Name: Usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Aprenda a avaliar a qualidade de enxertos renais com biópsia química usando sondas SPME e análises metabolômicas e lipidômicas por LCMS. Este método minimamente invasivo permite monitorar alterações teciduais em tempo real.

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O estudo foi apoiado pela bolsa Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 do Centro Nacional de Ciências. Os autores gostariam de reconhecer a MilliporeSigma, um negócio da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha, para fornecer dispositivos SPME. O negócio de ciências da vida da Merck opera como MilliporeSigma nos EUA e Canadá. Além disso, os autores querem agradecer à Thermo Fisher Scientific pelo acesso ao espectrômetro de massa Q-Exactive Focus orbitrap. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Aleksandra Woderska-Jasińska e ao pessoal do Departamento de Transplantologia e Cirurgia Geral em Bydgoszcz por sua gentil assistência no projeto. BB quer agradecer ao Prof. Janusz Pawliszyn pela oportunidade de coleta de amostras no Hospital Geral de Toronto durante sua estadia na Universidade de Waterloo.

Todos os animais receberam cuidados humanos em conformidade com os ''Princípios do Cuidado Animal Laboratorial'' formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e o ''Guia para o Cuidado de Animais de Laboratório'' publicado pelo Instituto Nacional de Saúde, Ontário, Canadá. O Comitê de Cuidados Com Animais do Instituto Geral de Pesquisa de Toronto aprovou todos os estudos. A pesquisa envolveu sujeitos humanos foi aprovada pelo Comitê Bioético da Collegium Medicum na Universidade Bydgoszcz Nicolaus Copernicus, em Torun.
NOTA: Obtenha aprovação de conselhos éticos adequados. Lembre-se de sempre usar luvas de segurança. Não toque na fase de extração das sondas SPME. Recomenda-se o uso de frascos de vidro desativados para análises lipidômicas.
1. Preparação de sondas
<ol><li>Prepare as sondas de liga de titânio-níquel (40 mm de comprimento; 0,2 mm de diâmetro) revestidas com sorbent modo de mistura de 7 mm. O número de sondas depende dos pontos de tempo direcionados durante todo o procedimento e do número de réplicas (3 é recomendado por ponto de tempo). NOTA: O comprimento e o tipo de fase de extração podem ser ajustados com base no modo de estudo, na polaridade dos metabólitos e na matriz amostral.</li>
	<li>Prepare uma mistura de limpeza composta de clorofórmio 2:1:metanol (v/v). Pipet 1.0 mL da solução para cada frasco de vidro de 2,0 mL e coloque uma sonda, previamente perfurada através da tampa, em cada frasco. NOTA: Antes de usar, limpe todas as sondas para remover partículas contaminantes.</li>
	<li>Coloque os frascos no agitador e afina a velocidade de agitação a 1.200 rpm. Depois de 45 min, pare o dispositivo e enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS.</li>
	<li>Como os revestimentos devem passar por uma etapa pré-condicionamento para ativá-los, prepare uma mistura pré-condicionamento composta de 1:1 metanol:água (v/v). Pipet 1.0 mL da solução para cada frasco de vidro de 2,0 mL e coloque uma sonda, previamente perfurada através da tampa, em cada frasco.</li>
	<li>Coloque os frascos no agitador do vórtice e afina a velocidade de agitação a 1.200 rpm.</li>
	<li>Depois de 60 min, pare o agitador e enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS.</li>
	<li>Esterilizar sondas de acordo com o protocolo padrão de esterilização do equipamento cirúrgico.</li>
</ol>2. Extração
<ol><li>Abra o pacote estéril antes da amostragem para garantir um ambiente estéril.</li>
	<li>Insira duas sondas diretamente no córtex renal por 10 minutos em cada ponto de tempo. Toda a extensão do revestimento deve ser coberta pela matriz tecidual; nenhum ângulo específico é necessário, mas cerca de 90 deg é geralmente usado. NOTA: Todo o procedimento médico segue protocolos padrão em determinada instituição. Não se considera nenhuma modificação em relação à amostragem de SPME. O procedimento envolve os seis seguintes pontos de tempo de amostragem: a) antes da ressecção renal, in vivo do doador; b)-e) após 1h, 3h, 5h, 7h de perfusão renal, ex vivo na câmara de órgãos; f) após a reperfusão, in vivo do destinatário.</li>
	<li>Retire as sondas retirando-as do tecido e enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS para limpar qualquer sangue restante da superfície do revestimento. Enxágüe para longe do local cirúrgico e imediatamente após a remoção das sondas.</li>
</ol>3. Transporte e armazenamento
<ol><li>Coloque sondas em frascos separados e feche-os.</li>
	<li>Coloque frascos em uma caixa de isopor cheia de gelo seco ou em nitrogênio líquido para transporte.</li>
	<li>Armazene amostras em um congelador (-80 °C) ou inicie imediatamente a etapa de desorção.</li>
</ol>4. Desorção
<ol><li>Prepare soluções de desabedação compostas de acetonitrilo 80:20:água (v/v) para análise metabolômica e 1:1 isopropanol:metanol (v/v) para análise lipidóica.</li>
	<li>Pipet 100 μL da solução para inserções colocadas em frascos rotulados de 2,0 mL e coloque uma sonda, previamente perfurada através da tampa, em cada frasco.</li>
	<li>Coloque os frascos no agitador do vórtice e afina a velocidade de agitação em 1.200 rpm por 120 min.</li>
	<li>Remova as sondas dos frascos. Os extratos obtidos estão agora prontos para análise instrumental.</li>
</ol>5. Análise LC-MS
<ol><li>Coloque frascos contendo extratos no autosampler do sistema LC-MS. NOTA: Cromatografia líquida (RP, HILIC) juntamente com espectrometria de massa de alta resolução e um analisador de massa orbitrap foram utilizados para este estudo. Para parâmetros de análise metabolômica, vá para a etapa 5.2. Para parâmetros de análise lipidódica, vá para a etapa 5.6.</li>
	<li>Use uma coluna pentafluorofenil (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) para separação de fase invertida.<ol>
<li>Defina a vazão para 300 μL/min, e as temperaturas do autosampler e coluna para 4 °C e 25 °C, respectivamente.</li>
		<li>Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: água:ácido fórmico (99.9:0.1, v/v) e fase móvel B: acetonitrilo:ácido fórmico (99.9:0.1, v/v). Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: fluxo de fase móvel inicial (0-3 min): 100% A seguido de um gradiente linear para 10% A (3-25 min), terminando com fluxo isocrático de 10% A até 34 min, seguido por 6 minutos de tempo de ree equilíbrio da coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para separação HILIC, utilize uma coluna HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Defina a vazão para 400 μL/min.<ol>
<li>Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: acetonitrilo:tampão de acetato de amônio (9:1, v/v, concentração de sal eficaz 20 mM), fase móvel B: acetonitrilo:tampão de acetato de amônio (1:1, v/v, concentração efetiva de sal 20 mM).</li>
		<li>Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: iniciar o fluxo de fase móvel (0-3 min) a 100% A, segurar por 3,0 min e depois rampa para 100% B dentro de 5 min. Segure-se com 100% B até 12 min, seguido por 8 min de tempo de ree equilíbrio da coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina o intervalo de varredura para 85-1000 m/z. Defina parâmetros de origem de íons HESI no modo de ionização positiva para: tensão de pulverização 1.500 V, temperatura capilar 300 °C, gás de bainha 40 a.u., taxa de fluxo de gás aux 15 a.u., temperatura do aquecedor da sonda 300 °C, nível RF S-Lens 55%.</li>
	<li>Execute amostras de QC compostas de 10 μL de cada amostra analisada (regularmente, a cada 10-12 amostras) para monitorar o desempenho do instrumento.</li>
	<li>Para separação de fase invertida, utilize uma coluna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).<ol>
<li>Defina a vazão para 200 μL/min, e temperaturas de autosampler e coluna para 4 °C e 55 °C, respectivamente. Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: H2O:MeOH (60:40, v/v), acetato de amônio de 10 mM e ácido acético de 1 mM; fase B móvel: IPA:MeOH (90:10, v/v), acetato de amônio de 10 mM e ácido acético de 1 mM.</li>
		<li>Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,7 5-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para separação HILIC, utilize uma coluna HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).<ol>
<li>Defina a vazão para 400 μL/min, e as temperaturas do autosampler e coluna para 4 °C e 40 °C, respectivamente.</li>
		<li>Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: ACN; fase B móvel: acetato de amônio de 5 mM na água. Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina parâmetros de origem de íons HESI no modo de ionização positiva para pulverizar tensão 3.500 V, temperatura capilar 275 °C, gás bainha 20 a.u., taxa de fluxo de gás aux 10 a.u., temperatura do aquecedor da sonda 300 °C, nível RF S-Lens 55%.</li>
	<li>Execute amostras de QC compostas de 10 μL de cada amostra analisada (cada 10-12 amostras) para monitorar o desempenho do instrumento.</li>
	<li>Realizar aquisição de dados em software compatível com o instrumento.</li>
</ol>6. Análise de dados
<ol><li>Realizar o processamento de dados, identificação putativa e análise estatística com o uso de software dedicado à análise de metabolômica e lipódica não-alvo. NOTA: A análise dos componentes principais (PCA) e as parcelas do batedor de caixa podem ser obtidas para visualizar a estrutura de dados.</li>
</ol>

<ol><li>U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019).</li>
<li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranger%2C+P+%22Annual+Report+2018%2FEurotransplant+International+Foundation%22">Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation</a>. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).</li>
<li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney%3A+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li>
<li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+comparing+DCD+and+DBD+liver+allografts+uncovers+lysophospholipids+elevated+in+recipients+undergoing+early+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction.</a> Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lipid+changes+in+acute+kidney+injury+using+SWATH+lipidomics+coupled+with+MALDI+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolomics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li>
<li>Filipiak, W., Bojko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPME+in+clinical%2C+pharmaceutical%2C+and+biotechnological+research+-+How+far+are+we+from+daily+practice%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+-+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+invasive+in+vivo+tissue+sampling+for+monitoring+biomarkers+and+drugs+during+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery.</a> Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).</li>
<li>Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+of+the+transplanted+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Interventional+Radiology%22%5BJournal%5D)">Biopsy of the transplanted kidney.</a> Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).</li>
<li>Plattner, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+and+adequacy+of+transplant+kidney+biopsies%3A+A+comparison+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Access%22%5BJournal%5D)">Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques.</a> Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).</li>
<li>Tapia-Canelas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+associated+with+renal+graft+biopsy+in+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nefrologia%22%5BJournal%5D)">Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients.</a> Nefrologia. 34, 115-119 (2014).</li>
<li>Afshinnia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+and+Biomarker+Discovery+in+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease.</a> Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).</li>
<li>Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+New+insight+into+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: New insight into kidney disease.</a> Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).</li>
<li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li>
<li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li>
<li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li>
<li>Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+approaches+for+the+diagnosis+and+understanding+of+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases.</a> Metabolites. 9, (2019).</li>
<li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li>
<li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry%3A+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li>
<li>Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+blade+spray%3A+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li>
</ol>

Os autores gostariam de reconhecer milliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por fornecer dispositivos SPME e Thermo Fisher Scientific para acesso ao espectrômetro de massa Q-Exactive Focus Orbitrap.

A avaliação da qualidade dos órgãos continua sendo um grande desafio para os médicos, que devem tomar decisões rápidas e informadas sobre se um determinado órgão é viável para transplante ou se deve ser descartado. Múltiplos fatores, como idade do doador, duração da isquemia e infecções e processos inflamatórios, podem afetar o desfecho do enxerto a longo prazo. Embora diversos métodos tenham sido desenvolvidos até o momento para diagnosticar a função de aloenxerto renal, a inspeção histopatológica continua sendo o padrão-ouro nessa matéria3,4,12. Embora o procedimento de biópsia possa produzir informações significativas sobre doenças de doadores pré-existentes e alterações vasculares, não está livre de falhas. Os erros amostrais associados à variabilidade do interobservador e à amostragem de glomeruli insuficiente para informações abrangentes sobre a função do órgão permanecem preocupações típicas a esse respeito. Além disso, a preparação do espécime traz algumas questões como uma avaliação incompleta do enxerto em caso de seções congeladas e extensão do tempo de procedimento para secção de parafina. No entanto, o risco aumentado de hemorragia, que pode aparecer agudamente como hematuria microscópica ou bruta, é a principal complicação de risco de vida associada ao procedimento de biópsia. Por essa razão, o número de biópsias permitidas é estritamente limitado nos procedimentos de transplante, fator que dificulta a captura de mudanças dinâmicas e análises de séries temporativas através deste método12,,13,,14. Os benefícios de uma análise histológica devem ser ponderados em relação aos riscos associados à metodologia. O valor dos achados histológicos é indiscutível, mas não explicam os mecanismos moleculares das aberrações.
Metabolômica e lipidomics são os domínios mais jovens da família científica "-omics". O conjunto completo de metabólitos e lipílitos humanos de baixa molecular (<1.200 Da) conectados dentro de uma rede metabólica é definido como um metabolome humano. O genoma permanece relativamente constante ao longo de sua vida, com pequenas modificações causadas por mutações que ocorrem raramente. O metabolome é o produto da expressão genética, que é altamente sensível a mudanças em todos os processos biológicos, bem como fatores ambientais. A natureza dinâmica dos metabólitos e lipídios torna-os indicadores perfeitos da condição atual do órgão7,,8,,15,16. O método SPME proposto no protocolo acima mencionado permite a detecção de alterações ocorridas no órgão durante sua preservação, desde a remoção do órgão do corpo do doador até a revascularização no receptor. O pequeno diâmetro da sonda (~200 μm) proporciona invasividade mínima e permite várias amostras do mesmo órgão sem causar qualquer dano ao tecido. A realização de estudos utilizando rim, como órgão mais frequentemente transplantado, permite uma melhor compreensão e caracterização das vias metabólicas responsáveis pela diminuição da qualidade e função dos enxertos. A possibilidade de monitorar modificações ao longo do tempo certamente é uma vantagem importante da técnica em comparação com métodos invasivos convencionais, como a biópsia. A análise apresentada atualmente identificou concentrações alteradas de vários grupos de lipídios e metabólitos, especialmente de aminoácidos essenciais, purinas, nucleosídeos de purina e glicerofosfolipídios. Esses resultados são consistentes com os relatórios anteriores de análise tecidual5,,6,17,,18,19,20. Até o momento, a maioria dos relatórios científicos utilizando metabolômica ou lipidomífica para explicar processos que induzem complicações após transplante ou isquemia/lesão por reperfusão (IRI) foram limitados à análise dos fenômenos biofluidos21,,22,,23.
Cada aplicação clínica requer otimização do protocolo amostral para garantir que o desempenho do método analítico atenda aos critérios esperados. Nesse sentido, o benefício da utilização do SPME é a possibilidade de ajuste de condições para diversos projetos experimentais. A variedade de fases de extração acessíveis fornece um amplo espectro de metabólitos extraídos com polaridades diversificadas. Ao mesmo tempo, isso pode ser considerado como uma limitação do método devido ao fato de que cada sorbent fornece seletividade para características específicas e não extrai todos os compostos presentes na matriz amostral. Deve-se notar que os revestimentos SPME extraem apenas através de moléculas livres, e simplesmente não interagem com uma fração vinculada do analito. A biocompatibilidade dos revestimentos não introduz toxicidade ao tecido ao mesmo tempo em que restringe a extração de moléculas grandes, como proteínas; como consequência, os processos enzimáticos já são inibidos na fase de coleta de amostras e a presença de artefatos é minimizada, o que é uma grande vantagem sobre métodos alternativos de amostragem. O comprimento do revestimento influencia a eficiência da extração (ou seja, o comprimento do revestimento designa a área da superfície e o volume da fase de extração); assim, revestimentos mais longos produzem recuperações mais altas. Por outro lado, revestimentos mais curtos permitem maior resolução espacial. Para resultados confiáveis, é crucial submergir a sonda na mesma profundidade do córtex renal. A inserção muito profunda causa o risco de entrar na medula renal. O tempo de extração também é proporcional à eficiência de extração. Portanto, a seleção do tempo ideal de extração é um dos passos mais críticos no desenvolvimento do método SPME. A precisão da medição do tempo proporciona a maior repetibilidade. Em aplicações biológicas como a discutida, há sempre um compromisso entre a sensibilidade e a repetibilidade do protocolo analítico e as restrições do procedimento médico. Embora a extração do equilíbrio forneça a maior sensibilidade, por razões de segurança, as condições de pré-equilíbrio são frequentemente utilizadas em tais aplicações, já que o tempo de extração não deve afetar a duração total da cirurgia. A eficiência da desorção é determinada pelo tempo do processo e pela composição do solvente de desorção, que deve ser compatível com a fase móvel utilizada para separação cromatográfica9,,10,,11.
Um dos principais requisitos para instrumentação diagnóstica utilizado para avaliações intracirúrgica é o tempo de análise. As tentativas atuais estão sendo feitas para desenvolver uma ferramenta rápida para extração in vivo SPME acoplada diretamente a um espectrômetro de massa através de interface aberta microfluida (MOI)24 ou spray de lâmina revestida (CBS)25. Tais abordagens permitiriam a divulgação de resultados analíticos em tempo real ou próximo. O uso desses métodos para análises pré-intervenção de perfis metabólicos e lipidómicos poderia potencializar o processo de tomada de decisão durante os procedimentos de transplante, possibilitando a melhor abordagem personalizada possível e resposta rápida em caso de falência de órgãos.
Como resumo, é supor que o protocolo proposto permitirá a obtenção de perfis metabólicos e lipidómicos completos de enxertos renais, o que, por sua vez, proporcionaria uma avaliação abrangente da qualidade dos órgãos e da caracterização dos processos responsáveis pela lesão isquemia-reperfusão. A novidade do projeto inclui a utilização da microextração em fase sólida (SPME), oferecendo baixa amostragem invasiva de sistemas vivos, em combinação com uma das tecnologias mais inovadoras disponíveis para metabolômica e análise lipidóica (por exemplo, o espectrômetro de massa de alta resolução orbitrap). O SPME combina coleta, extração e sacieçação de metabólitos em uma etapa, tornando-a uma ferramenta perfeita para análise rápida. Espera-se que este protocolo ajude a responder perguntas relacionadas às condições pré-transplante do rim responsáveis pela demora na função do órgão ou suas disfunções após o transplante, bem como como o protocolo de preservação do enxerto influencia a bioquímica do órgão. Tal conhecimento não só teria impacto significativo na prevenção de possíveis complicações relacionadas ao transplante, mas poderia ajudar a melhorar os protocolos atuais de preservação do enxerto, minimizando a perda de tecido transplantado viável, bem como a perda de vidas. A solução proposta abrirá as portas para investigações posteriores neste campo, incluindo a validação de potenciais biomarcadores específicos e a melhoria dos desfechos terapêuticos em transplantologia.

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

De acordo com a Rede de Captação e Transplante de Órgãos dos Estados Unidos, havia 94.756 pacientes à espera de transplantes renais nos EUA em 2019; enquanto na Europa em 2018, esse número foi de 10.791. A cada dez minutos, alguém é adicionado à lista nacional de espera de transplante nos EUA, e estima-se que 20 pessoas morrem todos os dias à espera de um transplante1,,2. O transplante de rim é um tratamento que salva vidas para um grande número de pessoas que sofrem com disfunção renal em estágio terminal em todo o mundo. O procedimento está associado ao aumento da taxa de sobrevivência e maior qualidade de vida quando comparado à diálise convencional.
No entanto, o transplante enfrenta muitos problemas sérios, como a escassez de órgãos ou a falta de ferramentas eficazes para avaliação da qualidade dos órgãos. Os protocolos padrão limitam-se à inspeção de aparência macroscópica ou à biópsia invasiva de tecidos, que não fornecem informações abrangentes sobre a qualidade do enxerto. Embora uma avaliação visual permita a identificação de tumores visíveis ao olho, anormalidades anatômicas ou danos extensos aos enxertos, essa abordagem é muito subjetiva, variando em sua eficácia de acordo com a experiência dos observadores. A biópsia, por outro lado, pode fornecer informações valiosas sobre distúrbios renais pré-existentes e, portanto, é considerada um método de valor objetivo e evidenciado na determinação dos desfechos do enxerto. No entanto, o procedimento de biópsia não está livre de falhas; há o risco de complicações potenciais, como sangramento e são necessárias 4-5 horas adicionais de preparação amostral, o que prolonga significativamente o tempo isquêmico frio. Portanto, especialmente na Europa, o uso da análise direta de tecidos limita-se a critérios ampliados doadores (ECD) e doadores após morte circulatória (DCD)3,4.
Metabolômica e lipidomia têm sido recentemente reconhecidas como abordagens promissoras para obter uma melhor compreensão das mudanças nas vias bioquímicas que ocorrem durante a preservação dos órgãos. O perfil metabolômico e lipidômico permite o monitoramento das respostas imediatas do sistema a mudanças ambientais repentinas relacionadas à remoção de órgãos com consequências subsequentes: isquemia, estresse oxidativo ou respostas inflamatórias5,,6,,7,,8. O rim é um órgão que está em grande parte associado a processos metabólicos, portanto, medidas de metabólitos e concentrações lipídicas podem permitir a identificação de biomarcadores de qualidade potencial de órgãos e permitir melhores previsões do desfecho do enxerto.
Dadas as complicações e limitações acima associadas aos métodos atuais de avaliação da qualidade dos órgãos, é necessária uma solução diagnóstica menos invasiva para uma avaliação rápida e complexa da qualidade dos órgãos. A microextração de fase sólida (SPME) cumpre esses requisitos como um método analítico minimamente invasivo que permite a cobertura de um amplo espectro de metabólitos e lipídios. A técnica baseia-se na inserção de uma fina (~200 μm), biocompatível, sonda de liga de titânio-níquel coberta com uma fase de extração seletiva no órgão examinado por um curto período de tempo. Ressalta-se que o SPME previne a extração de proteínas e, portanto, permite a inibição do metabolismo já na fase de coleta de amostras, o que é uma vantagem significativa sobre métodos alternativos. Além disso, a miniaturização do dispositivo permite a execução de análises repetitivas e simultâneas de poucas estruturas do órgão9,,10,,11.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>5330010050</td><td>Aditivo de fase móvel</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Alchem</td><td>696-34967-4X2.5L</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>solvente Acetato de amônio</td><td>Merck</td><td>5330040050</td><td>Aditivo de fase móvel</td></tr><tr><td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010</td><td>Misturador de vórtice</td></tr><tr><td>Caps</td><td>Perlan Technologies</td><td>5183-2076</td><td>Azul scrw tp, pré-fenda PTFE/Si spta, 100PK</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>1024441000</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HS F5 Cartucho Supelguard, 3 &mu; m, L &vezes; ID 2 cm e vezes; Coluna</td><td>de proteção para HPLC</td><td>Merck</td><td>567570-U</td> de 2,1 mm</tr><tr><td>Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 &mu; m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>HPLC coluna</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Alchem</td><td>497-94318-50ML</td><td>Aditivo de fase móvel</td></tr><tr><td>Frascos de vidro</td><td>Perlan Technologies</td><td>5182-0714</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu; m, 200A, 100 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>Coluna HPLC</td></tr><tr><td>Cartucho HILIC SecurityGuard, 3 &mu; m, 4 x 2,0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-AJ0-8328</td><td>Coluna de proteção para HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Alchem</td><td>231-AL03262500</td><td>Solvente para HPLC</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Alchem</td><td>696-34966-4X2.5L</td><td>Solvente para HPLC</td></tr><tr><td>Água nanopura</td><td>Solvente para</td><td>HPLC</td><td>Merck 1037281002</td></tr><tr><td>Q Exactive Focus híbrido quadrupolo-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive Focus</td><td>Mass Espectrômetro</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro; m, 100 & 100 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>coluna SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1504360001</td><td>coluna de proteção HPLC</td></tr><tr><td>SPME LC sondas, modo misto</td><td>Supelco</td><td>protótipo de fibras Sistemas</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>UltiMate 3000</td><td>Sistema HPLC</td></tr><tr><td>Inserções de frasco (desativado)</td><td>Perlan Technologies</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5&mu; m 2.1x75mm</td><td>Coluna</td><td>de HPLC</td><td>186005644</td></tr><tr><td>Waters XSelect CSH C18 VanGuard Cartucho 3.5&mu; m, coluna</td> do <td>protetor da HPLC</td> <td>da 186007811 das águas</td><td></td> de 2.1x5mm</tr></tbody></table>

usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

O transplante de rim é um tratamento que salva vidas para um grande número de pessoas com disfunção renal em estágio terminal em todo o mundo. O procedimento está associado ao aumento da taxa de sobrevivência e maior qualidade de vida do paciente quando comparado à diálise convencional. Lamentavelmente, a transplantologia sofre da falta de métodos confiáveis para avaliação da qualidade dos órgãos. As técnicas de diagnóstico padrão limitam-se à inspeção de aparência macroscópica ou à biópsia invasiva do tecido, que não fornecem informações abrangentes sobre o enxerto. O protocolo proposto visa introduzir a microextração de fase sólida (SPME) como método analítico ideal para metabolômica abrangente e análise lipidódica de todos os compostos moleculares baixos presentes nos rins alocados para transplante. O pequeno tamanho da sonda SPME permite o desempenho de uma biópsia química, que permite a extração de metabólitos diretamente do órgão sem qualquer coleta de tecido. A invasividade mínima do método permite a execução de múltiplas análises ao longo do tempo: diretamente após a colheita de órgãos, durante sua preservação, e imediatamente após a revascularização no corpo do receptor. Acredita-se que a combinação deste novo método amostral com um espectrômetro de massa de alta resolução permitirá a discriminação de um conjunto de compostos característicos que poderiam servir como marcadores biológicos da qualidade do enxerto e indicadores de possível desenvolvimento de disfunção de órgãos.

A coleta de amostras foi realizada de acordo com o método SPME descrito acima, utilizando sondas revestidas com uma fase de extração de modo misto de 7 mm. A amostragem foi realizada diretamente do tecido do enxerto (in vivo antes do transplante), ex vivo na câmara renal após 1h, 3h, 5h e 7h de perfusão, e in vivo após a revascularização no receptor. Foram realizadas análises metabólicas e lipidômicas não-diretas com o uso de cromatografia líquida (RP, HILIC) aliada à espectrometria de massa de alta resolução, com o analisador de massa definido no modo de ionização positiva. Para avaliar a qualidade dos dados e obter insights gerais sobre os resultados, os dados foram submetidos à análise de componentes principais (PCA). Como mostrado na Figura 1,as amostras de QC formaram um cluster apertado, confirmando a qualidade das análises. Os grupos estudados apresentam uma separação relativamente boa, permitindo a visualização de diferenças nos perfis metabólico e lipidómico antes e depois do transplante, bem como durante a perfusão de órgãos(Figura 2). A amostragem spme permite o perfil metabólico do órgão ao longo do tempo. Parcelas de batizadores de caixa de metabólitos selecionados servem para exemplificar alterações em níveis metabólitos ao longo do experimento(Figura 3). O amplo espectro de características extraídas separadas nas colunas RP e HILIC é mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> Figura 1: Análise dos componentes principais mostrando agrupamento de amostras de controle de qualidade para análises metabólicas de fase invertida (A), HILIC (B) e lipidómica (C), HILIC (D). O controle de qualidade é necessário em análises não-acompanhadas para monitorar evenes possíveis alterações induzidas pela instabilidade instrumental. Um conjunto apertado de amostras de QC garante que todas as alterações observadas sejam de origem biológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> Figura 2: Análise dos componentes principais que mostram diferenças metabólicas (A) e lipidómicas (B) entre determinados pontos amostrais. O perfil não direcionado do rim com SPME-LC-HRMS permite observar diferenças bioquímicas nos órgãos nas etapas subsequentes de sua preservação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> Figura 3: Parcelas de box-whisker de compostos selecionados mostrando alterações em metabólitos (A, B) e lipídios (C, D) durante o período de peritransplante. Após a seleção e identificação de compostos discriminatórios, as parcelas de batedores de caixa permitem monitorar as mudanças nos níveis desses compostos nas etapas subsequentes do protocolo e comparar os níveis de metabólitos em órgãos submetidos a diferentes protocolos de preservação ou colhidos de diferentes doadores, por exemplo, doadores ou doadores de batimentos cardíacos após a morte cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> Figura 4: Mapa de íons (m/z versus tempo de retenção) de características obtidas pela análise LC-MS com (A) fase invertida e (B) separação HILIC. O enredo permite estimar o número global de recursos obtidos com o protocolo proposto (da extração à detecção) e avaliar a cobertura analito com base na polaridade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo apresenta a utilização da abordagem da biópsia química seguida de análise metabolômica e lipidômica abrangente para avaliação da qualidade dos enxertos renais alocados para transplante.

Usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

A biópsia química é uma nova solução diagnóstica no transplante de órgãos para avaliação rápida e complexa da qualidade do enxerto. Atualmente, não há outros métodos invasivos baixos disponíveis que permitam tal análise. A principal vantagem dessa técnica é a possibilidade de monitorar modificações de tecidos de enxerto ao longo do tempo de preservação devido à simplicidade e baixa invasividade das sondas SPME.O pequeno diâmetro da sonda e uma grande variedade de revestimentos biocompatíveis tornam este método adequado para análise de órgãos transplantados e aplicável em pesquisas médicas como a análise de tumores. Ao tentar esta técnica pela primeira vez preste atenção aos detalhes e ao tempo de etapas específicas, pois pequenos erros podem influenciar fortemente os resultados. O protocolo é simples, mas é mais fácil de entender e executar após demonstração visual.Comece preparando uma mistura pré-condicionamento composta de um a um metanol e água. Pipeta um mililitro da solução em cada dois frascos de vidro mililitro e colocar uma sonda em cada frasco. Agitar os frascos em um agitador de vórtice a 1200 RPM por uma hora.Em seguida, enxágüe as sondas com água de grau LCMS e esterilize-as de acordo com o protocolo de esterilização cirúrgica padrão ou no departamento de processamento estéril. Quando estiver pronto para extrair a amostra, abra a embalagem estéril e insira duas sondas diretamente no córtex renal por 10 minutos por ponto de tempo, certificando-se de que toda a extensão do revestimento esteja coberta pela matriz tecidual. Certifique-se de acompanhar o tempo de amostragem de cada sonda.Retire a sonda retirando-a do tecido e enxágue imediatamente o revestimento com água de grau LCMS para remover qualquer sangue restante, certificando-se de enxaguar para longe do local cirúrgico. Para transportar as sondas, coloque-as em frascos separados e feche-os. Em seguida, coloque os frascos em uma caixa cheia de gelo seco ou nitrogênio líquido.Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos ou proceda imediatamente com desordenado. Prepare uma solução de desorção composta de acetonitrila e água para análise metabolômica e outra composta de isopropanol e metanol para análise lipidômica. Adicione 100 microliters da solução para inserir nos dois frascos rotulados mililitros e coloque uma sonda em cada frasco agitar os frascos a 1200 RPM por duas horas e, em seguida, remova as sondas dos frascos e prossiga com a análise LCMS.A cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa de alta resolução foi utilizada para realizar análises metabolômicas e lipómicas não-diretas. Os dados foram submetidos à análise dos componentes principais para avaliar a qualidade entretendo insights gerais sobre os resultados. As amostras de controle de qualidade formaram um cluster apertado confirmando a qualidade da análise.Os grupos estudados apresentaram separação relativamente boa, permitindo a visualização de diferenças nos perfis metabólicos e lipidómicos antes e depois do transplante, bem como durante a perfusão de órgãos. Um amplo espectro de características extraídas foi separado em colunas de fase invertida e cromatografia líquida. Alterações e níveis metabólicos ao longo do experimento foram demonstrados com parcelas de batalhões de caixa dos metabólitos selecionados.Ao realizar este procedimento, tenha em mente a heterogeneidade dos órgãos. Coloque a sonda no local desejado mantenha o tempo de amostragem idêntico em todos os pontos de tempo e fixe a fibra corretamente após a amostragem. Os biomarcadores descobertos com SPME podem ser quantificados usando este método de extração acoplado a MSMS, LCMS ou outra instrumentação analítica.Além disso, como nenhuma amostra é consumida, pode-se realizar análises de rotina, como biópsia. O método pode ser adaptado para outras metabolômicas teciduais e análise lipidóica sem necessidade de pré-tratamento amostral. Para metabólitos específicos.Outros revestimentos podem ser usados para aumentar a seletividade e sensibilidade da redação.

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Research

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