Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Este método fornece uma abordagem ideal para estudar a cicatrização de feridas coloniais e as alterações moleculares e histólógicas que ocorrem após a lesão. Este método também pode lançar luz sobre a patogênese do IBD. A principal vantagem desta técnica é controlar precisamente a localização da lesão e o tempo do processo de cicatrização da ferida.

Indivíduos que realizam este método pela primeira vez podem ter dificuldade em inserir o colonoscópe no cólon do camundongo e criar feridas consistentes. Praticar repetidamente essas técnicas deve superar essas questões. Dadas as múltiplas etapas coordenadas e nuances envolvidas com este procedimento, a demonstração visual deste método é fundamental.

Antes de iniciar o procedimento, insira um endoscópio de furo rígido de 1,9 milímetros em uma baia endoscópio. E conecte o endoscópio montado à fonte de luz e ao dispositivo de imagem de vídeo de acordo com as instruções do fabricante. Use a tubulação fornecida para fixar a bomba de ar à válvula de gás no lado esquerdo da baia ao lado do canal de trabalho.

Certifique-se de que o canal de trabalho está em posição aberta e insira três fórceps de biópsia francesa através do canal de trabalho. Avance os fórceps até o fim da bainha sem sair da bainha. Em seguida, coloque o mouse anestesiado em uma plataforma de encenação endoscópica em seu lado ventral e confirme o nível apropriado de sedação por falta de resposta ao reflexo do pedal.

Depois de aplicar pomada ocular, encha uma seringa de três mililitros com uma agulha de gavage de rato anexada com PBS de temperatura ambiente. E insira a agulha aproximadamente um centímetro no ânus do rato. Infundir suavemente com PBS até que o material fecal tenha sido limpo.

Várias pelotas fecais devem sair do rato junto com o PBS que foi infundido. Insira o endoscópio montado 0,5 centímetros no ânus e avance os fórceps da biópsia no lúmen limpo do reto até que as mandíbulas completas dos fórceps estejam além do fim da bainha. Gire os fórceps 90 graus para que as mandíbulas se abram em uma orientação leste-oeste e abra as pontas e avancem os fórceps de aproximadamente um centímetro, fechando e retraindo os fórceps em um movimento suave e rápido para colher a biópsia.

Para evitar a insuladação total do cólon durante a realização da biópsia, deixe o lado direito da válvula de gás aberto. Imediatamente após a biópsia, pressione o pedal do pé ligado ao dispositivo de gravação de colonoscópe para iniciar a gravação de vídeo. E pressione firmemente um dedo indicador contra o lado direito da válvula de gás para cobrir completamente a abertura, forçando o ar para dentro do endoscópio e, assim, para dentro do cólon.

Retire os fórceps para fora da bainha e para o lúmen retal enquanto estiver na posição fechada. E coloque os fórceps contra a parede retal imediatamente acima da ferida até que a base das mandíbulas esteja alinhada com a borda superior do campo de visão. Continue insusentando o cólon até que uma visão clara da ferida possa ser observada.

Para obter as melhores medidas do leito da ferida, seja paciente e coloque o colonoscócico em um ângulo preciso para que você obtenha sua melhor imagem do leito da ferida. Abra o vídeo em um programa de software apropriado e avance o vídeo para um quadro mostrando um ponto no tempo em que a cama da ferida pode ser facilmente visualizada. E em que os fórceps fechados estão acima do leito da ferida e contra a parede retal, e a parede está esticada.

Em cada ponto de tempo, obtenha um instantâneo deste quadro e codifique o nome do arquivo para garantir que as medidas dos leitos de ferida sejam realizadas de forma cega. Para quantificar o tamanho do leito da ferida, abra as imagens no ImageJ e use a ferramenta de seleções mão livre para desenhar um perímetro ao redor da ferida. Em Analisar, selecione Medir.

E o valor dessa medição será preenchido automaticamente na janela Resultados. Quando todas as medidas tiverem sido adquiridas, calcule o tamanho da ferida nos dias subsequentes em relação ao tamanho do dia zero em uma planilha. No ponto final experimental apropriado, abra as camadas musculares da pele e do abdômen para expor a cavidade corporal do animal experimental e colocar fórceps fechados sob o cólon.

Levante suavemente o cólon para liberá-lo da mesenteria subjacente e cortar o tecido no seu ponto médio e no ânus para recolhê-lo do rato. Use uma seringa de 20 mililitros cheia de PBS gelada e equipada com uma agulha de gavage de rato para liberar o conteúdo fecal. E coloque o cólon limpo em um pedaço de papel filtro.

Abra o cólon longitudinalmente, tomando cuidado para que o lado mesentérico esteja de cara para baixo contra o papel filtro. E use uma pipeta Pasteur para cobrir a mucosa com 0,2% de azul metileno. Após alguns segundos, drene o excesso de mancha e veja o cólon sob um microscópio dissecando para localizar o leito da ferida.

Use uma tesoura micro iris de quatro polegadas para cortar ao redor da borda da cama, tomando cuidado para não cortar na camada muscular. E use pinças de ponta fina para transferir o tecido dissecado para um tubo para congelamento e ou armazenamento de estalos. No ponto final experimental apropriado, abra o cólon colhido longitudinalmente em um pedaço de papel filtro, lado mesenérico para baixo.

Cubra suavemente o tecido com sua fixação de escolha. Cubra o tecido com parafilm em um recipiente selado por 4 a 6 horas antes do armazenamento em 70% de etanol. No dia do processamento, retire o parafilme e adicione 0,2% de azul de metileno ao tecido, como demonstrado.

Depois de drenar o excesso de mancha, coloque o tecido sob um microscópio dissecando para localizar o leito da ferida. Usando um bisturi com uma lâmina número 10, corte diretamente pelo centro da cama da ferida e continue cortando o restante do cólon em linha reta, de tal forma que o cólon seja cortado ao meio do comprimento. Para a crioseção, incorpore as peças de cólon de tal forma que o lado que foi cortado pelo bisturi esteja de cara para baixo em um molde de base meio cheio de meio de congelamento tecidual.

Fixar o tecido no lugar com pinças finas e colocar o molde base em uma placa de metal ou folha de alumínio espessa em cima de gelo seco para endurecer o meio de congelamento. Uma vez que a porção inferior do meio esteja congelada, encha o volume restante do molde base com meio de congelamento à temperatura ambiente. E devolva o molde ao gelo seco até que todo o bloco de tecido esteja congelado.

Em seguida, transfira o molde para um congelador de 80 graus Celsius até a secção. Aqui, são mostradas imagens representativas de visões aceitáveis do leito da ferida para uma quantificação precisa do tamanho do leito da ferida e da taxa de fechamento da ferida. Nesta visão ex-vivo de um leito de ferida, podem ser observados indicadores do perímetro do leito da ferida e onde cortar o tecido para permitir a visualização do leito da ferida após a secção.

Nesta imagem representativa, uma seção de mancha de H e E de uma cama de ferida pode ser claramente observada. É importante adquirir imagens instantâneas do leito de ferida em todos os pontos de tempo para garantir uma avaliação precisa da taxa de cicatrização da ferida. Após a biópsia do beliscão, diferentes agentes de interesse podem ser injetados no leito da ferida para testar seus efeitos na taxa de cicatrização da ferida.