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.

Imagem quantitativa de células vivas da forma nuclear e dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento e estresse ambiental na raiz de Arabidopsis thaliana

Aprenda a imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubular no meristema apical caulinar de Arabidopsis e sua resposta a forças mecânicas. Este método quantitativo permite analisar diferenças entre genótipos.

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Explorar mais vídeos