Identificação de campo de matricaria chamomilla usando um sistema portátil qPCR

A prática de usar botânicos para melhorar a saúde remonta a milhares de anos. Recentemente, o aumento da demanda, juntamente com práticas de colheita insustentáveis e mudanças climáticas, colocou um estresse na cadeia de suprimentos. Por causa disso, a adulteração botânica está se tornando uma preocupação crescente, tornando a identificação botânica uma parte cada vez mais essencial do controle de qualidade.

Idealmente, a identificação é realizada o mais próximo possível da fonte, para que os recursos possam ser alocados eficientemente no material de identidade correta. Há uma série de abordagens para identificação botânica. Tradicionalmente, a identificação botânica é realizada por meio de avaliação morfológica e métodos analíticos químicos.

A identificação morfológica baseia-se em diferenças nas características macroscópicas e microscópicas dos materiais vegetais. No entanto, requer um botânico bem treinado e sua aplicação a materiais botânicos em pó é limitada. Métodos analíticas químicas são amplamente utilizados em farmacocopoeias e laboratórios, mas não são ideais para testes de campo devido ao tamanho dos instrumentos e requisitos ambientais.

Recentemente, métodos genômicos surgiram como uma técnica alternativa para identificação de espécies botânicas devido à alta fidelidade e especificidade das informações genômicas em materiais vegetais. Com ferramentas de diagnóstico molecular agora disponíveis em uma forma de dispositivos portáteis, essa abordagem torna-se possível para a aplicação em campo. O objetivo deste protocolo é introduzir um método de identificação botânica em situações em que o acesso aos equipamentos e conhecimentos laboratoriais é limitado, como a fazenda que fornece o material botânico, utilizando um sistema portátil qPCR.

A matricaria chamomilla, comumente conhecida como camomila alemã, tem sido usada como um medicamento à base de plantas para promover a saúde há séculos. Para demonstrar a especificidade do método atual, a diferenciação da camomila alemã de outra flor de camomila comumente utilizada, conhecida como camomila romana, está incluída para comparação. O procedimento de identificação de campo é demonstrado no meio de uma fazenda de camomila alemã.

Configure uma área de teste no campo com uma superfície plana e horizontal. Identifique uma planta representativa que reflita as características da maioria das plantas no campo das flores de camomila. Escolha uma cabeça de flor da planta representativa usando luvas estéreis.

Coloque a amostra em um tubo de coleta de 2,0 mililitros. Repita e colete um folheto de aproximadamente 0,5 a 0,7 centímetros de comprimento da mesma planta. Pré-aqueça a incubadora de banho seco a 95 graus Celsius.

A cada tubo de coleta, adicione 100 microliters da solução de extração do kit de extração de DNA da planta. Para melhor eficiência de extração de DNA, triture a amostra usando um pilão tecidual. Feche o tubo.

Certifique-se de que o tecido botânico esteja coberto pela solução de extração durante todo o processo de extração. Coloque os tubos de coleta em uma incubadora de banho seco pré-aquecido e incubar os tubos de coleta a 95 graus Celsius por 10 minutos Após 10 minutos, tire os tubos da incubadora de banho seco. Adicione 100 microliters da solução de diluição do kit de extração de DNA e misture a solução pipetando para cima e para baixo várias vezes.

Repita o mesmo passo para extração de folhetos. Agite para misturar ainda mais a solução. A questão da planta geralmente não parece estar degradada após este tratamento.

A cor líquida pode mudar e ficar nublada. Configure as condições de termociclismo do instrumento qPCR de acordo com a tabela um, que começa com um passo de temperatura constante para a desnaturação inicial, seguido por 25 ciclos de amplificação e termina com rampa de temperatura para obter uma curva de fusão de alta resolução. Descongele a mistura mestre qPCR e primers listados na tabela dois à temperatura ambiente antes do uso.

Planeje a reação que será carregada em cada poço. Poços contendo controles positivos com as espécies-alvo, controles positivos com espécies não-alvo, amostras e controles negativos. Neste exemplo, são utilizados 10 poços, cinco para o teste alemão de identificação de camomila e outros cinco para o teste de identificação de camomila romana.

Para cada tipo de teste de identificação de espécies, um poço contém um controle positivo com DNA extraído do material de referência da espécie alvo, um poço contém um controle positivo com DNA extraído de material de referência de espécies não-direcionadas, dois poços são preenchidos com amostras de DNA de flores e folhas extraídas do campo, e um poço é alocado para um controle negativo. A tabela três descreve cada tipo de poço. Prepare uma mistura mestre de reação de acordo com a tabela quatro para cada teste de identificação de espécies botânicas.

Uma mistura mestra de reação típica contém mistura mestra qPCR universal, duas vezes, primers específicos de espécies para a frente e reversa, e água sem nuclease. Misture bem a mistura mestre de reação por pipetação antes de usar. Coloque o cartucho de reação PCR voltado para cima em uma superfície plana e estável.

Carregar 18 microliters do mix mestre de reação configurado na etapa anterior nos poços do cartucho de acordo com os poços definidos aqui. Para esta demonstração, adicione a mistura mestre de reação de teste de identificação de camomila alemã em poços rotulados para teste GC, GCT em poços um, três, cinco, sete, nove, e a mistura mestre de reação de teste de camomila romana em poços rotulados para teste RC, RCT em poços dois, quatro, seis, oito, 10. Transfira dois microliters de DNA amostral do supernaente dos tubos de extração de DNA e controles positivos de DNA pré-extraídos em poços de cartuchos pré-carregados com mistura mestre qPCR.

Depois de adicionar cada modelo de DNA à mistura mestre qPCR, misture suavemente a solução por pipetação. Sele cuidadosamente o cartucho com filme adesivo. Coloque o cartucho na câmara de termociclismo e feche-o.

Defina o instrumento qPCR para executar. No protocolo atual, o corante intercalante é usado para medir a amplificação de fragmentos de destino em tempo real. O valor ct é definido como o número de ciclos necessários para o sinal fluorescente cruzar o limiar predefinido.

Um valor de Tomografia inferior a 25 ciclos foi considerado como amplificação positiva. Nesta figura, o controle positivo romano só foi amplificado no teste de identificação de camomila romana, mas não no teste de identificação de camomila alemã. O controle positivo da camomila alemã e as amostras de campo só foram amplificadas no teste alemão de identificação de camomila, mas não no teste de identificação de camomila romana.

O controle negativo não foi amplificado em nenhum dos testes. Para confirmar ainda mais a amplificação específica em controles e amostras positivas, frações de PCR e produtos de cada poço foram executados em gel de 2%agarose em laboratório. Todos os poços com um valor ct inferior a 25 renderam amplicons em seus tamanhos esperados, que diferem entre camomila alemã e camomila romana.

As demais faixas não apresentaram produto de amplificação específico, de acordo com a ausência de sinal fluorescente para esses poços, como observado em testes de campo. Após a amplificação do PCR, foi realizada uma análise de curva de fusão utilizando-se o mesmo software utilizado para monitorar o sinal fluorescente. Com o aumento da temperatura, os amplicons de dois fios começam a se dissociar, resultando na diminuição da intensidade da fluorescência.

As mudanças de intensidade de fluorescência foram ainda convertidas em curvas de pico de fusão para maior diferenciação da camomila alemã da camomila romana por seus picos característicos de fusão. Nesta figura, o pico de fusão do controle positivo da camomila alemã é de 85,6 graus Celsius e é distinto do pico de fusão do controle positivo da camomila romana. Os amplificadores PCR de amostras de campo produzem picos de fusão próximos ao controle positivo da camomila alemã.

A identidade da amostra de campo é determinada com base em amplificação específica e temperatura de fusão característica que corresponde aos controles. Neste exemplo, tanto a flor quanto a folha coletadas no campo são identificadas como Matricaria camomila, camomila alemã. Os resultados dos testes de camomila romana para estas duas amostras são negativos.

O protocolo demonstra a identificação da camomila alemã no campo usando um sistema portátil qPCR. Métodos semelhantes podemos desenvolver para expandir o portfólio de botânicos que podem ser testados. Esperamos que este vídeo forneça materiais de treinamento valiosos para cientistas, mesmo não especialistas, para realizar a identificação botânica no campo ou em um ambiente com equipamentos de laboratório limitados.

Testes de identificação de campo baseados em DNA não só produzem resultados altamente precisos que correspondem à análise laboratorial, mas também reduzem o tempo e os custos associados aos métodos tradicionais realizados em laboratório.