Isolamento de Cardiomiócitos de Corações Fixos para Imunocitoquímica e Análise ploidy

Este protocolo fornece um método para isolar cardiomiócitos em forma de vara de qualquer tecido cardíaco, que pode então ser usado para medir o estado ploidy e nucleação desses cardiomiócitos sem análise manual. Em comparação com outras técnicas, nosso protocolo fornece rendimentos celulares mais consistentes e morfologia celular, e ao contrário da citometria de fluxo, somos capazes de verificar visualmente o estado de nucleação e ploidy de cardiomiócitos. A demonstração visual desse método é importante porque a divisão e associação de tecidos cardíacos é mais fácil de apreciar.

Comece colocando o rato eutanizado em uma posição supina, e gravando os membros estendidos. Use uma tesoura de cabeça dura para cortar o peito para expor o coração. Em seguida, corte a aorta descendente e a veia cava inferial.

Use uma bomba peristáltica presa a um conjunto de infusão com uma agulha de borboleta calibre 23 para perfumar o coração injetando três mililitros de solução PBS de cloreto de potássio através do ventrículo esquerdo. Certifique-se de não perfurar o septo. Em seguida, injete 10 mililitros de solução 4%PFA por 10 minutos a uma taxa de um mililitro por minuto.

Use uma tesoura para remover todo o coração. E se desejar, isole uma região específica. Coloque o tecido em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de solução 4%PFA.

Incubar em um roqueiro por uma hora. Coloque o coração em uma placa de petri com solução PBS. Aperte-o para se livrar de qualquer PFA restante nos ventrículos e lave-o em PBS.

Coloque o coração fixo em um novo tubo de 1,5 mililitro contendo solução de colagem. Em seguida, incubar o coração em um roqueiro a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, coloque o coração em uma placa de Petri de 35 milímetros contendo solução colagem, e dissociá-lo em pedaços de um milímetro com fórceps ou tesouras.

Em seguida, use uma pipeta de transferência para triturar ainda mais o tecido dissociado por dois minutos. Se as partículas de tecido ainda permanecerem, use uma pipeta com uma ponta mais estreita e continue triturando até que a maioria do tecido seja quebrada. Coloque uma malha de nylon de 200 a 600 micrômetros sobre um tubo de centrífugas de 15 milímetros.

Adicione cinco mililitros de PBS às células dissociadas e filtre-as através da malha de nylon. Lave a malha de nylon passando mais quatro mililitros de PBS. Em seguida, centrifufique a solução filtrada a 10 a 100 vezes G por um minuto.

Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 10 mililitros de PBS antes da coloração. Depois de baixar a distribuição Fiji da imagem J, abra Fiji e clique em ajuda, atualize e gerencie sites de atualização. Verifique o grupo biomed e os plugins do IFPB.

Para baixar os plugins de dependências, a elipse split e a morpho lib J.Então clique em fechar e aplicar alterações. Em seguida, baixe RStudio e abra-o. Copie o código do manuscrito de texto na linha de comando da RConsole e pressione enter.

em seguida, digite Y em resposta a todas as solicitações para instalar todas as nossas dependências. Para realizar a quantificação da imagem, abra Fiji e arraste anucleação. py para a barra de status.

Quando a janela de edição do script for aberta, clique em executar no canto inferior esquerdo. Uma caixa de diálogo aparecerá pedindo a localização do diretório de dados de saída. Selecione a pasta onde todos os dados de análise, números e outros dados usados pelo software serão armazenados.

Nos parâmetros de análise, selecione a localização das imagens a serem analisadas e insira o formato de nome do arquivo de imagem usando expressões regulares. Depois de selecionar as configurações desejadas, clique em OK. À medida que imagens de diferentes estágios do pipeline de análise aparecem na tela, inspecione-as para ter certeza de que o limiar e a segmentação estão ocorrendo corretamente. Análise aberta do servidor multinucleado.

r em Rstudio. Em seguida, para a variável nome da pasta nomeada, digite o caminho do arquivo para a pasta de dados de saída selecionada na última etapa sem a barra final. Clique em executar aplicativo no canto superior esquerdo da janela de edição do script.

Use os controles deslizantes para definir limites para o limiar mínimo de intensidade média nuclear válido, o limiar mínimo válido da área nuclear e o diâmetro mínimo máximo válido dos furões para cardiomiócitos. Role para baixo e clique em aplicar limiares selecionados e clique na distribuição da intensidade do enredo, que renderizará um gráfico da distribuição da intensidade do núcleo de toda a amostra, bem como subtramas separadas para cada variável de agrupamento. Para explicar a variação intrasample, role para baixo e verifique normalizar separadamente por grupo, em seguida, clique em calcular a ploidy e plot estimada distribuição ploidy.

Uma vez que o gráfico de amostra total normalizado apareça, os dois padrões de pico devem ser visíveis. Use os controles deslizantes e selecione limiares para isolar os picos diploides e tetraploides uns dos outros e outliers. Em seguida, role para baixo e clique em calcular ploidy e nucleação.

Por fim, clique no gráfico do botão e salve na pasta de resultados. Este método pode ser usado para isolar cardiomiócitos uniformemente singularizados que são relativamente puros sem contaminar células. É fácil de implementar e fornece rendimentos de cardiomiócitos consistentes e qualidade de diferentes isolamentos.

Cardiomiócitos isolados com este protocolo podem ser manchados usando anticorpos e azides conjugados fluorocromo. Para mostrar o padrão característico de coloração da linha Z dos sarcomeres, as células estavam manchadas com anticorpos reconhecendo a actinina alfa. Em um experimento separado, EdU foi administrado em camundongos antes de isolar cardiomiócitos fixos.

Após o isolamento, foram detectados os cardiomiócitos mononucleados, binucleados e trinucleados que haviam sido submetidos à fase S. Para identificar núcleos individuais, a imagem manchada de DNA original foi limiar baseada na intensidade. Elipses eram adequadas às máscaras nucleares, segmentando núcleos individuais.

Em seguida, os pixels da imagem foram divididos em territórios baseados na elipse à qual eles são mais proximais, e as fronteiras desses territórios foram usadas para desenhar linhas através de aglomerados nucleares. Um processo de segmentação semelhante foi utilizado para detectar cardiomiócitos. Essa estratégia de segmentação mostrou que a maioria dos cardiomiócitos de camundongos recém-nascidos são mononucleados.

A frequência de cardiomiócitos mononucleados é muito menor em camundongos de duas semanas, onde eles compõem cerca de 25% da população total de cardiomiócitos. Quando o estado ploidy de núcleos individuais dentro de cardiomiócitos foi medido, uma maior frequência de núcleos tetraploides foi detectada em camundongos juvenis. Ao isolar os cardiomiócitos, é importante verificar se todas as células se separaram de sua trituração.